Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Bindu Konda; Apoorva Mulay; Changfu Yao; Stephen Beil; Edo Israely; Barry  R. Stripp

doi:10.3791/61541

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Articolo metodologico

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

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DOI:

10.3791/61541

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21 luglio 2020

Bindu Konda¹ , Apoorva Mulay¹ , Changfu Yao¹ , Stephen Beil¹ , Edo Israely¹ , Barry R. Stripp¹

¹Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la dissociazione dei tessuti e gli approcci di frazionamento cellulare che consentono l'arricchimento di cellule epiteliali vitali dalle regioni prossimali e distali del polmone umano. Qui questi approcci sono applicati per l'analisi funzionale di cellule progenitrici epiteliali polmonari attraverso l'uso di modelli di coltura di organoidi 3D.

Abstract

I modelli organoidi epiteliali servono come strumenti preziosi per studiare la biologia di base di un sistema di organi e per la modellazione delle malattie. Se coltivate come organoidi, le cellule progenitrici epiteliali possono auto-rinnovarsi e generare progenie differenziante che mostra funzioni cellulari simili a quelle delle loro controparti in vivo . Qui descriviamo un protocollo passo-passo per isolare i progenitori specifici della regione dal polmone umano e generare colture organoidi 3D come strumento sperimentale e di convalida. Definiamo le regioni prossimali e distali del polmone con l'obiettivo di isolare le cellule progenitrici specifiche della regione. Abbiamo utilizzato una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica per isolare le cellule totali dal polmone e dalla trachea. Specifiche cellule progenitrici sono state quindi frazionate dalle cellule di origine prossimale o distale utilizzando lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS) basato su marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR per lo smistamento delle cellule basali e HTII-280 per lo smistamento delle cellule alveolari di tipo II. I progenitori basali o alveolari isolati di tipo II sono stati utilizzati per generare colture organoidi 3D. Sia i progenitori distali che quelli prossimali formavano organoidi con un'efficienza di formazione della colonia del 9-13% nella regione distale e del 7-10% nella regione prossimale quando placcati 5000 cellule / pozzetto il giorno 30. Gli organoidi distali hanno mantenuto le cellule alveolari di tipo II HTII-280⁺ in coltura, mentre gli organoidi prossimali si sono differenziati in cellule ciliate e secretorie entro il giorno 30. Queste colture organoidiche 3D possono essere utilizzate come strumento sperimentale per lo studio della biologia cellulare dell'epitelio polmonare e delle interazioni mesenchimali epiteliali, nonché per lo sviluppo e la convalida di strategie terapeutiche mirate alla disfunzione epiteliale in una malattia.

Introduzione

Gli spazi aerei del sistema respiratorio umano possono essere ampiamente suddivisi in zone conduttrici e respiratorie che mediano rispettivamente il trasporto di gas e il loro successivo scambio attraverso la barriera epiteliale-microvascolare. Le vie aeree conduttrici comprendono trachea, bronchi, bronchioli e bronchioli terminali, mentre gli spazi dell'aria respiratoria comprendono bronchioli respiratori, dotti alveolari e alveoli. Il rivestimento epiteliale di questi spazi aerei cambia nella composizione lungo l'asse prossima-distale per soddisfare i requisiti unici di ogni zona funzionalmente distinta. L'epitelio pseudostratificato delle vie aeree tracheo-bronchia....