Questo articolo presenta un metodo per stabilire un modello infiammatorio cutaneo psoriasiforme in vitro a livello di trascrizione utilizzando una combinazione di cinque citochine (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) su linea cellulare HaCaT.
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Articolo metodologico
Definizione del profilo di trascrizione della psoriasi cutanea in vitro utilizzando cellule HaCaT stimolate con combinazione di citochine
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La psoriasi è una comune malattia infiammatoria cronica della pelle mediata dal sistema immunitario innato e adattativo, caratterizzata da proliferazione e differenziazione anomala dei cheratinociti epidermici e infiltrazione di cellule infiammatorie. I cheratinociti specifici della pelle sono partecipanti chiave nell'immunità innata, rispondono alle cellule immunitarie e alla stimolazione ambientale, svolgendo così un ruolo importante nell'immunopatogenesi della psoriasi. Qui, presentiamo un metodo per indurre l'infiammazione dei cheratinociti psoriasiformi a livello di trascrizione con la linea cellulare HaCaT utilizzando cinque combinazioni di citochine proinfiammatorie (combinazione M5), tra cui IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e oncostatina M. I risultati dimostrano che le cellule HaCaT indotte dalla combinazione M5 hanno mostrato un aumento dei livelli di peptidi antimicrobici (BD2, S100A7, S100A8 e S100A9), chemochine e citochine (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 e IL-18). I livelli di mRNA dei marcatori di differenziazione dei cheratinociti (Cheratina1, Cheratina10, Filaggrina e Loricrina) erano sottoregolati, il che era coerente con i dati del trascrittoma derivati dai cheratinociti simili alla psoriasi. Il metodo qui descritto, quindi, stabilisce un'infiammazione cutanea psoriasiforme in vitro a livello trascrizionale e contribuisce alla ricerca della patogenesi molecolare della psoriasi.
Introduzione
La psoriasi è una comune malattia infiammatoria cronica della pelle non contagiosa innescata da una risposta immunitaria disregolata, che colpisce i cheratinociti che formano prevalentemente l'epidermide1, caratterizzata da una moltiplicazione anormalmente rapida dei cheratinociti con ipercheratosi e paracheratosi. La psoriasi colpisce circa il 3% della popolazione selvatica mondiale2. Il carico di malattia è ulteriormente aumentato da diverse comorbidità, tra cui le malattie cardiovascolari e la sindrome metabolica causata dalla sindrome3.
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Protocollo
Eseguire i passaggi da 1 a 3 in condizioni sterili. Tutto il terreno di coltura conteneva 0,1 mg/mL di penicillina e streptomicina.
1. Preparazione delle cellule
- Seminare 1 x 106 cellule HaCaT in 10 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in una piastra di coltura cellulare da 100 mm. Incubare la piastra di coltura a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 2 giorni.
- Quando la coltura raggiunge circa l'80% di confluenza, rimuovere con cura il terreno dalla piastra di coltura e lavare le cellule con....
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Risultati
La stimolazione combinata M5 ha indotto la risposta infiammatoria delle cellule HaCaT.
Le cellule HaCaT sono state stimolate con o senza combinazione di citochine M5 per 24 ore. È stata valutata l'espressione dell'mRNA dei geni correlati alla psoriasi, che sono coinvolti nella regolazione delle chemochine immunitarie e infiammatorie e dei peptidi antimicrobici. Le chemochine neutrofile CXCL138, CXCL239, .......
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Discussione
Il metodo qui descritto è un metodo che utilizza la combinazione di cinque citochine (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) in una linea cellulare HaCaT per stabilire un profilo di infiammazione cutanea psoriasiforme in vitro a livello di trascrizione. Questo protocollo può essere adattato per lo studio del meccanismo dei geni nella patogenesi della psoriasi e per lo screening di farmaci terapeutici per la psoriasi. Recenti studi hanno dimostrato che la sovraespressione delle cellule T CD8 p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno segnalato alcun potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 e 81601462]
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM— Dulbecco's Modified Eagle | Medium Gibco | 11965092 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10100139C | |
| Cellule HaCaT | Cina Centro per la raccolta di tipi di GDC0106 | Meno di 15 generazioni | |
| IL-1 umanaβ Kit ELISA | Beyotime | PI305 | |
| Umano IL-6 Kit ELISA | Beyotime | PI330 | |
| Umano IL-8 Kit ELISA | Beyotime | PI640 | |
| IL-1 alfa | Human Prospec | CYT-253 | Proteina ricombinante |
| IL-17 Human | Prospec | CYT-250 | Proteina ricombinante |
| IL-22 Human | Prospec | CYT-328 | Proteina ricombinante |
| OSM Human | Prospec | CYT-231 | Proteina ricombinante |
| PBS | Gibco | 10010049 | pH 7.4 |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140163 | |
| Kit di reagenti PrimeScrip RT | TAKARA | RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | |
| TNF alpha Human | Prospec | CYT-223 | |
| Reagente TRIzo proteina | Invitrogen | 15596018 | |
| tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Gibco | 25200072 |
Riferimenti
- Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
- Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
- Boehncke, W. -H., Schön, M. P.
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Ristampe e permessi
