La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.
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Articolo metodologico
Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC è un problema critico per la loro applicazione nella terapia rigenerativa, nel test farmacologico e nella modellazione della malattia. Nonostante lo sviluppo di più protocolli di differenziazione, la generazione di cardiomiociti iPSC simile a un fenotipo adulto rimane impegnativa. Un aspetto importante della maturazione dei cardiomiociti riguarda la formazione di una rete di sarcomi ben organizzata per garantire un'elevata capacità di contrazione. Qui, presentiamo un approccio basato sulla risoluzione super per l'analisi semi-quantitativa della α-actinin nei cardiomiociti. Utilizzando la microscopia di localizzazione fotoattivata è stato eseguito un confronto tra la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z dei cardiomiociti derivati da iPSC e delle cellule cardiache isolate dal tessuto neonatale. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di condizioni di imaging adeguate per ottenere dati affidabili. I nostri risultati mostrano che questo metodo è adatto a monitorare quantitativamente la maturità strutturale delle cellule cardiache con alta risoluzione spaziale, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche sottili dell'organizzazione dei sarcome.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari (CVD) come l'infarto miocardico o la cardiomiopatia rimangono la principale causa di morte nel mondo occidentale1. Poiché il cuore umano possiede solo una scarsa capacità rigenerativa, c'è bisogno di strategie per promuovere il recupero dalle CVD. Questo include terapie di sostituzione cellulare per ricostituire cardiomiociti persi (CM), così come lo sviluppo di nuovi farmaci anti-aritmici per un intervento farmaceutico efficiente e sicuro. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno dimostrato di essere una fonte di cellule promettente per la generazione illimitata di CM umano in vitro, adatta per terapie....
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Protocollo
Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali e adulti sono state eseguite secondo le linee guida etiche per la cura degli animali del Rostock University Medical Centre.
1. Coltivazione e dissociazione di cardiomiociti derivati da iPSC
- Differenziare i hiPSC-CM per 25 giorni utilizzando un metodo monostrato 2D come descritto in precedenza17.
- Dissociazione prebellico medio a 37 gradi centigradi e supporto a temperatura medio-ambiente.
- Lavare le celle due volte con PBS.
- Aggiungere il mezzo di dissociazione preriguero alle cellule e incubare per 12 min a 37 grad....
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Risultati
Per stimare il grado di maturazione strutturale di CM, adulto neonatale, adulto completamente maturo, e iPSC CM sono stati inizialmente etichettati il CM con anticorpo α-actinin per visualizzare la rete di sarcomere. In seguito all'acquisizione di PALM, le immagini sono state ricostruite e lo spessore del disco z è stato misurato utilizzando un software di elaborazione delle immagini basato su plugin per il rilevamento automatico della larghezza dei singoli filamenti. La lunghezza del sarcomere è stata calcolata misurand.......
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Discussione
La generazione di CM in vitro funzionale derivata da iPSC è importante per le terapie rigenerative, la modellazione delle malattie e lo sviluppo di piattaforme di screening farmacologico. Tuttavia, la maturità insufficiente di questi CM è un ostacolo importante nella ricerca cardiovascolare20. A questo proposito, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione che consentano il monitoraggio dello stato di maturazione strutturale del CM derivato da iPSC. Allo stesso tempo, la microscopia a .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo strutturale dell'UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Inoltre, H.L. è supportato dal programma FORUN del Rostock University Medical Centre (889001 e 889003) e dalla Fondazione Josef e K'the Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. è supportato dal Programma Scienziato Cliniciano del Rostock University Medical Center. R.D è supportato dal DFG (DA1296/6-1), dalla fondazione DAMP, dalla German Heart Foundation (F/01/12) e dal BMBF (VIP 00240).
Ringraziamo Madeleine Bartsch per il suo supporto tecnico nella coltura cellulare iPSC e nella differenziazione cardiaca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| linea cellulare iPSC umana | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| provetta eppendorf da 0,5 ml | Eppendorf | 30121023 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A906 | |
| Kit di dissociazione dei cardiomiociti | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalasi | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cicloottatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cisteamina | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza Ca2+ e Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Software di elaborazione delle immagini delle Figi (Immagine J) | |||
| Glucosio | Carl Roth | X997.2 | |
| Acido cloridrico | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA Sistema PS.1 | Zeiss | ||
| Paraformaldeide | Merck | 8187150100 | |
| Piranosio ossidasi | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| anticorpo sarcomerico &alfa;-actinina [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S7653 | |
| acqua sterile | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | Codice 63689 |
Riferimenti
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H.
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Ristampe e permessi
