Questo protocollo descrive la preparazione della cartilagine articolare bovina in vitro per l'imaging ad alta risoluzione con raggi X. Questi espianti vanno attivamente incontro alla maturazione postnatale. Descriviamo qui i passaggi necessari dalla biopsia all'analisi dei dati dell'imaging 3D a contrasto di fase a raggi X, passando per la coltura di espianto, la fissazione tissutale e la preparazione del sincrotrone.
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Articolo metodologico
Preparazione in vitro di espianti di cartilagine articolare bovina a maturazione attiva per l'imaging a contrasto di fase a raggi X
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere i meccanismi che sono alla base della maturazione postnatale della cartilagine articolare è di fondamentale importanza per progettare la prossima generazione di strategie di ingegneria tissutale e potenzialmente riparare la cartilagine malata o danneggiata. In generale, la maturazione postnatale della cartilagine articolare, che è un cambiamento all'ingrosso della struttura del collagene e della funzione del tessuto per accogliere la crescita dell'organismo, si verifica in un arco di tempo che va da mesi ad anni. Al contrario, la dissoluzione dell'organizzazione strutturale della cartilagine, che si verifica anche su lunghe scale temporali, è il segno distintivo della degenerazione tissutale. La nostra capacità di studiare questi processi biologici in dettaglio è stata migliorata dai risultati che i fattori di crescita possono indurre una precoce maturazione in vitro della cartilagine articolare immatura. I cambiamenti legati allo sviluppo e alla malattia che si verificano nell'articolazione coinvolgono l'osso e la cartilagine e la capacità di co-immaginare questi tessuti aumenterebbe significativamente la nostra comprensione dei loro ruoli intrecciati.
La visualizzazione simultanea dei cambiamenti dei tessuti molli, della cartilagine e dell'osso è oggi una sfida da superare per le modalità di imaging preclinico convenzionali utilizzate per il follow-up della malattia articolare. I metodi di imaging tridimensionale a raggi X a contrasto di fase (PCI) sono in continuo sviluppo da 20 anni grazie alle elevate prestazioni per l'imaging di oggetti a bassa densità e alla loro capacità di fornire informazioni aggiuntive rispetto all'imaging a raggi X convenzionale.
In questo protocollo descriviamo in dettaglio la procedura utilizzata nei nostri esperimenti, dalla biopsia della cartilagine, alla generazione di cartilagine matura in vitro all'analisi dei dati delle immagini raccolte utilizzando l'imaging a contrasto di fase a raggi X.
Introduzione
La cartilagine articolare immatura è un supporto adeguato per avviare cambiamenti morfologici, strutturali e biomolecolari1 al fine di ottenere una funzione articolare-specifica adulta. Il cambiamento principale è la riorganizzazione delle fibrille di collagene da una che mostra un orientamento parallelo rispetto alla superficie nella cartilagine immatura a una in cui le fibrille più profonde nel tessuto sono perpendicolari nella cartilagine matura. La pseudo-stratificazione della cartilagine adulta è evidente attraverso la riorganizzazione dei condrociti residenti lungo la direzione dell'orientamento delle fibrille di collagene, con le cellule sulla superficie a forma di disco e parallele alla superficie e nelle zone più profonde, le cellule diventano progressivamente più grandi e organizzate in colonne. È noto che la maturazione postnatale si verifica nell'arco di molti mesi e si completa essenzialmente alla fine della pubertà, si pensava che la lunga scala temporale rendesse lo studio di questa importante transizione evolutiva nel migliore dei casi difficile o tecnicamente impossibile da studiare in dettaglio2. Alcuni progressi nella soluzione di questo problema sono stati fatti attraverso la scoperta che il fattore di crescita dei fibroblasti-2 e il fattore di crescita trasformante-β1 insieme sono in grado di indurre importanti cambiamenti fisiologici e morfologici che replicano la maturazione della cartilagine articolare 2,3 (Figura 1). La maturazione in vitro indotta dal fattore di crescita avviene entro tre settimane e non richiede alcun input biomeccanico. Dopo la coltura, l'espressione del collagene di tipo II è significativamente ridotta e il rapporto tra i legami incrociati del collagene trivalente maturo e quello bivalente immaturo aumenta, come si osserva nella cartilagine in maturazione. Inoltre, l'organizzazione della matrice extracellulare e delle fibrille di collagene è più vicina a quella osservata nella cartilagine matura, sebbene questo aspetto della transizione non sia completo. Dal punto di vista biochimico, la composizione della cartilagine trattata con fattore di crescita imita la cartilagine articolareadulta 3.
Il modello utilizzato nell'articolo si basa su un in vitro coltura di espianti di 4 o 6 mm di diametro asportati in condizioni sterili dalla faccia laterale del condilo mediale dell'articolazione metacarpo-falangea da manzi bovini maschi immaturi (7 giorni di età). Un sottile strato di cartilagine calcificata e osso subcondrale è stato mantenuto sull'aspetto basale di ogni espianto. La cartilagine articolare è stata coltivata in un classico terreno privo di siero, il terreno Eagles modificato di Dulbecco (glucosio alto 4,5 g/L), in cui sono stati aggiunti insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 mM di tampone HEPES pH 7,4, acido ascorbico e 50 μg/mL di gentamicina. Questo terreno di coltura è integrato con 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF-2) e 10 ng/mL di fattore di crescita trasformante β1 (TGF-β1) che vengono reintegrati ogni tre giorni con cambi di terreno2. La maturazione altamente accelerata della cartilagine è indotta dalla combinazione di fattori di crescita. Queste modifiche avvengono entro 21 giorni. La stimolazione del fattore di crescita induce inoltre l'apoptosi e il riassorbimento dall'aspetto basale e la proliferazione cellulare nei condrociti superficiali3. La composizione del terreno di coltura è descritta in Tabella 1. Seguendo il modello sviluppato da Khan et al. 20112, gli espianti di cartilagine articolare vengono coltivati con TGF-β1 a una concentrazione di 10 ng/μL e FGF2 a una concentrazione di 100 ng/μL (concentrazioni stock di 10 μg/mL e 100 μg/mL disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato/0,1% BSA). Viene utilizzato 1 μL di ciascun fattore di crescita per 1 mL di terreno. DMEM-F12 con L-glutammina e glucosio alto è un terreno artificiale che, una volta integrato con insulina, transferrina e selenio (ITS), acido ascorbico, gentamicina e HEPES fornisce un'integrazione completa del terreno con tutte le esigenze fisiologiche di crescita specifiche per le diverse linee cellulari e colture di espianti. DMEM-F12 è composto da diversi sali inorganici (ad esempio, NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, NaH2PO4), glucosio, aminoacidi (fonti azotate), vitamine, cofattori e acqua. Questi sali forniscono input energetici adeguati per sostenere la sopravvivenza cellulare e la normale crescita in coltura. Gli ioni minerali contribuiscono a mantenere l'osmolarità vicino all'ambiente fisiologico naturale. La concentrazione più elevata di glucosio (4,5 g/L) viene utilizzata poiché i condrociti respirano principalmente attraverso la glicolisi. L'integrazione di terreno F12 viene utilizzata perché offre un numero di fonti di solfato, CuSO4, FeSO4, ZnSO4 e MgSO4 necessario per la sintesi dei glicosaminoglicani solfatati. Come controllato da indicatori colorati (qui rosso fenolo) e CO2/HCO-3 tampone combinato con fosfati, il pH rimane costante ad un valore vicino a 7,4. La principale via respiratoria utilizzata dai condrociti è la glicolisi dove l'acido lattico è il prodotto finale che provoca un aumento del pH, quindi, in assenza di forze biomeccaniche che aiuterebbero a rimuovere l'acido lattico prodotto localmente, HEPES agisce per mantenere un ambiente tamponato per i processi fisiologici. La gentamicina è un antibiotico aminoglicosidico che controlla la contaminazione batterica esterna attraverso l'inibizione della crescita. L'acido ascorbico è usato come complemento medio per la sua azione antiossidante4. L'acido ascorbico è un cofattore per gli enzimi, le prolil idrossilasi, che funzionano per idrossilare i residui di prolina nel collagene stabilizzando la sua struttura a tripla elica. La transferrina di solito funge da antiossidante extracellulare (tossicità e riduzione dei ROS)5,6. Viene anche aggiunto al terreno di coltura per la sua capacità di fornire e facilitare lo stoccaggio e il trasporto extracellulare del ferro in coltura cellulare. La transferrina lega il ferro così strettamente in condizioni fisiologiche che praticamente non esiste ferro libero per catalizzare la produzione di radicali liberi7. La segnalazione dell'ormone insulina dal suo recettore legato aumenta l'assorbimento di diversi elementi come glucosio, aminoacidi. È anche coinvolto in diversi processi come il trasporto intracellulare, la lipogenesi, le sintesi di proteine e acidi nucleici. L'insulina ha un effetto promotore della crescita. Il selenio è presente anche nella soluzione composita "insulina-transferrina-selenio", come selenito di sodio. Viene utilizzato principalmente come cofattore per proteine (seleno-) come la gluthatione perossidasi (GPX), come agente antiossidante supplementare nella coltura. In in vitro condrociti articolari, l'ITS sembra migliorare la proliferazione cellulare e la conservazione del fenotipo inibendo l'espressione genica correlata alla dedifferenziazione cellulare e alla differenziazione ipertrofica8. Fattori di crescita come il fattore di crescita dei fibroblasti-2 e il fattore di crescita trasformante-β1 vengono aggiunti al terreno di coltura. Sono utilizzati per indurre e regolare la differenziazione, la crescita, la guarigione e lo sviluppo cellulare2,3. FGF-2 e TGF-β1 in combinazione promuovono anche potentemente la proliferazione cellulare in cellule e tessuti in coltura9.
Questo modello di maturazione in vitro della cartilagine articolare è utile per tre motivi principali. In primo luogo, la transizione accelerata della fase di sviluppo in questo modello ci permette di studiare i cambiamenti impercettibili che si verificano nell'arco di molti mesi in modelli in vivo, come l'elevata espressione della lislossidasi-L1 durante la maturazione10. In secondo luogo, l'ingegneria tissutale della cartilagine articolare soffre del fatto che viene prodotta una cartilagine con una morfologia e una struttura isotrope che è funzionalmente carente quando viene trapiantata nelle articolazioni per riparare i difetti focali. Capire come indurre cambiamenti maturativi accelererà lo sviluppo di dispositivi impiantabili completamente funzionali. In terzo luogo, e pertinente a questo studio, ci sono condizioni degenerative delle articolazioni come la malattia di Kashin-Beck che si verificano durante l'infanzia che portano a gravi deformità articolari in età adulta. Questa particolare malattia è fortemente associata ad aree geografiche (Cina) con carenze endemiche di selenio e iodio che potenzialmente colpiscono decine di milioni di abitanti 11,12,13. L'esame dei difetti scheletrici nella malattia di Kashin-Beck mostra che si verifica peri-puberale, implicando la perturbazione dei processi di maturazione scheletrica. Pertanto, per comprendere ulteriormente il ruolo del selenio nella cartilagine articolare (AC) è necessario un modello robusto per la crescita e lo sviluppo della cartilagine. Un modello di maturazione indotto da fattori di crescita in vitro fornisce un utile punto di partenza per studi sulla crescita e il metabolismo della cartilagine articolare durante la maturazione in presenza o assenza di ioni selenio 14,15,16. La nostra conoscenza degli effetti della carenza di selenio (Se) su processi biologici complessi e interconnessi rimane molto scarsa. Il problema principale risiede nel fatto che il selenio rimane un elemento da studiare a causa del suo range d'azione ristretto (concentrazione richiesta tra 40 e 400 μg/kg17) e della concentrazione molto bassa in gioco. Il modello di maturazione accelerata che utilizza la cartilagine bovina immatura offre una capacità senza precedenti di osservare i cambiamenti biologici che si verificano durante un'importante fase di sviluppo. La concentrazione di Se negli organismi è strettamente controllata e questo modello è un punto di partenza per sviluppare tecniche di imaging che ne consentano il tracciamento preciso durante la maturazione. Queste tecniche potrebbero quindi essere un potente strumento per studiare strategie per prevenire la degradazione dell'AC e potenzialmente per sviluppare le basi di nuove terapie basate sulla medicina rigenerativa.
La visualizzazione simultanea delle alterazioni dei tessuti molli, della cartilagine e dell'osso è una sfida importante nelle modalità di imaging preclinico convenzionali. Questo sarebbe davvero un aiuto importante per il follow-up della malattia articolare18,19 . Ad esempio, la micro tomografia computerizzata a raggi X convenzionale (μCT) presenta scarse prestazioni per i tessuti molli che ne limitano l'uso alla rappresentazione di difetti ossei, osteofiti e visualizzazione indiretta della cartilagine. La risonanza magnetica (MRI), d'altra parte, è convenzionalmente impiegata per l'imaging dei tessuti molli nonostante la sua scarsa capacità di rendere con precisione i cambiamenti nell'osso (ad esempio, microcalcificazioni) durante le fasi iniziali delle malattie. La capacità di essere sensibili alle ossa e alle cartilagini e di distinguere le cellule costitutive della cartilagine, i condrociti, è di enorme importanza. L'imaging a contrasto di fase (PCI) si basa sulla proprietà che l'indice di rifrazione dei raggi X dei materiali può essere mille volte maggiore dell'indice di assorbimento per gli elementi leggeri. Ciò genera un contrasto più elevato per i tessuti molli rispetto ai metodi convenzionali basati sul solo assorbimento. Pertanto, la PCI è in grado di visualizzare tutti i tessuti che costituiscono l'articolazione con una rappresentazione concomitante sia di tessuti altamente assorbenti (ad esempio, ossa) che di tessuti meno assorbenti (ad esempio, cartilagine fibrosa, legamenti, tendini, menisco e tessuti molli associati (membrane sinoviali e muscoli))18,19,20,21.
Come dimostrato in ref.20, la PCI a raggi X supera le altre modalità di imaging preclinico per la cartilagine. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare la procedura e di mostrare alcuni risultati rappresentativi. Lo schema dell'effetto dei fattori di crescita sull'espianto della cartilagine immatura è mostrato nella Figura 1.
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato per la Ricerca Etica dell'Università di Swansea e i materiali per biopsia sono stati acquisiti su licenza dal Dipartimento per l'Ambiente, l'Alimentazione e gli Affari Rurali (DEFRA), Regno Unito. Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali delle nostre istituzioni.
1. Espiantare colture
- Preparazione degli espianti dal cuoio capelluto delle zampe bovine
- Preparare un protettivo assorbente e un bisturi, bisturi chirurgico standard con lama di bisturi #10.
- Spruzzare tutti i materiali con una soluzione di etanolo al 70%.
- Immergere la coscia bovina (manzi bovini maschi di 7 giorni ottenuti dal macello con approvazione veterinaria) con acqua per eliminare tutto il sangue e il fango.
- Pulisci la gamba con sapone e strofina con una spazzola.
- Se adeguatamente pulito, spruzzare la gamba con etanolo al 70%.
- Mettetelo su carta assorbente.
- Taglia intorno ai piedi con un bisturi.
- Traccia una linea delicata lungo la lunghezza della gamba.
- Prestare particolare attenzione nella zona articolare.
- Rimuovere con cura la pelle della gamba lungo la linea del bisturi longitudinale.
- Metti i rifiuti (pelle, fazzoletti usati, carta e guanti) in un sacchetto per rifiuti clinici.
- Pulire/spazzolare la gamba con sapone e sterilizzare nuovamente con etanolo quando la pelle è stata rimossa.
- Non danneggiare la regione vicino alla cavità articolare. Se la cavità è aperta o danneggiata da infiltrazioni di sangue, non è più sterile e la gamba non può essere utilizzata.
- Metti la coscia in un foglio di alluminio che è stato spruzzato con etanolo al 70%.
- Posizionare i guanti in lattice di dimensioni adeguate sulle estremità della gamba per evitare la fuoriuscita di sangue dall'estremità prossimale o la possibile contaminazione dallo zoccolo.
- Smaltire i materiali di scarto in modo appropriato seguendo le regole istituzionali.
- Estrazione e coltura dell'espianto
NOTA: Gli espianti devono essere ricavati dalla parte interna del giunto (Figura 2, due prime tappe). Per essere in condizioni comparabili, quattro (o sei) espianti devono essere punzonati dalla stessa zona per applicare i quattro (o sei) diversi trattamenti su campioni che possiedono quasi la stessa forma e caratteristiche.- Aprire la cappa a flusso laminare 25 minuti prima dell'uso, pulire con alcool al 70%.
- Mettere il terreno di coltura a scaldare a bagnomaria.
- Preparare una piastra a 24 pozzetti con 1,5 mL di terreno basico, solo DMEM-F12 (mezzo di lavaggio) in ciascun pozzetto.
- Preparare un'altra piastra a pozzetti con 1,5 mL di terreno di coltura completo. Conservare in incubatrice di coltura a 37 °C fino all'uso
- Preparare il materiale su una griglia: un tubo universale con etanolo al 70% e un altro tubo universale con mezzo di lavaggio.
- Preparare un bisturi e un punzone per biopsia da 4 o 6 mm (inserito nel tubo universale per alcol).
- Metti i tubi e i materiali sotto la cappa.
- Metti un protettivo assorbente spruzzato con etanolo al 70% sotto il cofano.
- Preparare dei fazzoletti spruzzati con etanolo al 70%.
- Prendi una piastra di dissezione, coprila con un foglio di alluminio.
- Togliete dal frigo (4 °C) gli stessi piedini, precedentemente preparati, e spruzzateli con etanolo al 70%.
- Smaltire le sacche pericolose e cliniche vicino al cofano per sterilizzare in autoclave i rifiuti in un secondo momento.
- Spruzzare il piede con etanolo al 70%.
- Muovi l'articolazione per trovare la linea mediana dell'articolazione in cui deve essere praticata l'incisione. Fallo sotto il cofano.
- Prendi il bisturi sterile.
- Tagliare con cura lungo la linea mediana seguendo il contorno dei bordi del giunto. Non toccare la cartilagine del condilo mediale dell'articolazione metacarpo-falangea.
- Tagliare con cura il legamento quando l'articolazione è aperta.
- Gettare via la parte inferiore dei piedi in un sacchetto per autoclave.
- Rimuovere tutti gli altri tessuti in modo da esporre tutta la cartilagine dell'articolazione (Figura 2).
NOTA: Fare attenzione a non toccare nulla con i piedini. - Posizionare il bisturi e il punzone per biopsia nell'alcol e poi nel mezzo di lavaggio.
- Fai dei cerchi con questo pugno (4-5 per faccia) con una certa forza lungo le facce interne delle ossa.
- Al termine, immergere il bio-punch nell'alcool per pulirlo.
- Prendi un bisturi e taglia (traccia una linea) tra ogni cerchio e lungo la linea centrale dell'osso.
- Per estrarre l'espiante di cartilagine tagliare verticalmente su uno dei bordi della biopsia circolare, quindi tagliare orizzontalmente sull'osso subcondrale con molta attenzione.
- Per rimuovere l'espiante di cartilagine tagliato orizzontalmente sotto la linea di perforazione lungo l'osso subcondrale e la cartilagine calcificata, gli espianti usciranno.
NOTA: Gli espianti dovrebbero avere uno spessore uniforme, se possibile. - Posizionare l'espianto nella piastra a pozzetti riempita con 1,5 ml di terreno di lavaggio.
NOTA: Eseguire sempre il controllo sperimentale e il trattamento degli espianti provenienti dalla stessa posizione nel giunto. - Verificare che l'espiantazione sia ben orientata correttamente. La superficie dell'espianto deve essere rivolta verso l'alto e la parte ossea subcondrale dell'espiante deve essere rivolta verso il fondo della piastra a pozzetti.
- Tenere chiusa la piastra del pozzetto tra una biopsia e l'altra.
- Rimuovere il mezzo di lavaggio.
- Lavare nuovamente con mezzo di lavaggio. Lasciare in lavatrice per 2-3 ore. Residui ossei, il sangue avrà il tempo di fluire nel mezzo.
- Trasferire gli espianti in una nuova piastra a pozzetti contenente il terreno di coltura completo. Attenzione: non toccare nulla con la pipetta.
- Verificare che gli espianti siano ancora nella posizione corretta (l'osso è rivolto verso la parte inferiore della piastra a pozzetti).
- Pulisci tutto e getta via i rifiuti clinici in un luogo adeguato.
- Una volta che gli espianti sono stati posti in coltura in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2, cambiare il terreno di coltura dell'espiante ogni due giorni con un terreno caldo e fresco per soddisfare le diverse esigenze delle cellule/tessuti. Verificare che gli espianti siano ancora nella posizione corretta (l'osso è rivolto verso la parte inferiore della piastra a pozzetti).
- Fissaggio del campione (opzionale)
NOTA: Eseguire questo passaggio solo dopo la fine della coltura cellulare, ovvero dopo 3 settimane di coltura. Gli espianti hanno poi raggiunto lo stadio di maturazione.- Lavare gli espianti con DMEM-F12 con una pipetta sotto la cappa di coltura tissutale.
- Lavare gli espianti due volte con PBS con una pipetta sotto la cappa di coltura tissutale.
- Fissarli per una notte a 4 °C immergendoli in NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline Salline) al 10%.
- Posizionare gli espianti fissi in PBS in una provetta da microcentrifuga
- Conservare gli espianti a 4 °C. Gli espianti fissi possono rimanere in queste condizioni fino a 6 mesi.
2. Preparazione del campione per la sessione di imaging
- Utilizzare punte coniche in plastica di dimensioni adeguate (solitamente punte da 1 ml) rispetto al campione e al campo visivo della telecamera.
- Sigillare la punta del cono (riscaldandola con una fiamma) in modo da avere un contenitore per campioni impermeabile.
- Riempi la punta con PBS. Tenere il campione con una pinzetta e inserirlo nel tubo. Rimuovere la bolla d'aria agitandola lentamente.
- Montare il tubo sul tavolino tomografico e allinearlo effettuando semplici radiografie.
3. Sessione di imaging a contrasto di fase a raggi X
- Posizionare il rilevatore a 2,5 m dal campione
- Impostare l'energia del fotone dei raggi X a 17 keV utilizzando un sistema a cristalli di silicio doppio all'interno di una geometria di Bragg-Bragg.
- Il rivelatore Mount Imaging consisteva in una fotocamera CMOS scientifica22 su un'ottica con una dimensione del voxel isotropa risultante di 3,5 μm nell'immagine 3D.
- Utilizzare uno schermo scintillatore di ossisolfuro di gadolinio di 60 μm di spessore per convertire i raggi X in luce visibile
- Raccolta dati: Acquisizione di 2000 proiezioni durante una scansione a 360° del campione con un tempo di esposizione di 2 s per ogni proiezione.
- Utilizzare un algoritmo di recupero di fase per estrarre il segnale di fase come descritto in ref.23. L'algoritmo utilizza una conoscenza a priori della complessa distribuzione dell'indice di rifrazione all'interno del campione. L'ipotesi principale, non verificata qui, è che ci sia un materiale da ricostruire. In questo caso particolare, il rapporto tra la rifrazione e l'indice di assorbimento è stato fissato a 1.200 che è stato osservato sperimentalmente con il miglior compromesso per la visualizzazione di ossa e cartilagini.
- Utilizza l'algoritmo standard di ricostruzione CT a retroproiezione filtrata utilizzando un'implementazione open source basata su GPU (Graphics Processing Unit) del codice PyHST224.
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Risultati
È stata utilizzata una semplice configurazione di imaging basata sulla propagazione25 , come illustrato nella Figura 3. Nell'imaging basato sulla propagazione del sincrotrone, un fascio di raggi X coerente illumina l'oggetto, dando origine a sfasamenti spazialmente variabili19. Quando il fascio di raggi X si propaga dopo il campione, il fronte d'onda distorto genera un modello caratteristico. Analizzando questi pattern caratteristici con algori...
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Discussione
Abbiamo presentato uno studio completo dalla preparazione del campione alla visualizzazione dell'immagine, compresi i protocolli di acquisizione dati, per lo studio della cartilagine articolare in vitro a maturazione rapida. I risultati di una sessione di imaging al sincrotrone hanno mostrato la bontà del modello.
Nel modello qui presentato vanno menzionate alcune osservazioni e limiti. Questa "maturazione accelerata" avviene entro 21 giorni dalla col...
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano l'ESRF per aver fornito il beamtime interno. Gli autori ringraziano Eric Ziegler per le discussioni scientifiche. L'esperimento PCI descritto è stato condotto presso la linea di fascio BM05 dell'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, Francia. CB ringrazia Explora'doc Auvergne Rhone Alpes e le borse di studio dell'Università di Swansea e dell'Université Grenoble Alpes per aver finanziato parte di questo studio.
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Materiali
Dispositivi di protezione:
di RNasi, DNasi, DNA e DNA rilevabili ottico per bisturi Cappa visiera guanti camice da laboratorio occhiali di sicurezza
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale : Prodotti biologici | |||
| DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mL | Gibco by life technologies | 31331-028 | |
| Soluzione di reagente gentamicina, 50 mg/mL | Gibco by life technologies | 15750-060 | |
| HEPES, preparazione speciale, 1M, pH 7,5 filtrato | Sigma | H-3375 | |
| ITS, insulina-transferrina-selenio | Gibco di life technologies | 51500-057 | |
| Acido L-ascorbico-2-fosfato, sesquimagnesio salf idrato, 95% | Sigma | A8960-5G | |
| Formalina tampone neutra (NBF) | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7.4 | Gibco di life technologies | 10010023 | |
| Attrezzature per la cultura: | |||
| Protettore assorbente, Benchkote | WhatmanTM | Cat n. 2300731, | supporto in polistirene, 460 cm * 50 m |
| Accurpette VWR | |||
| Autoclavabile Sacchetto | per lo smaltimentoPer lo smaltimento di plastica contaminata, il collo degli articoli da laboratorio deve essere lasciato aperto per consentire la penetrazione del vapore, Rifiuti pericolosi, STERILIN (sacchetto bianco) | ||
| punzoni per biopsia | MILTEX di KAI | ref 33-36 | Diametro di 4 e 6 mm |
| Rifiuti clinici per trattamenti alternativi Medium Duty | (peso approvato ONU 5 kg, Metodi di non chiusura, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (sacchetto arancione) | ||
| Provette | EppendorfProvette Falcon da 0,5 ml e 1,5 ml | ||
| 15 ml e 50 ml prive | |||
| Pyrogens 1000ul Bevelled Graduato, punta del filtro | Starlab, TipOne (sterile) | S1122-1830 | |
| privo di RNasi, DNasi, DNA e RNasi rilevabili; Pirogeni 20µ l Smussato Graduato, punta del filtro | Starlab, TipOne (sterile) | S1120-1810 | |
| privo di RNasi, DNasi, DNA e DNA rilevabili Pyrogens 200ul Smussato Graduato, punta filtro | Starlab, TipOne (sterile) | S1110-1810 | |
| Incubatore | Incubatore a 37 gradi; C, atmosfera umidificata con il 5% di CO2 | ||
| Microscopio | |||
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL- e 5mL pipette sterili in plastica | ||
| Pipette (25-10-5 ml) | CellStar, Greiner Bio-one | ||
| Pinzette in plastica | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| Punte | |||
| P1000, P200 e P10 con puntali P1000, P200 e P10 (sterili) | |||
| per coltura tissutale | |||
| Pompa a vuoto Bagno | |||
| d'acqua 37 gradi; Piastre a pozzetti C | |||
| Piastre a 12 e 24 pozzetti | |||
| Apparecchiature per l'acquisizione dati: | |||
| Fiji software | open source Software | ||
| toolkit di ricostruzione | PyHST software open source |
Riferimenti
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