Articolo metodologico

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

DOI:

10.3791/61605

⸱

3 novembre 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.

Abstract

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La maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC è un problema critico per la loro applicazione nella terapia rigenerativa, nel test farmacologico e nella modellazione della malattia. Nonostante lo sviluppo di più protocolli di differenziazione, la generazione di cardiomiociti iPSC simile a un fenotipo adulto rimane impegnativa. Un aspetto importante della maturazione dei cardiomiociti riguarda la formazione di una rete di sarcomi ben organizzata per garantire un'elevata capacità di contrazione. Qui, presentiamo un approccio basato sulla risoluzione super per l'analisi semi-quantitativa della α-actinin nei cardiomiociti. Utilizzando la microscopia di localizzazione fotoattivata è stato eseguito un confronto tra la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z dei cardiomiociti derivati da iPSC e delle cellule cardiache isolate dal tessuto neonatale. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di condizioni di imaging adeguate per ottenere dati affidabili. I nostri risultati mostrano che questo metodo è adatto a monitorare quantitativamente la maturità strutturale delle cellule cardiache con alta risoluzione spaziale, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche sottili dell'organizzazione dei sarcome.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari (CVD) come l'infarto miocardico o la cardiomiopatia rimangono la principale causa di morte nel mondo occidentale1. Poiché il cuore umano possiede solo una scarsa capacità rigenerativa, c'è bisogno di strategie per promuovere il recupero dalle CVD. Questo include terapie di sostituzione cellulare per ricostituire cardiomiociti persi (CM), così come lo sviluppo di nuovi farmaci anti-aritmici per un intervento farmaceutico efficiente e sicuro. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno dimostrato di essere una fonte di cellule promettente per la generazione illimitata di CM umano in vitro, adatta per terapie rigenerative, modellazione della malattia e per lo sviluppo di saggi di screening farmacologico2,3,4.

Sebbene esistano molti protocolli di differenziazione cardiaca diversi, il CM derivato da iPSC manca ancora di alcuni aspetti fenotipici e funzionali che ostacolano l'applicazione in vitro e in vivo5,6. Oltre ai cambiamenti elettrofisiologici, metabolici e molecolari, il processo di maturazione cardiaca coinvolge l'organizzazione strutturale dei sarcomere, che sono le unità fondamentali necessarie per la generazione di forza e la contrazionecellulare 7. Mentre le CCI adulte presentano un apparato contrattile ben organizzato, i CM derivati da iPSC dimostrano comunemente filamenti di sarcomero disarrangiati, associati a una ridotta capacità di contrazione e dinamiche di contrazionealterate 8,9. A differenza del CM maturo che mostra un modello di contrazione noniassiale, le strutture disorientate in CM immaturo si traduce in una contrazione radiale dell'intera cellula o promuovono la comparsa di punti focali di contrazione9,10.

Per migliorare la maturazione cardiaca, sono stati applicati diversi approcci, tra cui i metodi di coltura cellulare 3D, la stimolazione elettrica e meccanica, nonché l'uso di matrici extracellulari che imitano le condizioni di vivo11,12,13. Per valutare il successo e l'efficienza di queste diverse condizioni di coltura, sono necessarie tecniche per monitorare e stimare il grado di maturazione strutturale di iPSC CM, ad esempio con tecniche microscopiche. A differenza dell'imaging confocale convenzionale, la risoluzione in caso di microscopia fotoattivata di localizzazione (PALM) è di circa 10 volte superiore. Questa tecnica a sua volta consente un'analisi più accurata, rilevando anche sottili alterazioni delle strutture cellulari14. Considerando l'alta risoluzione dell'imaging basato su PALM, l'obiettivo generale di questo metodo era la valutazione microscopica della maturità del sarcomere nei CM derivati da iPSC mediante una determinazione precisa dello spessore z-Disco e della lunghezza del sarcomere. Negli studi precedenti, queste caratteristiche strutturali hanno dimostrato di essere parametri appropriati per valutare la maturità cardiaca15. Ad esempio, iPSC-CM a base di distrofina a lunghezza intera presentano una lunghezza del sarcomere e una larghezza della banda z ridotte rispetto alle celle di tiposelvaggio 16. Allo stesso modo, la lunghezza dei singoli sarcomere è stata misurata per studiare l'impatto dei segnali topografici sullo sviluppo cardiaco16. Quindi, abbiamo applicato questo approccio per valutare la maturazione strutturale della rete sarcomere in iPSC-CM misurando quantitativamente la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z.

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Protocollo

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Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali e adulti sono state eseguite secondo le linee guida etiche per la cura degli animali del Rostock University Medical Centre.

1. Coltivazione e dissociazione di cardiomiociti derivati da iPSC

  1. Differenziare i hiPSC-CM per 25 giorni utilizzando un metodo monostrato 2D come descritto in precedenza17.
  2. Dissociazione prebellico medio a 37 gradi centigradi e supporto a temperatura medio-ambiente.
  3. Lavare le celle due volte con PBS.
  4. Aggiungere il mezzo di dissociazione preriguero alle cellule e incubare per 12 min a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
  5. Aggiungere il supporto di supporto alle celle.
    NOTA: il volume del supporto aggiunto deve essere il doppio del volume del supporto di dissociazione utilizzato al punto 1.4.
  6. Spostare le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
  7. Cellule centrifughe a 200 x g per 5 min e risuspendere il pellet in 3 mL di coltura hiPSC-CM media17.
  8. Cellule di semi in 8 camere di fondo di vetro ben ad una densità cellulare di 75.000 cellule / bene e coltura per 3 giorni.

2. Isolamento cardiomiocato per adulti

  1. L'isolamento e la coltivazione di cardiomiociti adulti da topi NMRI è stato eseguito come riportato inprecedenza 18.
  2. Cellule di semi in 8 vetrate ben vetro e coltura per un giorno.

3. Isolamento e coltivazione di cardiomiociti neonatali

  1. La procedura di isolamento dei cardiomiociti neonatali, ottenuta dai topi NMRI, è stata eseguita come descritto inprecedenza 19.
  2. Seme isolato cella in 8 camera di vetro bene scivolare ad una densità cellulare di 75.000 cellule / bene e coltura per 3 giorni in coltura CM neonatalemedia 19.

4. Etichettatura dell'immunofluorescenza α-actinin

NOTA: Per ottenere risultati ottimali, le celle vengono colturate in 8 camere di fondo in vetro. L'etichettatura deve essere eseguita un giorno prima dell'imaging.

  1. Preguerra 4% PFA a 37 gradi centigradi.
  2. Fissare iPSC-CM aggiungendo il 4% di paraformaldeide direttamente nei supporti di coltura (diluizione 1:1) e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. La concentrazione finale di PFA per la fissazione è del 2%.
  3. Incubare le cellule fisse in 0,2% Tritone-X, diluite in PBS, per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule due volte con PBS, 5 min ciascuna.
  5. Aggiungere la soluzione 1% BSA (diluita in PBS) e incubare per 60 min a temperatura ambiente.
  6. Preparare 150 L della soluzione anticorpo primaria diluendo l'anticorpo α-actinin 1:100 in 1% BSA, contenente 0,05% Tritone-X. Aggiungere alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 60 min.
  7. Lavare le cellule due volte con una soluzione BSA dello 0,2%, 5 min ciascuna.
  8. Preparare 150 L della soluzione di anticorpi secondari diluendo l'anticorpo Alexa647 capra-anti-topo 1:100 in 1% BSA, contenente 0,05% Tritone-X. Aggiungere alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 40 min.
  9. Lavare le cellule due volte con una soluzione BSA dello 0,2%, 5 min ciascuna.
  10. Lavare le cellule due volte con PBS, 5 min ciascuna. Mantenere le cellule etichettate al buio a 4 gradi centigradi fino all'imaging PALM.

5. Preparazione del buffer di imaging PALM

NOTA: è fondamentale preparare di nuovo il buffer di imaging PALM per ogni esperimento.

  1. Preparare la soluzione del glucosio al 50% sciogliendo 25 g di glucosio in 50 mL di acqua distillata.
  2. Preparare tampone di base contenente 50 mM Tris-HCl, 10% glucosio e 10 mM di cloruro di sodio.
    1. Regolare il livello di pH a 8,0 usd utilizzando l'acido cloridrico.
  3. Preparare la soluzione di ossidazione piranosa sciogliendo 0,6 mg di ossidasi piranosa in 316 L di tampone di base.
  4. Preparare la soluzione catalasi sciogliendo 7 mg di catalasi in 500 L di tampone di base. Mescolare accuratamente e centrifugare a 10.000 x g per 3 min. Mantenere il supernatant per un ulteriore utilizzo. La soluzione catalasi può essere conservata a 4 gradi centigradi per diversi giorni.
  5. Preparare 500 L di buffer di imaging PALM mescolando 316 L di soluzione di ossidasi piranosa, 25 L di soluzione di catalasi, 100 L di soluzione di glucosio del 50%, 50 L di cisteamina, 5 l di cycloctatetraene e 3,5 L di β-Mercapoetanolo. L'attività catalitica finale dell'ossidasi e della catalasi dei piranosi deve essere rispettivamente di 7,5 U, 35.00U.
    NOTA: il buffer di imaging PALM fornisce condizioni di imaging ottimali per 3-5 h. Se la capacità lampeggiante del colorante fluorescente diminuisce, preparare un nuovo aliquot tampone.

6. Acquisizione di immagini PALM

  1. Accendere il microscopio almeno 3 h prima dell'uso e portare il campione a temperatura ambiente prima dell'imaging per consentire l'equilibrio termico. Se il microscopio è dotato di una camera di incubazione, regolare la temperatura a 30 gradi centigradi.
  2. Pulire l'obiettivo e il fondo del scivolo della camera utilizzando un solvente di pulizia appropriato.
  3. Aggiungere 300 L di buffer di imaging PALM in un pozzo di cellule etichettate e inserire il scorremento della camera nel supporto dello stadio del microscopio.
  4. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine PALM.
    1. Selezionare 1,57 N.A. 100x obiettivo di petrolio per l'acquisizione.
    2. Selezionare la modalità PALM e attivare le impostazioni TIRF.
    3. Regolare il numero di fotogrammi da acquisire. Di solito 5.000-10.000 fotogrammi sono sufficienti per ottenere risultati ottimali. Tuttavia, il numero di telai acquisiti dipende fortemente dall'efficienza di etichettatura e dalla capacità lampeggiante del colorante fluorescente e può essere regolato dall'utente.
    4. Impostare la potenza laser UV su 0,1% e 647 laser su 0,2%.
    5. Impostare il livello di guadagno su 50-100.
    6. Accendere l'illuminazione laser e selezionare una cella di destinazione. Il livello di guadagno può essere aumentato se l'intensità del segnale è bassa (a seconda dell'etichettatura di fluorescenza).
    7. Spegnere l'illuminazione laser
  5. Acquisizione di immagini PALM
    1. Ridurre il guadagno a 0 e aumentare la potenza del laser (ex 647) al 100%.
    2. Sbiancare la cella bersaglio per 5 s.
    3. Aumenta il guadagno a 50 e avvia l'acquisizione di immagini PALM.
      NOTA: il guadagno deve essere regolato per ottenere un'intensità del segnale sufficiente, mentre i pixel sovrasaturi devono essere evitati. Se l'intensità del segnale si riduce, aumentare il livello di guadagno.
  6. Facoltativamente, migliorare costantemente la potenza del laser UV (0,1%-10%) per aumentare l'intensità del segnale e per promuovere il lampeggiamento del fluoroforo.

7. Ricostruzione dei dati PALM

  1. Aprire il software Image J e importare i dati PALM.
  2. Aprire il plug-in Temporale e "Esegui analisi"
    1. Nel menu "Configurazione fotocamera" immettere le dimensioni in pixel e il guadagno EM.
      NOTA: quando si utilizzano obiettivi 100x e obiettivo di ingrandimento 1,6x, le dimensioni in pixel di 100 nm sono appropriate. Tuttavia, poiché la dimensione in pixel dipende dalle caratteristiche hardware del microscopio e della fotocamera utilizzate per l'imaging PALM, gli utenti devono controllare e adattare attentamente questo parametro. I valori di guadagno EM possono essere ottenuti dai metadati.
    2. Nel menu "Esegui analisi" impostare i parametri come segue: ordine B-spline: 3, scala B-spline: 2.0, soglia di intensità massima: stf(Wave.F1), raggio di adattamento: 3, sigma iniziale: 1.6, ingrandimento: 5.0, frequenza di aggiornamento: 50, spostamenti successivi: 2. Confermare facendo clic sul pulsante "OK".
  3. Post-elaborazione dell'immagine PALM ricostruita
    1. Nel menu "Istogramma distampa " selezionare ilparametro " Sigma".
    2. Utilizzare lo strumento"Rettangolo " per selezionare un ROI, escludendo i possibili artefatti e applicare il ROI al filtro. I valori del ROI verranno visualizzati nella casella di comando del filtro.
    3. Aggiungere "& incertezza <25" ai valori del ROI. Un possibile comando di filtro sarà simile al seguente: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incertezza < 25". Applicare i valori sigma selezionati.
    4. Nel menu"Rimuovi duplicati",immettere una soglia di distanza di "10 nm" e applicarlo.
    5. Nelmenu "Unione", impostarela distanza massima su "20", il numero massimo di fotogrammi per molecola su "0" e il numero massimo di fotogrammi su "1". Applicare le impostazioni.
    6. Nel menu "Correzione deriva", selezionare la correlazione incrociata e impostare " Numerodi collocazioni" su "5" e "Ingrandimento" su "5.0". Applicare le impostazioni di correzione della deriva.
    7. Salvare l'immagine PALM finale ed esportare i dati post elaborati, se lo si desidera.

8. Analisi dei filamenti di sarcomere

  1. Analisi della lunghezza del sarcomere
    1. Aprire il software Image J e importare l'immagine PALM ricostruita.
    2. Disegnare una linea tra le strutture sarcomere selezionate perpendicolari al disco z per misurare la distanza più breve tra i filamenti di actinino.
    3. Selezionare "Profilo distampa " nel menu" Analizza" e acquisire la lunghezza tra due picchi. Poiché la lunghezza del sarcomere può variare all'interno di una cella, un minimo di 20 sarcomere deve essere misurato in diverse aree della cellula bersaglio.
  2. Analisi dello spessore z-Disc
    1. Aprire il software Image J e importare l'immagine PALM ricostruita.
    2. Convertire l'immagine PALM ricostruita in un'immagine in modalità a 8 bit.
    3. Aprire il plugin di rilevamento della cresta e inserire i seguenti parametri: larghezza linea: 20, contrasto elevato: 230, contrasto basso: 10, sigma: 0,79, soglia inferiore: 25,84, lunghezza minima della linea: 20.
    4. Impostare "Stima larghezza ","Estendi riga" e " Visualizzarisultati".
    5. Fare clic su" OK" e utilizzare " Spessorelinea media" dalla tabella dei risultati per ulteriori analisi.

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Risultati

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Per stimare il grado di maturazione strutturale di CM, adulto neonatale, adulto completamente maturo, e iPSC CM sono stati inizialmente etichettati il CM con anticorpo α-actinin per visualizzare la rete di sarcomere. In seguito all'acquisizione di PALM, le immagini sono state ricostruite e lo spessore del disco z è stato misurato utilizzando un software di elaborazione delle immagini basato su plugin per il rilevamento automatico della larghezza dei singoli filamenti. La lunghezza del sarcomere è stata calcolata misurand...

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Discussione

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La generazione di CM in vitro funzionale derivata da iPSC è importante per le terapie rigenerative, la modellazione delle malattie e lo sviluppo di piattaforme di screening farmacologico. Tuttavia, la maturità insufficiente di questi CM è un ostacolo importante nella ricerca cardiovascolare20. A questo proposito, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione che consentano il monitoraggio dello stato di maturazione strutturale del CM derivato da iPSC. Allo stesso tempo, la microscopia a ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo strutturale dell'UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Inoltre, H.L. è supportato dal programma FORUN del Rostock University Medical Centre (889001 e 889003) e dalla Fondazione Josef e K'the Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. è supportato dal Programma Scienziato Cliniciano del Rostock University Medical Center. R.D è supportato dal DFG (DA1296/6-1), dalla fondazione DAMP, dalla German Heart Foundation (F/01/12) e dal BMBF (VIP 00240).

Ringraziamo Madeleine Bartsch per il suo supporto tecnico nella coltura cellulare iPSC e nella differenziazione cardiaca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
linea cellulare iPSC umanaTakaraY00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottomibidi80827
provetta eppendorf da 0,5 mlEppendorf30121023
Albumina sierica bovinaSigma AldrichA906
Kit di dissociazione dei cardiomiocitiStem Cell Technologies05025
CatalasiSigma AldrichC40-1G
CicloottatetraeneSigma Aldrich138924-1G
CisteaminaSigma Aldrich30070-10g
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza Ca2+ e Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Software di elaborazione delle immagini delle Figi (Immagine J)
GlucosioCarl RothX997.2
Acido cloridricoSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA Sistema PS.1Zeiss
ParaformaldeideMerck8187150100
Piranosio ossidasiSigma AldrichP4234-250UN
anticorpo sarcomerico &alfa;-actinina [EA-53]Abcamab9465
Cloruro di sodioSigma AldrichS7653
acqua sterileCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Trizma baseSigma AldrichT1503
β-MercaptoetanoloSigma AldrichCodice 63689

Riferimenti

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