L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine è una tecnica emergente per la caratterizzazione strutturale delle proteine. Diversi additivi solventi e ligand hanno varie proprietà di scavenging radicale idrossile. Per confrontare la struttura della proteina in diverse condizioni, è necessaria una compensazione in tempo reale dei radicali idrossili generati nella reazione per normalizzare le condizioni di reazione.
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Articolo metodologico
Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia proteica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) è una tecnica di biologia strutturale basata sulla spettrometria di massa che sonda l'area superficiale delle proteine accessibile dal solvente. Questa tecnica si basa sulla reazione delle catene laterali di amminoacidi con radicali idrossili che si diffonde liberamente in soluzione. FPOP genera questi radicali in situ con fotolisi laser di perossido di idrogeno, creando una raffica di radicali idrossili che si esaurisce nell'ordine di un microsecondo. Quando questi radicali idrossili reagiscono con una catena laterale di amminoacidi accessibile al solvente, i prodotti di reazione presentano uno spostamento di massa che può essere misurato e quantificato dalla spettrometria di massa. Poiché il tasso di reazione di un amminoacido dipende in parte dalla superficie media accessibile al solvente di tale amminoacido, i cambiamenti misurati nella quantità di ossidazione di una determinata regione di una proteina possono essere direttamente correlati ai cambiamenti nell'accessibilità del solvente di tale regione tra diverse conformazioni (ad esempio, legante-bound contro ligando-free, monomer vs. aggregato, ecc.) FPOP è stato applicato in una serie di problemi in biologia, tra cui interazioni proteina-proteina, cambiamenti conformazionali delle proteine e legame proteina-ligando. Poiché la concentrazione disponibile di radicali idrossili varia in base a molte condizioni sperimentali nell'esperimento FPOP, è importante monitorare la dose radicale efficace a cui è esposto l'alyte proteico. Questo monitoraggio viene ottenuto in modo efficiente incorporando un dosimetro in linea per misurare il segnale dalla reazione FPOP, con fluenza laser regolata in tempo reale per ottenere la quantità desiderata di ossidazione. Con questa compensazione, i cambiamenti nella topografia delle proteine che riflettono i cambiamenti conformazionali, le superfici leganti i ligando e/o le interfacce proteina-proteina possono essere determinati in campioni eterogenei utilizzando quantità di campioni relativamente basse.
Introduzione
L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) è una tecnica emergente per la determinazione dei cambiamenti topografici delle proteine mediante modifica covalente ultraveloci della superficie delle proteine esposta al solvente seguita dal rilevamento da parte di LC-MS1. FPOP genera un'alta concentrazione di radicali idrossili in situ dalla fotolisi laser UV del perossido di idrogeno. Questi radicali idrossili sono molto reattivi e di breve durata, consumati su una scala cronologica di circa un microsecondo in condizioni FPOP2. Questi radicali idrossili si diffondono attraverso l'acqua e ossidano vari componenti ....
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Protocollo
1. Preparare la panca ottica e il capillaro per FPOP
CAUTION: I laser ad escimera KrF sono ostacoli agli occhi estremi e la luce diretta o riflessa può causare danni permanenti agli occhi. Indossare sempre un'adeguata protezione oculare, evitare la presenza di oggetti riflettenti vicino al percorso del fascio quando possibile e utilizzare i controlli di ingegneria per impedire l'accesso non autorizzato a un laser attivo e per frenare eventuali riflessi vaganti.
- Preparare il banco ottico FPOP.
- Accendere il laser per riscaldarsi. Impostare il laser su Trigger esterno, Energia costante, Nessuna sostituzione del gas. Impostare....
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Risultati
Il confronto dell'impronta di peptide a catena pesante del biosimilare adalimumab nel tampone di fosfati e quando riscaldato a 55 gradi centigradi per 1 h mostra risultati interessanti. Il t-test dello studente viene utilizzato per l'identificazione di peptidi che vengono modificati in modo significativo in queste due condizioni (p ≤ 0,05). I peptidi 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 e 414-420 mostrano una protezione significativa dal solvente quando la proteina viene riscaldata per formare aggregati (
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Discussione
Le tecniche strutturali basate sulla spettrometria di massa, tra cui lo scambio di idrogeno-deuterio, il collegamento chimico incrociato, l'etichettatura covalente e la spettrometria di massa a spruzzo nativo e la mobilità degli ioni, sono in rapida crescita grazie alla loro flessibilità, sensibilità e capacità di gestire miscele complesse. FPOP vanta diversi vantaggi che hanno aumentato la sua popolarità nel settore delle tecniche strutturali basate sulla spettrometria di massa. Come la maggior parte delle strategie di .......
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Dichiarazioni
Joshua S. Sharp rivela un significativo interesse finanziario in GenNext Technologies, Inc., una piccola azienda che cerca di commercializzare tecnologie per l'analisi della struttura di ordine superiore delle proteine, tra cui l'impronta delle proteine radicali idrossile.
Ringraziamenti
Riconosciamo il finanziamento della ricerca da parte del National Institute of General Medical Sciences grant R43GM125420-01 per sostenere lo sviluppo commerciale di un dispositivo FPOP benchtop e R01GM127267 per lo sviluppo di protocolli di standardizzazione e dosimetria per FPOP ad alta energia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenina | Acros Organics | 147440250 | Solubile in acqua fino a 3,5 |
| mM Apertura | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μ m Diametro dell'apertura, rame placcato oro Supporto dell'apertura |
| Edmund Optics | 53-287 | Diametro esterno 25,8 mm, montaggio stenopeico di precisione | |
| Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalasi da fegato bovino, polvere liofilizzata, ≥ 10.000 unità/mg di proteina |
| Laser COMPex Pro | 1113836 coerente | COMPexPRO 102, F-Vversion, laser KrF, No XeCl | |
| Ditioteliolo (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Grado molecolare (DL-Ditiotreitolo) |
| Collettore di frazioni | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Collettore di frazioni automatizzato |
| Capillay in silice fusa | Molex | 1068150023 | Polymicro Tubo capillare flessibile in silice fusa, diametro interno 100 µ m, Diametro esterno 375 µ m, TSP100375 |
| Glutammina | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutammina, 99% |
| Supporto per lente | Edmund Optics | 03-668 | Diametro esterno 53 mm, montaggio ad anello regolabile a tre viti |
| Perossido di idrogeno | Fisher Scientific | H325-100 | Perossido di idrogeno, 30% (certificato ACS), Fisher Chemical |
| Sistema LC-MS/MS Thermo | Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 accoppiato a spettrometro di massa tribrido Orbitap Fusion |
| Acetonitrile di grado Mas spec | Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
| Acido formico di grado mass spec | Fisher Scientific | A117-50 | Acido formico, 99,0+%, Optima™ Grado LC/MS, Fisher Chemical |
| Acqua di grado di spettrometria di massa | Fisher Scientific | W6-4 | Acqua, Optima Grado LC/MS, Fisher Chemical |
| tampone MES | Sigma Aldrich | M0164 | Sale emisodico MES |
| Metionina ammide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2. Morsetto HCl |
| Micro V | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp con lame in acciaio inox |
| Tavolino motorizzato | Edmund Optics | 68-638 | Corsa 50mm Sistema di palcoscenico motorizzato con controllo manuale |
| Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 Colonne HPLC |
| Banco ottico | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
| Sistema di moduli FPOP Pioneer | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Sistema di dosimetria radicalica FPOP in linea |
| Portapalo | Edmund Optics | 58-979 | 3" Lunghezza, ¼-20 Filettatura, Supporto portapalo |
| Fosfato di sodio bibasico | Fisher Scientific | BP331-500 | Fosfato di sodio bibasico eptaidrato (cristalli da incolori a bianchi), Fisher BioReagents |
| Fosfato di sodio monobasico | Fisher Scientific | BP330-500 | Fosfato di sodio monobasico monoidrato (cristalli da incolori a bianchi), Fisher BioReagents |
| Siringa | Hamilton | 81065 | 100 &; L, modello 1710 RN SYR, NDL rimovibile piccolo, 22s ga, 2 pollici, stile a punta 3 |
| Pompa a siringa | KD Scientific | 788101 | Legato 101 pompa a siringa |
| Trap C18 colonna | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Colonne HPLC Acclaim PepMap 100 C18 Tris |
| Sigma Aldrich | 252859 | Tris(idrossimetil)amminometano | |
| Tripsina | Promega | V5111 | Grado di sequenziamento Tripsina modificata Lente |
| convessa piana UV | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Ø x 120 mm FL non rivestito, lente plano-convessa UV |
Riferimenti
- Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
- Hambly, D. M., Gross, M. L.
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Ristampe e permessi
