Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).
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Articolo metodologico
Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sierotipo 1 di Streptococcus pneumoniae rimane un problema enorme nei paesi a basso e medio reddito, in particolare nell'Africa sub-sahariana. Nonostante la sua importanza, gli studi su questo sierotipo sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti genetici per modificarlo. In questo studio, descriviamo un metodo per modificare geneticamente un isolato clinico del sierotipo 1 (ceppo 519/43). È interessante notare che questo è stato ottenuto sfruttando la capacità dello Pneumococco di acquisire naturalmente il DNA. Tuttavia, a differenza della maggior parte degli pneumococchi, l'uso del DNA lineare non ha avuto successo; Per mutare questo importante ceppo, è stato necessario utilizzare un plasmide suicida. Questa metodologia ha fornito i mezzi per una comprensione più profonda di questo sierotipo elusivo, sia in termini di biologia che di patogenicità. Per convalidare il metodo, la principale tossina pneumococcica conosciuta, la pneumolisina, è stata mutata perché ha un fenotipo ben noto e facile da seguire. Abbiamo dimostrato che il mutante, come previsto, ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi. Essendo in grado di mutare un gene importante nel sierotipo di interesse, siamo stati in grado di osservare diversi fenotipi per la perdita di funzione mutanti su infezioni intraperitoneali e intranasali da quelli osservati per altri sierotipi. In sintesi, questo studio dimostra che il ceppo 519/43 (sierotipo 1) può essere geneticamente modificato.
Introduzione
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello globale. Fino a poco tempo fa, sono stati scoperti quasi 100 sierotipi di S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ogni anno, la malattia pneumococcica invasiva (IPD) rivendica circa 700.000 decessi, di bambini di età inferiore ai 5 anni8. S. pneumoniae è la principale cau....
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Protocollo
1. Generazione dell'amplicone mutante mediante SOE-PCR23 e amplificazione della cassetta della spectinomicina
- Inizia eseguendo la PCR per l'amplificazione dei bracci di omologia (ply 5' (488 bp) e ply3' (715 bp) rispettivamente) delle regioni fiancheggianti del gene ply dal ceppo 519/43. Utilizzare primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCATTTTCTACCTTATCCTACC).
- Utilizzare le seguenti condizioni PCR per ply5': denaturazi....
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Risultati
Il protocollo qui descritto inizia utilizzando la PCR per amplificare i bracci di omologia sinistro e destro, eliminando contemporaneamente 191 bp dalla regione centrale del gene ply . Durante l'esecuzione della PCR viene introdotto un sito BamHI al 3' del braccio di omologia sinistro e all'estremità 5' del braccio di omologia destro (Figura 1A). Questo è seguito da PCR-SOE dove i bracci di omologia sinistro e destro sono fusi in un unico amplicone (Figura 1B
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Discussione
Streptococcus pneumoniae, in particolare il sierotipo 1, continua ad essere una minaccia globale che causa malattie invasive da pneumococco e meningite. Nonostante l'introduzione di vari vaccini che dovrebbero essere protettivi contro il sierotipo 1, in Africa, questo sierotipo è ancora in grado di causare epidemie che portano ad alta morbilità e mortalità13. La capacità di manipolare geneticamente questo sierotipo è di fondamentale importanza a causa della sua rilevanza clinica. Il metod.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Meningitis Trust e il MRC per aver fornito finanziamenti per questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AccuPrime Pfx DNA polimerasi | Invitrogen | 12344024 | Utilizzato per l'amplificazione dei frammenti |
| Ampicillina sale sodico | Sigma | Aldrich A9518 | Utilizzato per la selezione batterica allo stadio 1 (pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Utilizzato per placcare S. pneumoniae trasformanti |
| Siero bovino Albumina | sigma | 55470 | utilizzato per S. pneumoniae Infusione |
| di cuore | Oxoid | CM1135 | utilizzato per coltivare cellule S. pneumoniae |
| Cloruro di calcio Cacl2 | Sigma | 449709 | utilizzato per S. pneumoniae Competenza di trasformazione |
| stimolante peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | utilizzato per S. pneumoniae Trasformazione |
| Luria Brodo Agar | Gibco | 22700025 | utilizzato per la placcatura e la selezione di pSD1 e pSD2 |
| Luria Broth Base (formulazione di Miller) | Gibco | 12795027 | utilizzato per la placcatura e la selezione di pSD1 e pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Utilizzato per estrarre le bande dal gel di DNA |
| Monarch Plasmid Kit Miniprep | NEB | T1010S | Utilizzato per estrarre il plasmide dalle cellule |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | utilizzato come plasmide suicida |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | utilizzato per il recupero delle cellule dopo la trasformazione |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma | S0899 | utilizzato per S.pneumoniae |
| Trasformazione Spectinomicina cloridrato | SigmaAldrich | PHR1426 | Utilizzato per la selezione |
| batterica Efficienza di subclonaggio DH5α Cellule competenti | Invitrogen | 18265017 | utilizzato per la creazione di pSD1 e pSD2 |
Riferimenti
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactiv....
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Ristampe e permessi
