Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.
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Articolo metodologico
Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer
In questo articolo
Sommario
Abstract
I linfociti ingenui ricircolano dal sangue ai tessuti linfoidi in condizioni fisiologiche ed è comunemente riconosciuto come un fenomeno importante nell'immunità intestinale. Lo stroma degli organi linfoidi secondari, come le chiazze di Peyer (PS) o i linfonodi mesenterici, sono dove i linfociti ingenui percepisce gli antigeni. I linfociti ingenui circolano attraverso il flusso sanguigno per raggiungere alte venute endoteliali, il portale di ingresso nei PC. Si stima che alcuni immunomodulatori influenzino la migrazione dei linfociti, ma la valutazione precisa della dinamica del microcircolo è molto difficile e stabilire un metodo per osservare la migrazione dei linfociti in vivo può contribuire al chiarimento dei meccanismi precisi. Abbiamo perfezionato il metodo di raccolta dei linfociti dal condotto linfatico e osservando la dinamica dettagliata dei linfociti intestinali-tropici nei PC di ratto. Abbiamo scelto la microscopia a scansione laser confocale per osservare i PC di ratto in vivo e l'abbiamo registrata utilizzando la fotografia time-lapse. Ora possiamo ottenere immagini chiare che possono contribuire all'analisi della dinamica dei linfociti.
Introduzione
Le chiazze di Peyer (PPs) sono costituite da centinaia di follicoli linfoidi nella lamina propria dell'intestino tenue. I PP sono divisi in follicoli, la regione interfollicolare e centri germinali situati nella parte inferiore dei follicoli, dove i linfociti sono stimolati dalla presentazione dell'antigene. Non ci sono vasi linfatici afferenti e gli antigeni invadono la lamina propria dal lume intestinale attraverso lo strato cellulare epiteliale. La regione epiteliale che copre i follicoli linfoidi è chiamata epitelio associato al follicolo, all'interno del quale le cellule M intervallate specializzate assuppongono gli antigeni mucosi. Le cellule M assupiscono antig....
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Protocollo
Il protocollo sperimentale fu approvato dal Animal Research Committee del National Defense Medical College (n. 16058). Gli animali sono stati mantenuti su chow di laboratorio standard (CLEA Japan Inc, Tokyo, Giappone). Gli animali da laboratorio sono stati trattati in conformità con le linee guida degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Raccolta e separazione dei linfociti
NOTA: Poiché i linfociti devono essere freschi e non possono essere conservati, devono essere raccolti dai ratti per ogni esperimento. Inoltre, i linfociti intestinali-tropici devono essere raccolti direttamente dal dotto toracico dove circolano. ....
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Risultati
Raccolta di linfociti dalla linfa
Per preparare il ratto alla cannulazione del dotto toracico, fare un'incisione nel dotto toracico teso, come mostrato nella figura 1, quindi mantenere il ratto nella gabbia di Un Bollman, come mostrato nella figura 2.
Quando i linfociti sono ben raccolti, possiamo ottenere circa 20 mL / 6 h di liquido linfatico contenente circa 107~ 108/ mL linfociti. Tra i TD.......
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Discussione
Qui abbiamo descritto un protocollo per la raccolta di linfociti intestinali-tropici ingenui e l'osservazione della loro migrazione nei PC di ratto. Queste procedure possono rivelare come i linfociti si muovono nella microvascolarizzazione dei PC e consentire di confrontare visivamente la loro dinamica in una condizione normale o medicata. L'osservazione diretta di queste dinamiche ha molto merito di ottenere un indizio per la modifica immunologica da parte di alcuni farmaci, anche se il periodo osservazionale è limitato.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Defense Medical College e da una borsa di ricerca per la salute e le scienze del lavoro per la ricerca sulle malattie intrattabili del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A1R + | Nikon Microscopia | a scansione laser comfocale | |
| Carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurano | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medio | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Rosso– destrano | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Riferimenti
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-....
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Ristampe e permessi
