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Articolo metodologico

Lo stress cronico sposta il comportamento di scelta correlato allo sforzo in un'attività di barriera del labirinto Y nei topi

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DOI:

10.3791/61548

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13 agosto 2020

 ,  , 
1Department of Psychology, Behavioral and Systems Neuroscience Area, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Neuroscience, Rutgers, The State University of New Jersey

In questo articolo

Sommario

Il compito di barriera Y-labirinto è un test di comportamento che esamina la motivazione a spendere sforzo per la ricompensa. Qui, discutiamo di testare più fattori di stress cronici ben convalidati tra cui corticosterone cronico e stress di sconfitta sociale con questo comportamento, così come il nuovo stress cronico non discriminatorio di sconfitta sociale (CNSDS), che è efficace nelle femmine.

Abstract

I disturbi dell'umore, compreso il disturbo depressivo maggiore, possono essere precipitati da stress cronico. Il compito di barriera Y-laze è un test di scelta legato allo sforzo che misura la motivazione a spendere sforzo e ottenere ricompensa. Nei topi, l'esposizione cronica allo stress influisce significativamente sulla motivazione a lavorare per una ricompensa di valore superiore quando una ricompensa di valore inferiore è liberamente disponibile rispetto ai topi non stressati. Qui descriviamo il paradigma cronico dell'amministrazione del corticosterone, che produce un cambiamento nella risposta sforzosa nel compito della barriera del labirinto Y. Nel compito del labirinto Y, un braccio contiene 4 pellet di cibo, mentre l'altro braccio contiene solo 2 pellet. Dopo che i topi imparano a selezionare il braccio ad alta ricompensa, le barriere con altezza progressivamente crescente vengono introdotte nel braccio ad alta ricompensa durante più sessioni di test. Sfortunatamente, la maggior parte dei paradigmi di stress cronico (tra cui corticosterone e sconfitta sociale) sono stati sviluppati nei topi maschi e sono meno efficaci nei topi femminili. Pertanto, discutiamo anche dello stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS), un paradigma di stress che abbiamo sviluppato che è efficace sia nei topi maschi che in quello femminile. Risultati ripetuti con più fattori di stress cronici distinti nei topi maschi e femmine combinati con un maggiore utilizzo di attività comportamentali traslazione rilevanti aiuterà a far progredire la comprensione di come lo stress cronico può precipitare disturbi dell'umore.

Introduzione

Disturbi dell'umore come la depressione e l'ansia sono altamente prevalenti nella società di oggi. Decenni di lavoro hanno costantemente cercato trattamenti migliorati e modelli di roditori rilevanti per studiare questi disturbi complessi1. Lo stress cronico è un fattore che contribuisce ai disturbi dell'umore come la depressione2. Pertanto, i paradigmi di stress cronico come lo stress cronico da sconfitta sociale (SDS) e la somministrazione cronica di corticosterone (CORT) sono stati sviluppati nei topi maschi e sono ora ampiamente utilizzati per valutare gli effetti neurobiologici e comportamentali dell'esposizione cronica allo stress. I test comportamentali più utilizzati per valutare gli effetti di stress cronico includono compiti associati al comportamento di evitamento, come il labirinto elevato più, il campo aperto e l'alimentazione soppressa novità, o con l'efficacia antidepressiva, come il test di nuoto forzato. Tuttavia, questi comportamenti nei roditori probabilmente mancano di volto e, cosa più importante, di validità predittiva e rilevanza trassletica per disturbi umani come la depressione.

Un paradigma di stress cronico popolare, stress lieve cronico imprevedibile (CUMS), è stato convalidato ampiamente utilizzando comportamenti come la preferenza di saccarosio3. CUMS riduce la preferenza per una soluzione di saccarosio dell'1% rispetto all'acqua ed è storicamente interpretato come comportamento correlato all'anedonia4,5. Tuttavia, questa riduzione della preferenza di saccarosio non è osservata negli esseri umani con disturbo depressivomaggiore 6,7. Inoltre, la preferenza di saccarosio non consente lo studio della motivazione della ricompensa sforzosa.

Recentemente, alcune ricerche hanno spostato l'attenzione su altri comportamenti associati alla motivazione e allaricompensa 8,9. Questi compiti hanno un promettente valore traslazione perché valutazioni del comportamento relativamente simili possono essere condotte sia negli esseri umani che nei roditori. Qui, descriviamo i paradigmi CORT e SDS e i loro effetti in un compito comportamentale barriera Y-labirinto che misura la motivazione a sforzo per la ricompensa. Discutiamo poi di un nuovo paradigma di stress cronico che abbiamo sviluppato, lo stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS), che è efficace sia nei topi maschi che in quello femminile.

La somministrazione cronica di corticosterone (CORT) è un paradigma progettato per imitare lo stress cronico senza esposizioni effettive allo stress. L'attivazione dell'asse ipotalamo-pituitario-surenale da parte dello stress si traduce nel rilascio endogeno dello steroide surrenale cortisolo negli esseri umani10,11,12 e corticosterone nei topi13,14. La consegna di corticosterone attraverso l'acqua potabile di topi maschi adulti per almeno 4 settimane comporta risposte comportamentali disadattative in attività di prevenzione come campo aperto, elevato più labirinto, e l'alimentazione soppressanovità 10,11,12,13,14,15,16. È interessante notare che CORT influisce anche sull'elaborazione delle ricompense nelle attivitàstrumentali 16,17,18,19. Il paradigma CORT qui descritto produce una concentrazione costante del siero inferiore a 100 ng/mL CORT, che è più di cinque volte inferiore a quella prodotta da un fattorino acuto come il nuoto forzato15. Pertanto, la somministrazione cronica di CORT è improbabile che causi ipercortisolemia. Mentre corT cronica è efficace solo nei topi maschi20, abbiamo recentemente dimostrato che produce un robusto cambiamento nella risposta sforzosa nel compito barriera Y-labirinto21. Per la nostra conoscenza, questo è stato uno dei primi studi per esaminare gli effetti dello stress cronico su un comportamento di scelta legato allo sforzo nei topi maschi21. Uno studio precedente ha dimostrato per la prima volta l'impatto dello stress di moderazione acuta sul processo decisionale basato sullo sforzo nei ratti22. Nei comportamenti di scelta legati allo sforzo, un animale sceglie di esercitare uno sforzo per una ricompensa di alto valore o accettare una ricompensa di valore inferiore che è più liberamente disponibile. Negli esseri umani, la spesa di sforzo per il compito di premi (EEfRT), è un gioco per computer sviluppato per essere analogo ai compiti di scelta legati allo sforzo neitopi 23. La depressione si traduce in risposte disadattative in EEfRT (diminuzione della probabilità di scegliere compiti difficili per premi di alto valore). Pertanto, i compiti di scelta relativi allo sforzo nei roditori sono particolarmente interessanti a causa della loro rilevanza traslazione.

Lo stress da sconfitta sociale cronica (SDS) è uno dei modelli di stress preclinico più ampiamente utilizzati nei topi maschi. Si tratta di un protocollo di 10 giorni in cui grandi, aggressivi maschi di allevamento in pensione CD-1 attaccano topi sperimentali, in genere C57BL/6J, in sessioni giornaliere 5 min24. Questo produce un fenotipo comportamentale disadattativo robusto in un sottoinsieme di topi sperimentali. Un test di interazione sociale viene utilizzato per stratificare i topi in popolazioni resilienti o suscettibili allo stress da sconfitta, e diversi studi hanno usato questa caratteristica unica della SDS per sondare i meccanismi del circuito molecolare e neurale alla base della dipendenza dallo stress e della suscettibilità. Qui descriviamo i dettagli del paradigma CORT e la sua implementazione per l'attività comportamentale barriera Y-labirinto. Discutiamo anche degli effetti SDS nell'attività di barriera del labirinto Y. Il compito di barriera del labirinto Y si basa sul compito barriera T-labirinto, che viene utilizzato principalmente nei ratti per misurare la motivazione a spendere sforzo per premi alti o bassi presenti nei due bracci del labirinto8,9,25. Questo compito è stato anche implementato per studiare la risposta sforzosa nei topi somministrati caffeina o dopamina antagonisti nei topi26. I roditori possono spendere maggiore sforzo salendo barriere di altezza progressiva aumentando in un braccio del labirinto per un valore di ricompensa più alto, in genere 4 pellet di ricompensa, o spendere significativamente meno sforzo nell'altro braccio del labirinto per ricevere solo 2 pellet ricompensa9. I paradigmi di sconfitta sociale di 10 giorni producono un robusto fenotipo maladaptivo nei topi suscettibili che dura circa 30 giorni, quindi abbiamo modificato il compito della barriera del labirinto Y per addestrare e testare più rapidamente gli animali al fine di completare tutti gli esperimenti entro questo periodo di 30 giorni24. Pertanto, qui dettagliamo anche un protocollo di attività comportamentale barriera Y-labirinto contenente sessioni di allenamento condensato e sessioni di test a barriera singola per misurare la motivazione a spendere sforzo per la ricompensa in topi esposti allo stress cronico.

Sfortunatamente, sia il corticosterone cronico che lo stress cronico della sconfitta sociale sono stati sviluppati nei topi maschi e sono meno efficaci nei topi femminili. Questo è altamente problematico come le donne sono più probabilità rispetto agli uomini per essere diagnosticati con disturbi dell'umore come la depressione1. Adattamenti intelligenti alla SDS hanno permesso l'uso nei topi femminili, ma richiedono interventi chirurgici difficili o noiosa raccolta delle urine26,27. Recentemente abbiamo descritto una semplice modifica al paradigma SDS, chiamata stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS). CNSDS consente una stratificazione suscettibile e resiliente di topi maschi e femminesperimentali 28. Sia i topi sensibili alle donne che i topi maschi esposti al CNSDS mostrano una maggiore evitamento delle braccia aperte nel labirinto elevato e del centro in campo aperto e mostrano una maggiore latenza da mangiare nell'alimentazione soppressa delle novità. CNSDS è anche più efficiente di altre modifiche a SDS, come entrambi i sessi sono combinati in sessioni di sconfitta. Ciò si traduce in un aumento della resa di topi sperimentali senza un aumento associato di tempo e fatica necessari per completare il protocollo. Pertanto, concludiamo questo manoscritto con una presentazione approfondita di questo paradigma di stress cronico recentemente sviluppato.

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Protocollo

Questi esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida niD per la cura degli animali di laboratorio e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali istituzionali della Rutgers University.

1. Corticosterone cronico (CORT)

  1. Assegnare casualmente i topi ai gruppi di trattamento. Dividere casualmente i topi maschi adulti C57BL/6J in gruppi Vehicle e Corticosterone (CORT).
    1. Topi domestici in gabbie distinte e topi CORT in altri, poiché il loro trattamento viene fornito tramite la bottiglia d'acqua della gabbia.
    2. Etichettare speciali carte d'acqua da inserire nella gabbia che notifica al personale di cura degli animali che le bottiglie d'acqua contengono le soluzioni necessarie per l'esperimento.
  2. Fare una soluzione veicolo sciogliendo 3.375 g di beta-ciclodextrin in 750 mL di acqua del rubinetto in un contenitore di vetro a vite di taglia 1 L.
    1. Riempire le bottiglie d'acqua della gabbia del veicolo con questa soluzione. Assicurarsi che la bottiglia non perdite per misurare il consumo di liquido.
    2. Etichettare il contenitore e conservare a temperatura ambiente sullo scaffale in laboratorio. Utilizzare la soluzione del veicolo per riempire le bottiglie di gabbia per circa 1 settimana.
    3. Ricarica le bottiglie dei veicoli per tutta la settimana. Riempire le bottiglie di gabbia 1x-2x durante la settimana, se necessario. Passare a una bottiglia fresca 1x a settimana sia all'inizio che alla fine della settimana.
      NOTA: Dopo una settimana, la betaciclopedia inizierà a rivestire l'interno della bottiglia d'acqua e rende la soluzione torbide.
    4. Monitorare la quantità di liquido consumato due volte a settimana e registrare. Pesare ogni bottiglia rispettiva e registrare, attenzione a non versare alcun liquido. Ricaricare e restituire ogni bottiglia.
      NOTA: Una gabbia di 5 topi beverà 80-120 mL di liquido in 3-4 giorni.
  3. Rendere la soluzione CORT sciogliendo prima 3.375 g di beta-ciclodextrin in 750 mL di acqua del rubinetto in un contenitore di vetro a vite di taglia 1 L. Quindi aggiungere 26.25 mg di corticosterone.
    1. Soluzione Sonicate CORT per sciogliere CORT in acqua. Mettere il contenitore in un bagno ad ultrasuoni più pulito. Sonicate a 40 kHz per circa 30 min o fino a quando il corticosterone è sciolto e liquido appare chiaro.
      NOTA: Gli omogeneizzatori ad ultrasuoni (in stile punta) sono efficaci anche per la dissoluzione del CORT.
    2. Riempire le bottiglie d'acqua per tutte le gabbie CORT con soluzione. Contenitore etichetta e conservare a temperatura ambiente su scaffale in laboratorio. Soluzione CORT può essere utilizzato per riempire le bottiglie di gabbia per circa 1 settimana.
      NOTA: Utilizzare bottiglie d'acqua di vetro marrone o bottiglie di plastica opache, in quanto CORT è sensibile alla luce.
    3. Monitorare la quantità di liquido consumato due volte a settimana e registrare. Pesare ogni settimana tutti i topi del veicolo e del CORT per confrontare il liquido consumato con il peso dei topi all'interno di ogni gabbia.
    4. Per determinare il volume del liquido consumato (mL/g/giorno), utilizzare la seguente equazione:
      (Gabbia di volume bevuta negli ultimi 3-4 giorni) / (Peso corporeo medio dei topi nella gabbia) X numero di giorni da quando il veicolo o la bottiglia CORT è stata riempita di nuovo)
      NOTA: Una gabbia media di n.5 topi maschi maschi C57BL/6J consumerà in media 0,25 – 0,30 mg/g/giorno, che in genere rimane coerente attraverso i periodi di tempo ad libitum e privi di cibo. Queste concentrazioni si trasfo in dosi approssimative di 24 mg/kg/giorno beta-ciclodextrin e 9,5 mg/kg/giorno CORT15,16.
  4. Stress da sconfitta sociale (SDS)
    1. Utilizzare i protocolli di stress di sconfitta sociale standard come descritto in profonditàaltrove 24,29.
  5. Attività barriera Y-Labirinto
    1. Privazione alimentare per il compito della barriera del labirinto Y
      1. Il giorno dopo aver completato il test di interazione sociale, pesare tutti i topi di controllo e sperimentale. Questo sarà il loro peso corporeo di alimentazione libera.
        NOTA: Qui usiamo "Control" e "Experimental" per fare riferimento sia ai topi SDS Control che SDS Experimental, così come ai topi con somministrazione di veicoli e CORT nei rispettivi paradigmi SDS e CORT.
      2. Per privare il cibo i topi, rimuovere solo il chow da laboratorio dal lato C57BL/6J di ogni gabbia.
      3. Pesare tutti i topi, così come la quantità di chow di laboratorio che verrà somministrato ogni giorno, al fine di mantenere correttamente il peso corporeo a circa il 90% del peso di alimentazione libera durante il test.
        NOTA: La quantità di cibo consegnato nella gabbia di ogni topo o mouse dipenderà dal peso corporeo fluttuante e dalla quantità di pellet di ricompensa consumati in ogni giorno di allenamento o test nel labirinto Y.
      4. Stabilisci familiarità con i pellet di ricompensa. Scaricare un piccolo misurino di 20 mg di pellet alimentari a base di grano (Bio-Serv) nella gabbia di casa. Questo stabilirà familiarità con i pellet e motiverà i topi a consumarli nel labirinto Y nelle sessioni di allenamento iniziale e di habituating.
  6. Apparecchio Y-labirinto
    1. Costruire una struttura A-labirinto di plexiglas di larghezza 3/16" di larghezza, con tre bracci di 26 cm di lunghezza, 20 cm di altezza e 7 cm di larghezza.
    2. Utilizzare divisori che scivolano tra gli slot nel labirinto Y per consentire a un ricercatore di chiudere la casella di partenza in cui i topi sono posizionati inizialmente, o per contenere il mouse in entrambi i braccio una volta che hanno selezionato ed inserito le braccia sinistra o destra del labirinto Y.
    3. Creare più barriere da 10, 15 e 20 cm di altezza del labirinto Y dalla rete metallica per il lato verticale e con plexiglas ad un angolo di circa 45 gradi sul lato posteriore angolato. Questo permette ai topi C57BL/6J di afferrare e salire il lato della rete metallica verticale di ogni barriera, per poi attraversare il lato plexiglas angolato della barriera.
      1. Aggiungere gradini sottili sul lato angolato per consentire una maggiore trazione.
  7. Assunti del labirinto Y
    1. Assunte tutti i topi di controllo e sperimentale all'apparato Y-laze.
      1. Il giorno dopo la privazione di cibo, inserire un gran numero di pellet alimentari a base di grano 20 mg (ad esempio, Bio-Serv) nel tappo di un tubo di centrifuga di 50 mL e posizionare alle estremità di ogni braccio del labirinto Y. Questi tappi servono come piccoli recipienti alimentari per i topi, e i topi impareranno facilmente a mangiare i pellet di cibo.
      2. Posizionare ogni mouse nella casella iniziale del labirinto Y con il divisore della casella iniziale in posizione.
      3. Dopo alcuni secondi, rimuovere il divisore, permettendo ad ogni mouse di esplorare il labirinto Y per 15 minuti. Questa quantità di tempo permette al mouse di esplorare adeguatamente tutte le braccia del labirinto e di stabilire familiarità con l'apparato.
        NOTA: Alcuni topi non possono consumare pellet di cibo in questo primo giorno di assu usbazione.
    2. Il giorno seguente, completare un secondo 15 min Y-labirizione utilizzando una procedura identica.
      1. Si noti tutti i topi che non hanno mangiato pellet. Per questi topi, butta un altro piccolo misurino di pellet nelle loro gabbie di casa.
  8. Y-labirinto di formazione a scelta forzata
    1. Designare il braccio ad alta ricompensa (HR) e a bassa ricompensa (LR) per ogni mouse.
      1. Assegnare casualmente i topi in entrambi i gruppi Di controllo e Sperimentale il braccio sinistro come braccio ad alta ricompensa (HR) e il braccio destro come braccio a bassa ricompensa (LR), o viceversa. Così, 4 pellet saranno disponibili in ogni prova a sinistra, braccio HR, e 2 pellet disponibili a destra, braccio LR, o l'opposto.
      2. Controbilanciare questi bracci LR e HR designati sia nel gruppo Control che in Experimental in modo che circa la metà di ogni gruppo avesse il braccio sinistro come braccio HR e la metà avesse il braccio destro come braccio HR.
    2. Prove a scelta forzata
      1. Dopo i 2 giorni di assullazione del labirinto Y, i topi iniziano 3 giorni di 10 prove di allenamento a scelta forzata.
      2. Per ogni prova a scelta forzata, posizionare il mouse nella casella di avvio, quindi rimuovere il divisore, consentendo al mouse 60 s di entrare nel braccio sinistro o destro e consumare i pellet disponibili. Per ogni blocco di prova a scelta forzata dal braccio opposto con il divisore, costringendo il mouse a selezionare l'altro braccio. Per una prova a scelta forzata HR, bloccare l'accesso al braccio LR o viceversa.
      3. Rimuovere il mouse dopo la prova e ricostituire i rispettivi pellet che sono stati mangiati.
      4. Prove a scelta forzata alternativa per ogni mouse in ogni giorno di allenamento, in modo che i topi completino 5 prove HR e 5 LR a scelta forzata.
        NOTA: Le prove a scelta forzata allenano i topi ad associare un braccio alla ricompensa più alta e l'altro alla ricompensa inferiore.
      5. Mettere il mouse nella sua gabbia di casa e poi eseguire non più di 3-5 topi successivi al fine di mantenere un intervallo intertriale di 5 minuti per ogni topo.
  9. Y-labirinto formazione a scelta libera
    1. Prove a scelta libera
      1. Inizia ogni sessione a scelta libera con una prova a scelta forzata HR e LR. Così, i topi avranno sperimentato di essere costretti in ogni braccio prima di iniziare 10 prove di libera scelta.
      2. Posizionare ogni mouse nella casella di avvio e rimuovere il divisore. Una volta che il mouse ha selezionato un braccio e lo ha attraversato fino alla fine dove si trova la coppa contenente i pellet, posizionare il divisore del braccio in posizione su quel lato, bloccando il mouse fino a quando non ha consumato i pellet.
      3. Rimuovere il mouse nella sua gabbia di casa ed eseguire i successivi 3-5 topi utilizzati in quel ciclo per consentire un intervallo di prova inter-prova di 5 minuti.
    2. Registrare i seguenti dati: latenza per scegliere un braccio, selezione del braccio e latenza per raggiungere la tazza di pellet.
      1. Registrare quale braccio entra il mouse e attraversa completamente la coppa di pellet. Registrare anche la latenza per selezionare quel braccio e raggiungere la coppa di pellet.
      2. Considerare qualsiasi prova in cui un mouse non riesce a selezionare un braccio o non consuma tutti i 4 o 2 pellet come prova omessa.
    3. 70% criterio di libera scelta
      1. Registrare il braccio selezionato ogni giorno per tutte le 10 prove a scelta libera.
      2. Una volta che un mouse ha selezionato il braccio HR su 7 delle 10 prove in un giorno di allenamento a scelta libera (criterio 70%), spostare il mouse sulle sessioni di test di barriera.
        NOTA: continuare l'allenamento a libera scelta fino a quando tutti i topi non raggiungono il criterio del braccio HR del 70% per garantire sia un'adeguata discriminazione delle braccia HR e LR e che i topi dimostrino la stessa preferenza per il braccio HR.
  10. Test della barriera del labirinto Y
    1. Sessione di prova di barriera da 10 cm
      1. Posizionare la barriera di 10 cm a metà del braccio HR nel labirinto Y.
      2. Inizia con più prove a scelta forzata per entrambe le braccia. I topi resistenti all'arrampicata sulla barriera possono essere spinti con un lungo e sottile pezzo di plexiglas.
        NOTA: Per esperienza, consigliamo almeno 2 prove a scelta forzata per i bracci HR e LR all'inizio di ogni sessione ad una nuova altezza di barriera. Si consiglia di registrare le prove in cui è necessario richiedere al mouse di scavalcare la barriera se necessario. I topi generalmente imparano a scavalcare la barriera dei 10 cm, che non è così alta che non possono stare in piedi e vedere su di essa, entro le prove 1-2. La barriera dovrà essere posizionata sull'altro lato per i topi con il braccio opposto come braccio HR designato.
      3. Posizionare ogni mouse nella casella di avvio, rimuovere il divisore e lasciare che il mouse attraversi il labirinto e selezionare un braccio per 10 prove a scelta libera contenenti la barriera di 10 cm nel braccio HR.
      4. Se il mouse sceglie il lato HR, si scavalcare la barriera al fine di ottenere la maggiore ricompensa, i 4 pellet. In caso contrario, selezionerà il braccio LR e semplicemente attraversare il pavimento del labirinto per la ricompensa minore, 2 pellet.
      5. Registrare il braccio selezionato e la latenza per selezionare un braccio e raggiungere la coppa di pellet per tutte le prove. Allo stesso modo ruotare 4-6 topi totali per ciclo, per mantenere un intervallo di prova inter-prova di 5 minuti.
        NOTA: Spruzzare il 70% di etanolo nel labirinto Y e asciugare in modo coerente e tra ogni topo.
    2. Sessione di prova di barriera da 15 cm
      1. Il giorno seguente completa tutti i passaggi elencati come sopra (passo 1.10.1), ma con la barriera alta 15 cm nel braccio HR.
    3. Sessione di prova di barriera da 20 cm
      1. Il giorno successivo completare tutti i passaggi elencati come sopra (passo 1.10.1), ma con la barriera di 20 cm di altezza nel braccio HR.
        NOTA: Per esperienza, per l'altezza della barriera di 20 cm la maggior parte dei topi SDS suscettibili o CORT Sperimentale (e anche diversi topi di controllo) sposterà le loro risposte al braccio LR, in quanto non sono abbastanza motivati da scavalcare l'alta barriera di 20 cm. Inoltre, potrebbe essere necessario utilizzare adattatori in plexiglas per evitare che i topi si aggrezzino dalla cima di questa barriera sui bordi delle pareti del labirinto Y. Si ssiglia di costruire un labirinto Y più alto, in quanto diventa più difficile per lo sperimentatore riempire i pellet in ogni tazza e rimuovere i topi dopo ogni prova.
    4. Sessione di test di discriminazione ricompensa
      1. Per garantire che sia i topi di controllo che i topi sperimentali siano a leva adeguate e simili di discriminazione della ricompensa, condurre una sessione di test di discriminazione.
      2. Seguire tutti i passaggi precedenti (passaggio 1.10.1) ma posizionare una barriera di 10 cm nel braccio LR. Ora, entrambi i bracci contengono barriere di 10 cm, e i topi dovranno scavalcare sia per ottenere la ricompensa di 4 o 2 pellet.
      3. Registrare la latenza e la selezione del braccio per tutte le 10 prove.
        NOTA: Poiché i topi dovranno spendere lo stesso sforzo per ottenere una delle due ricompense, i topi dovrebbero selezionare il braccio HR nella maggior parte delle prove. Per esaminare le latenze per selezionare il braccio HR e LR, calcolare una latenza media del braccio HR e una latenza media del braccio LR per ogni singolo mouse. Quindi, confrontare la latenza per selezionare entrambi i bracci utilizzando un ANOVA misto a due metodi, con SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) come fattore tra soggetti e braccio (braccio HR, braccio LR) come fattore interno.Then, compare latency to select both arms using a two-way mixed ANOVA, with SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) as the between-subjects factor, and arm (HR arm, LR arm) as the within-subjects factor.

2. Stress cronico da sconfitta sociale non discriminatoria (CNSDS)

  1. Schermo per un comportamento aggressivo nei mouse CD-1
    1. Mettere un topo maschio e una femmina C57BL/6J nella gabbia di ogni CD-1 per 180 s o fino a quando il CD-1 attacca entrambi i topi. Questi topi C57BL6/J non hanno bisogno di essere ingenui e non saranno utilizzati in altri esperimenti. Durante questa fase di screening dell'aggressore, non cohouse topi C57BL/6J con topi CD-1.
      1. Latenza record per attaccare entrambi i mouse C57BL/6J per ogni CD-1.
      2. Seleziona tutti gli aggressori CD-1 che attaccano i topi maschi e femmine C57BL/6J entro 60 secondi in sessioni consecutive su un totale di 3 sessioni di screening. Altri possono essere utilizzati per il co-housing in gabbie per la casa.
        NOTA: Un importante avvertimento della sconfitta sociale è la presenza di ferite come conseguenza dell'aggressione fisica. Ogni topo nelle fasi di screening e di screening deve essere controllato per le ferite e trattato con disinfettante cloro-esano se sono presenti piccole lesioni cutanee. Qualsiasi topo con una ferita superiore a 1 cm deve essere rimosso dall'esperimento.
  2. Assegnare i topi ai gruppi di controllo e sperimentali.
    1. Raccogliere tutti i topi adulti C57BL/6J maschi e femmine ingenui, così come gli allevatori di CD-1 maschi in pensione, così come i maschi CD-1 da utilizzare nel co-housing.
      1. Assegnare casualmente topi adulti maschi e femmine C57BL/6J per controllare o condizioni sperimentali. Ogni maschio e ogni femmina saranno accoppiati per tutte le sessioni di sconfitta sociale nel gruppo sperimentale CNSDS. Maschi e femmine nel gruppo di controllo CNSDS ruoteranno ogni giorno.
      2. Assegnare i maschi CD-1 da utilizzare nelle sessioni di sconfitta sociale o essere co-alloggiati con i maschi e le femmine sperimentali dopo ogni sessione, che si alterneranno ogni giorno per ogni coppia di topi maschi e femmine C57BL/6J.
  3. Stress cronico da sconfitta sociale non discriminatorio (CNSDS)
    1. Portare tutti i topi in una sala dedicata alla sconfitta sociale, compresi tutti i maschi CD-1, i topi C57BL/6J di controllo CNSDS e i topi C57BL/6J sperimentali del CNSDS.
      1. Allineare 4-6 gabbie di maschi CD-1 con maschi e femmine C57BL/6J con gabbie CD-1 nella parte anteriore e gabbie C57BL/6J dietro.
      2. Indicare con tag ID gabbia quale mouse viene attaccato e poi co-ospitato con quale CD-1 per garantire l'organizzazione di tutti i topi.
        NOTA: Dopo aver inizializzato gli esperimenti il primo giorno, i topi possono essere ruotati per le restanti 9 sessioni di sconfitta in modo che ogni coppia maschile e femminile C57BL/6J venga ruotata di una gabbia a sinistra per ogni sessione. Ciò consente una nuova interazione con i nuovi CD-1 in ogni sessione.
    2. Procedura di gruppo sperimentale CNSDS
      1. Mettere un maschio adulto e una femmina adulta C57BL / 6J topo nella gabbia di casa di ogni maschio aggressore CD-1 per una sessione di sconfitta sociale di 5 minuti.
      2. Registrare la latenza di attacco e la frequenza di attacco per i topi sperimentali C57BL/6J sia maschili che femminili.
      3. Dopo 5 minuti, rimuovere il topo maschio C57BL/6J e mettere in gabbia di cd-1 maschio co-ospitato, separati da una chiara, barriera plexiglas perforata. Separare l'attacco CD-1 e il topo C57BL/6J femmina con una barriera di plexiglas chiara e perforata simile. Si alternano se il topo C57BL/6J maschio o femmina è alloggiato con l'aggressore CD-1 ogni giorno.
        NOTA: Dopo ogni interazione giornaliera di 5 minuti ogni topo sarà valutato per le lesioni e le ferite trattate se inferiore a 1 cm. Qualsiasi ferita più grande di 1 cm comporterà la rimozione e l'eutanasia immediata del topo. Così, sia i topi sperimentali maschi che femmine sono co-alloggiati con l'aggressore CD-1 per 5 giorni e con il romanzo CD-1 non utilizzato nella sessione di attacco per i restanti 5 giorni. Le barriere chiare e perforate in plexiglas impediscono l'interazione fisica, ma consentono un contatto sensoriale con l'aggressore del CD-1 nelle 24 ore tra una sessione e l'altra. La lavaggio vaginale può essere eseguito su tutti i topi femmine circa 30 minuti dopo la sconfitta ogni giorno come descritto in precedenza28.
    3. Procedura del gruppo di controllo CNSDS
      1. Posizionare una femmina di controllo nella gabbia di casa di un mouse C57BL/6J maschio di controllo.
      2. Dopo 5 minuti, separare i topi e posizionare un divisore di plexiglas chiaro e perforato tra i topi.
      3. Riportare i topi nella stanza della colonia e posizionarli su uno scaffale separato come gabbie sperimentali CNSDS. Nella stanza della colonia abbiamo scaffali designati dove i topi stressati sono alloggiati separatamente dagli altri topi nella stanza della colonia. Inoltre, gli effetti possono essere visti nei topi non stressati se hanno assistito all'aggressione in corso, come si vede nei paradigmi di sconfitta sociale per procura30
      4. Si noti qualsiasi attacco o comportamento di montaggio durante ogni interazione di controllo.
    4. I topi maschi e femmine di controllo saranno introdotti in un nuovo conspecifico nei giorni successivi, come si fa nei tradizionali gruppi di controllo dello stress della sconfitta sociale. Completa 10 giorni consecutivi di sessioni di controllo e sperimentali cnSDS.
      1. Dopo aver completato la sessione 10th e final Control o Experimental CNSDS, co-house tutti i topi e mantenere questo co-housing durante tutti i test comportamentali. Ogni gabbia sarà composta da 2 topi separati su entrambi i lati del divisore di plexiglass per consentire l'esposizione sensoriale. I topi di controllo sono alloggiati con altri topi di controllo del sesso opposto, mentre i topi sperimentali sono co-alloggiati con topi sperimentali di sesso opposto.
      2. Ogni femmina Control C57BL/6J è co-ospitata con il maschio Control C57BL/6J con cui ha interagito nella10a sessione, con un chiaro divisore di plexiglass inserito nella gabbia per separare i due topi.
      3. Circa 24 ore dopo la sessione di sconfitta finale eseguire un test di interazione sociale standard per determinare se CNSDS riduce il comportamento sociale con un nuovo mouse CD-1 rispetto al controllo, e per stratificare i topi "resilienti" o "suscettibili" allo stress24,29.
    5. Testare il controllo CNSDS e i topi maschi e femmine sperimentali in altri comportamenti, tra cui l'attività barriera del labirinto Y, e stratificare il gruppo CNSDS in gruppi CNSDS-Resilient e CNSDS-Susceptible.
  4. Test di interazione sociale
    1. Configurazione iniziale per il test di interazione sociale
      1. 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta del CNSDS, condurre un test di interazione sociale.
      2. Porta tutti i topi control e Experimental accoppiati, così come un nuovo maschio CD-1 non utilizzato nel paradigma CNSDS, in una stanza comportamentale separata per eseguire un test di interazione sociale.
      3. Impostare una camera standard a campo aperto (75 cm x 75 cm) sotto una telecamera di registrazione collegata a un software di monitoraggio comportamentale (ad esempio, EthoVision) in esecuzione su un computer dedicato.
      4. Impostare un nuovo esperimento con una zona di interazione sociale di 24 cm x 24 cm che circonda un contenitore di interazione (piccolo contenitore di plexiglas perforato di circa 10 cm x 10 cm x 10 cm) che orerà il romanzo CD-1 lungo una parete del campo aperto, nel secondo di 2 prove consecutive da 2,5 minuti. Così, una zona di interazione 7 cm di larghezza circonda il contenitore che ospita il nuovo mouse CD-1.
    2. Esecuzione di un mouse nel test di interazione sociale
      1. Posizionare ogni mouse in un angolo lontano del campo aperto per una prova di 2,5 minuti senza CD-1 presente e avviare il programma software di registrazione.
        NOTA: tenere presente che il contenitore di interazione deve essere posizionato al centro di una parete del campo aperto e non contiene alcun mouse CD-1 per questa prima prova.
      2. Dopo 2,5 minuti, rimuovere il mouse nella sua gabbia di casa. Pulire il campo aperto con il 70% di etanolo.
      3. Posizionare il nuovo maschio CD-1 in un secondo cubo di plexiglas perforato lungo il centro di una parete del campo aperto.
      4. Ancora una volta, posizionare il mouse in un angolo del campo aperto per una seconda prova di 2,5 minuti, ora con il CD-1 presente, e avviare il programma software di registrazione.
      5. Rimuovere il mouse e rimilo nella sua gabbia di casa. Rimuovere il CD-1 e rimilo nella sua gabbia di casa. Pulire il campo aperto con il 70% di etanolo.
    3. Eseguire il controllo CNSDS rimanente e topi sperimentali e calcolare il rapporto di interazione.
      1. Ripetere questa procedura con tutti gli altri topi per quantificare il tempo trascorso nella zona di interazione sia nello studio 1 che nella prova 2 per ogni controllo CNSDS e mouse sperimentale.
      2. Per calcolare un rapporto di interazione, confrontare il tempo trascorso nella zona di interazione sociale nella prova 2 (CD-1 presente) rispetto allo studio 1 (CD-1 assente), utilizzando la seguente equazione:
        Rapporto di interazione (tempo nella zona di interazione nella prova 2)/(tempo nella zona di interazione nella prova 1)
    4. Stratificare i topi come "CNSDS-Resilient" o "CNSDS-Susceptible". I topi resilienti hanno un rapporto di interazione di > 1,0, mentre i topi sensibili hanno un rapporto di interazione di <
      1. Nelle successive misure comportamentali come l'attività di barriera del labirinto Y o altri test di comportamento, suddividere i topi sperimentali CNSDS in questi fenotipi sensibili al CNSDS e al CNSDS.
      2. Così, per le femmine, anOVA unifacirsi possono essere condotti tra CNSDS Control, CNSDS Experimental-Resilient, e CNSDS Experimental-Susceptible gruppi, con confronti post-hoc per determinare le differenze tra i gruppi, se del caso.
      3. Per i confronti di differenza di sesso, condurre ANOVA a due senso con CNSDS (Controllo, Resiliente, Suscettibile) e Sesso (Maschio, Femmina) come fattori tra soggetti. Utilizzare i confronti post-hoc, se appropriato.

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Risultati

Il CORT cronico è stato somministrato per 4 settimane seguito dall'addestramento e dai test sulla barriera del labirinto Y (Figura 1A). In una coorte separata, il paradigma SDS di 10 giorni è stato seguito allo stesso modo da formazione e test nell'attività di barriera del labirinto Y (Figura 1C), per determinare l'effetto di questi paradigmi di stress cronico sul comportamento di scelta correlato allo sforzo nei topi maschi. CorT cronico e SDS hanno ridotto il ...

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Discussione

Mentre il paradigma CORT cronico fornisce una dose corT costante nell'acqua potabile, per esperienza ci può essere una certa variabilità nella quantità consumata dai topi. Inoltre, il consumo può essere valutato solo per la gabbia totale e una media presa in base al numero di topi nella gabbia. Inoltre, la fuoriuscita può verificarsi quando si pesano le bottiglie, si trasferiano i topi per il test di comportamento o quando si cambia in una gabbia fresca. Tuttavia, il monitoraggio del consumo di veicoli e CORT è ancora fa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Thomas Grace per aver costruito labirinti Y, barriere e gabbie di sconfitta sociale. Gli autori ringraziano Jay Lee, Karina Stech e Prachi Srivastava per l'assistenza nella raccolta dei dati. Questo lavoro è stato finanziato da NIMH Grant R01 MH112861 (BAS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio acrilicoMcMaster Carr8560K215Trasparente, 3/16" di spessore, 24" X 36"
Beta-ciclodestrinaSigma-AldrichC4767500 mg
C57BL/6J TopiJackson Labs000664Adulti di età 7-8 settimane
CorticosteroneSigma-AldrichC2505 o C27840100 o 500 mg
Topi maschi CD-1 CharlesRiver022"Allevatori in pensione"
Foglio acrilico in PVCMcMaster Carr8560K215Bianco, 3/16" di spessore, 48 "X 48"
Pulitore ad ultrasuoni a stato solidoFisher ScientificFS-28Deve raggiungere 40 kHz
Tessuto in filo d'acciaioMcMaster Carr9219T1431 ft X 2 ft

Riferimenti

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