I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.
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Articolo metodologico
Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primaria caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA, che porta all'insufficienza renale allo stadio terminale. Negli ultimi anni, il coinvolgimento dei microRNA (miRNA) è stato riportato nella patogenesi della nefropatia da IgA. Tuttavia, non esiste un metodo stabilito per profilare i miRNA nella nefropatia da IgA utilizzando modelli di piccoli animali. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per analizzare i miRNA nel rene di un modello murino IgA (topo HIGA). L'obiettivo di questo protocollo è rilevare i livelli di espressione alterati dei miRNA nei reni dei topi HIGA rispetto ai livelli nei reni dei topi di controllo. In breve, questo metodo consiste in quattro passaggi: 1) ottenere campioni di rene dai topi HIGA; 2) purificazione dell'RNA totale da campioni renali; 3) sintetizzare DNA complementare dall'RNA totale; e 4) reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa (qRT-PCR) dei miRNA. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato con successo i livelli di espressione di diversi miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nei reni dei topi HIGA. Questo nuovo metodo può essere applicato ad altri studi che profilano i miRNA nella nefropatia da IgA.
Introduzione
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primitiva caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA nella regione mesangiale glomerulare renale 1,2. È la più comune delle glomerulonefriti primarie e porta all'insufficienza renale allo stadio terminale nel 20%-40% dei pazienti2. La causa è ancora sconosciuta, ma è stata implicata un'infezione persistente della mucosa 1,3. Corticosteroidi, immunosoppressori e inibitori del sistema renina-angiotensina sono stati proposti come metodi terapeutici
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Protocollo
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico animale della Jichi Medical University e sono conformi alle linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio.
1. Ottenere campioni di rene da topi HIGA
NOTA: I topi HIGA mostrano un fenotipo stabile di nefropatia da IgA dopo 25 settimane di età 8,9,10,11. I topi Balb/c devono essere selezionati come gruppo di contr....
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Risultati
Abbiamo studiato i livelli di espressione dei miRNA nei reni dei topi HIGA (n = 10). Questo risultato è stato ottenuto completamente sulla base del protocollo descritto. I reni dei topi Balb/c sono stati selezionati come controllo (n=10). In entrambi i gruppi, sono state selezionate 25 settimane di età. Solo topi HIGA femmina erano disponibili dal fornitore. I livelli di espressione di tre miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p; Figura 1) sono stati rilevati, che erano stati precedenteme.......
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Discussione
Siamo stati in grado di misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino di nefropatia da IgA (topi HIGA) utilizzando questo nuovo metodo. La nefropatia da IgA è una malattia inspiegabile che necessita di ulteriori ricerche per chiarirne l'eziologia e gli obiettivi terapeutici 1,3. Tuttavia, ottenere campioni di rene umano è altamente invasivo. Questa nuova tecnica è vantaggiosa in quanto consente lo studio della nefropatia da IgA utilizz.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Sarah Williams, PhD, di Edanz Group (www.edanzediting.com) per aver curato una bozza di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BALB/cCrSlc (25 settimane, femmina) | Giappone SLC, Inc. | none | Mouse per il controllo |
| HIGA/NscSlc (25 settimane, femmina) | Japan SLC, Inc. | nessuno | Modello murino di nefropatia |
| IgA MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti per qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | Piastra di reazione a 96 pozzetti |
| Pellicola adesiva ottica MicroAmp Thermo | Fisher Scientific | 4311971 pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti | |
| kit miScript II RT | Qiagen | 218161 | Kit sperimentale per la sintesi di cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Kit sperimentale per l'estrazione dell'RNA totale |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | primer specifico per miRNA |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | primer specifico per miRNA |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | primer specifico |
| per miRNA miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | primer specifico per miRNA |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 Kit sperimentale per PCR in tempo reale | |
| QIA trituratore | Qiagen | 79654 | colonna rotante per triturazione di biopolimeri |
| QuantStudio 12K Flex Flex Sistema di PCR in tempo reale | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | strumento per PCR in tempo reale |
| QuantStudio 12K Flex Software versione 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | per strumenti PCR in tempo reale |
| Takara biomasher standard | Omogeneizzatore di silicio | Takara Bio | 9790B |
Riferimenti
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A.
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Ristampe e permessi
