Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Il tessuto adiposo bianco (WAT) rappresenta il sito principale per l'accumulo di energia nei mammiferi. All'interno di questo tessuto, gli adipociti, o "cellule adipose", immagazzinano le calorie in eccesso sotto forma di trigliceridi, impacchettati in grandi goccioline lipidiche uniloculare. Inoltre, gli adipociti secernono una moltitudine di fattori che regolano vari aspetti dell'omeostasi energetica ^1,2,3. Gli adipociti costituiscono la maggior parte del volume di WAT; tuttavia, gli adipociti rappresentano solo meno del 50% del totale delle cellule presenti in WAT ^4,5. Il compartimento non adipocitario della WAT, o frazione stromale-vascolare (SVF), è piuttosto eterogeneo e contiene cellule endoteliali vascolari, cellule immunitarie residenti nei tessuti, fibroblasti e popolazioni di cellule precursori degli adipociti (APC).

WAT è eccezionale nella sua notevole capacità di espandersi in termini di dimensioni con l'aumento della domanda di accumulo di energia. Il mantenimento di questa plasticità tissutale è essenziale in quanto un'adeguata conservazione dei lipidi nel WAT protegge dalla deposizione deleteria di lipidi ectopici nei tessuti non adiposi⁶. Il modo in cui i singoli depositi WAT subiscono questa espansione in risposta all'eccesso calorico è un determinante critico della sensibilità all'insulina nel contesto dell'obesità⁷. L'espansione patologica del WAT, osservata in individui obesi con sindrome metabolica, è caratterizzata da un'espansione preferenziale dei depositi viscerali di WAT a scapito del tessuto adiposo sottocutaneo metabolicamente favorevole. Inoltre, l'insulino-resistenza nell'obesità è associata al rimodellamento patologico del WAT. Questo è caratterizzato da crescita ipertrofica degli adipociti esistenti (aumento delle dimensioni), angiogenesi inadeguata, infiammazione metabolica cronica, accumulo di componenti della matrice extracellulare (fibrosi) e ipossia tissutale ^8,9. Questi fenotipi WAT dell'obesità sono associati alla steatosi epatica e all'insulino-resistenza, in modo simile a quanto osservato nella condizione di lipodistrofia (assenza di WAT funzionale). Al contrario, l'espansione sana del WAT si osserva nella popolazione obesa metabolicamente sana ed è caratterizzata da un'espansione preferenziale del WAT sottocutaneo protettivo e dall'espansione del deposito attraverso l'iperplasia degli adipociti¹⁰. Il reclutamento di nuovi adipociti è mediato dalla differenziazione de novo degli adipociti dalle cellule precursori degli adipociti (APC) (definita "adipogenesi"). L'iperplasia degli adipociti coincide con gradi relativamente più bassi di fibrosi WAT e infiammazione metabolica ^6,11. Una moltitudine di tipi di cellule all'interno del microambiente WAT influenza direttamente la salute e l'espandibilità del WAT nell'obesit๲. Pertanto, la definizione della funzione dei vari tipi di cellule presenti nel WAT rimane una priorità assoluta per il campo.

Nell'ultimo decennio, sono state impiegate diverse strategie per definire e isolare APC native da WAT SVF¹³ umano e murino. Tali strategie isolano le APC in base all'espressione sulla superficie cellulare di comuni marcatori di cellule mesenchimali/cellule progenitrici utilizzando tecniche di separazione cellulare basate su anticorpi. Questi approcci includono la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), utilizzando anticorpi marcati con fluorofori o la separazione immunomagnetica delle microsfere (cioè anticorpi chimicamente modificati). Le proteine della superficie cellulare bersaglio per l'isolamento delle APC includono PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Questi approcci hanno contribuito ad arricchire le APC; Tuttavia, le popolazioni cellulari isolate sulla base di questi marcatori sono piuttosto eterogenee. Recentissimi studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno evidenziato l'eterogeneità molecolare e funzionale delle cellule stromali all'interno della frazione stromale-vascolare isolata (SVF) del WAT murino 14,15,16,17. Dalle nostre analisi funzionali e scRNA-seq, abbiamo identificato e caratterizzato sottopopolazioni di cellule perivascolari PDGFRβ+ adipogeniche immunomodulanti e adipogeniche funzionalmente distinte nel compartimento stromale del WAT intra-addominale in topi adulti¹⁵. I precursori fibro-infiammatori, o FIP, rappresentano una sottopopolazione importante di cellule PDGFRβ+ e possono essere isolati in base all'espressione di LY6C (cellule LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. Le FIP mancano di capacità adipogenica, esercitano una forte risposta pro-infiammatoria a vari stimoli, producono collagene e secernono fattori anti-adipogenici¹⁵. L'attività pro-infiammatoria e fibrogenica di queste cellule aumenta in associazione con l'obesità nei topi, implicando queste cellule come regolatori del rimodellamento del WAT. La sottopopolazione LY6C- CD9- PDGFRβ+ rappresenta le cellule precursori degli adipociti (APC). Queste APC sono arricchite nell'espressione di Pparg e di altri geni pro-adipogenici e si differenziano facilmente in adipociti maturi in vitro e in vivo¹⁵. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di queste distinte popolazioni cellulari da depositi WAT intra-addominali di topi adulti utilizzando FACS e separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare sottopopolazioni progenitrici adipose funzionalmente distinte da più depositi WAT intra-addominali di topi adulti maschi e femmine¹⁵. Lo studio di queste popolazioni cellulari funzionalmente distinte in isolamento può contribuire notevolmente alla nostra attuale comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l'adipogenesi e il rimodellamento del tessuto adiposo intra-addominale in salute e malattia.

Il protocollo seguente descrive in dettaglio l'isolamento dei progenitori adiposi dal WAT dell'epididimo murino; tuttavia, la stessa procedura può essere utilizzata per isolare le cellule corrispondenti dai depositi WAT mesenterico e retroperitoneale di topi maschi e femmine¹⁵. Un protocollo dettagliato su come identificare e isolare questi depositi nei topi può essere trovato in Bagchi et ^al.18. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso di topi di 6-8 settimane di età. La frequenza e la capacità di differenziazione delle APC possono diminuire in associazione con l'invecchiamento.

Tutti i protocolli e le procedure per gli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas.

1. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo bianco gonadico

1. Sezionare il tessuto adiposo bianco gonadico da topi di 6-8 settimane e posizionare i cuscinetti adiposi in 1x soluzione PBS.
2. Combinare fino a 4 depositi di grasso (consigliati 2-4 depositi da 1-2 topi) e tritare il tessuto in un becher da 10 ml contenente 200 μl di tampone di digestione (1x HBSS, 1,5% BSA e 1 mg/mL di collagenasi D).
3. Trasferire il tessuto macinato in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml di tampone per la digestione.
4. Incubare la miscela a 37 °C a bagnomaria per 1 ora agitando.
5. Filtrare il tessuto digerito attraverso un colino cellulare da 100 μm per rimuovere il tessuto non digerito.
6. Diluire il campione filtrato a 30 mL con PBS contenente il 2% di FBS e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante, che contiene adipociti maturi.
7. Procedere immediatamente al metodo di isolamento cellulare preferito.

2. Isolamento di APC e FIP mediante FACS

1. Sciogliere il pellet in 1 mL di tampone di lisi 1x RBC agitando delicatamente la provetta.
2. Incubare a RT per 1-2 min.
3. Aggiungere 10 mL di FBS/PBS al 2% e passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL.
4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
5. Aspirare il terreno e risospendere il pellet in 400-800 μl di FBS/PBS al 2% contenente blocco Fc (1:200).
6. Incubare a 4 °C per 10 min.
7. Trasferire 400 μL-800 μL di sospensioni cellulari contenenti ≤10⁶ cellule per mL in provette da 1,5 mL e aggiungere anticorpi. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella sezione Tabella dei materiali .
   1. Preparare provette di controllo separate per 1) cellule non colorate, 2) controlli a colore singolo e 3) controlli FMO (fluorescenza meno uno).
   2. Colorare i campioni con gli anticorpi PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
8. Incubare a 4 °C per 15 min al riparo dalla luce.
9. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
10. Aspirare i terreni e risospendere le cellule in 400 μl di FBS/PBS al 2%.
11. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
12. Aspirare i terreni e risospendere le cellule in 400-800 μL di FBS/PBS al 2%. Quindi passare attraverso i tappi del filtro da 40 μm in provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL per FACS.
13. Segui i seguenti passaggi per il gating.
    1. Utilizzare controlli non colorati e monocolore per la compensazione.
    2. Usa i controlli FMO per impostare i gate sperimentali.
    3. Utilizzare la strategia di gating illustrata nella Figura 1 per ottenere APC e FIP. Gate APCs come CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- e FIP come cellule CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ .
14. Raccogliere le cellule selezionate in provette contenenti 500 μl di siero al 100% e mantenere le cellule in ghiaccio.
15. Centrifugare le celle a 600 x g per 5 min a 4 °C. Aggiungere il 2% di FBS/PBS per lavare le celle centrifugando nuovamente a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando le pile pellettate.
16. Risospendere le cellule pellettate nel volume appropriato di terreno di coltura APC gonadico (per coltura cellulare) o tampone appropriato per l'analisi successiva.

3. Separazione immunomagnetica delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche

1. Isolare la SVF dal tessuto adiposo bianco gonadico seguendo i passaggi 1.1-1.7.
2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet SVF in 10 mL di 1x tampone MS disponibile in commercio.
3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
5. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 100 μl di 1x MS Buffer.
6. Eseguire la deplezione delle cellule CD31⁺ e CD45⁺ come discusso di seguito (Figura 2A, Passaggio 1). Questo viene fatto per rimuovere le cellule del lignaggio endoteliale ed ematopoietico.
   1. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e regolare la concentrazione a ≤ 1 x 10⁸ cellule/mL.
   2. Aggiungere gli anticorpi CD31 e CD45 coniugati con biotina alla sospensione cellulare, ciascuno a una concentrazione di ≤ 0,25 μg per 10⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
   3. Lavare le celle aggiungendo 4 mL di 1x MS Buffer.
   4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
   5. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 100 μL di tampone 1x MS.
   6. Aggiungere 10 μL di nanosfere di streptavidina e incubare le cellule su ghiaccio per 15 minuti.
   7. Lavare le celle aggiungendo 4 mL di tampone 1x MS.
   8. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi aspirare il surnatante.
   9. Risospendere le cellule in 2,5 mL di 1 tampone MS e trasferirle in una provetta in polipropilene da 5 mL.
   10. Posizionare il tubo nella rastrelliera magnetica per 5 minuti.
   11. Raccogliere le cellule non marcate versando la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga pulita da 15 mL.
       NOTA: Evitare di scuotere o asciugare le goccioline pendenti in quanto ciò porta alla contaminazione da frazione cellulare indesiderata.
   12. Rimuovere il tubo dal magnete e ripetere i passaggi 3.6.9. al punto 3.6.11. altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
7. Separazione delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche (Figura 2A, Fase 2)
   1. Continua a lavorare con la frazione non etichettata (cioè la frazione CD45^- CD31^- ).
   2. Centrifugare la provetta da 15 mL contenente cellule non marcate a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
   3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di tampone 1x MS.
   4. Aggiungere rispettivamente gli anticorpi LY6C coniugati con biotina e CD9 a una concentrazione di ≤ 0,25 μg per 10⁶ cellule e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
   5. Seguire i passaggi 3.6.3. al punto 3.6.12. per completare la seconda separazione.
   6. Raccogli le frazioni non legate. Le cellule non marcate (LY6C^- CD9^-) rappresentano la frazione adipogenica contenente APC (Figura 2A, Fase 3).
   7. Rimuovere la provetta dal magnete, risospendere ed eluire le cellule legate in 1x tampone MS. Gli eluati o frazione marcata (LY6C⁺ CD9⁺), rappresentano la frazione non adipogenica contenente FIP (Figura 2A, Fase 3).
   8. Centrifugare frazioni marcate e non marcate a 600 x g per 5 minuti in celle a pellet a 4 °C.
8. Procedere immediatamente alla coltura cellulare (fase 6) o utilizzare precursori indifferenziati per le analisi preferite (fase 4 e/o fase 5).

4. Valutare la purezza delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche mediante citometria a flusso

1. Risospendere frazioni cellulari isolate da microsfere in 200-400 μL di blocco FBS/PBS al 2% contenente Fc (1:200).
2. Incubare a 4 °C per 10 min.
3. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 mL e aggiungere gli anticorpi. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella Tabella dei materiali.
   1. Preparare provette di controllo separate per 1) cellule non colorate, 2) controlli a colore singolo e 3) controlli FMO.
   2. Ai campioni, aggiungere gli anticorpi CD45, CD31, CD9 e LY6C.
4. Incubare a 4 °C per 15 min al riparo dalla luce.
5. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 400 μL di FBS/PBS al 2%.
7. Centrifugare la sospensione a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
8. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 400-800 μL di FBS/PBS al 2%. Filtrare attraverso tappi filtranti da 40 μm in provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL per l'analisi mediante citometria a flusso.
9. Analisi di citometria a flusso per valutare la purezza
   1. Utilizzare controlli non colorati e monocolore per la compensazione.
   2. Usa i controlli FMO per impostare i gate sperimentali.
   3. Utilizzare la strategia di gating per celle vive e singole come mostrato nella Figura 2B.
   4. Eseguire il gating come mostrato nella Figura 2B per CD45, CD31, LY6C e CD9.
   5. Utilizzare il software di citometria a flusso per valutare le frequenze ^{delle cellule} CD45^, CD31^, LY6C^, CD9 (APC) e delle cellule CD45^, CD31^, LY6C⁺ (FIP) all'interno di frazioni isolate.

5. Analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa per valutare la purezza di FIP e APC

1. Estrarre l'mRNA da cellule isolate magneticamente o FACS utilizzando il kit di estrazione disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
2. Utilizzare 1 μg di RNA per sintetizzare il cDNA utilizzando un kit per la trascrittasi inversa del cDNA (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
3. Determinare i livelli relativi di mRNA dei geni selettivi per APC e FIP (Tabella 1) mediante PCR quantitativa utilizzando il master mix SYBR green PCR.
   1. Impostare la reazione del campione per la PCR come segue: 5 μL di 2x colorante verde SYBR, 1 μL di cDNA (~50 ng/μL), 0,5 μL di ciascun primer diretto e inverso (10 μM) e 3 μL di acqua.
   2. Utilizzare le seguenti condizioni standard di PCR per l'esecuzione quantitativa della PCR: fase di mantenimento: 50 °C per 2 min, 95 °C per 10 min; Fase PCR (40 cicli): 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min.
4. Normalizzare i valori ai livelli del gene house-keeping (Rps18) calcolando ΔΔ-Ct.
5. Per valutare la significatività statistica, eseguire il test t di Student non accoppiato.

6. Colture cellulari e differenziamento

1. Centrifugare magneticamente o celle isolate FACS a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura APC gonadico e piastra 40K cellule/pozzetto da ciascuna frazione in una piastra di coltura a 48 pozzetti.
3. Sostituire il supporto ogni 1-2 giorni. Le APC inizieranno a differenziarsi in adipociti man mano che si avvicinano alla confluenza. Le FIP mantenute nello stesso terreno sono resistenti all'adipogenesi.

Questo protocollo descrive due strategie che consentono l'isolamento di popolazioni di cellule stromali distinte da depositi WAT intra-addominali di topi adulti. Le APC e le FIP possono essere isolate mediante FACS (Figura 1) o separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati (Figura 2). Entrambi gli approcci utilizzano reagenti e anticorpi tutti disponibili in commercio. La separazione immunomagnetica delle microsfere porta alla separazione delle cellule adipogeniche da quelle non adipogeniche dalla gWAT SVF. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che il 75% delle cellule all'interno della frazione adipogenica rappresentava APC LY6C-CD9-. >Il 75% della frazione non adipogenica rappresentava FIP (cellule LY6C+).

Figura 1: Isolamento di sottopopolazioni di PDGFR β + cellule stromali da WAT gonadiche mediante FACS. (A) Panoramica schematica della procedura: La frazione vascolare stromale (cellule non adipocitali) è stata separata dagli adipociti maturi mediante digestione enzimatica del tessuto e centrifugazione. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è stata quindi utilizzata per rimuovere le cellule di linea endoteliali (CD31+) ed ematopoietiche (CD45+) e isolare le cellule LY6C+ PDGFRβ+ (FIP) e le cellule LY6C-CD9- PDGFRβ+ (APC). (B) Cancelli di raccolta FACS rappresentativi. Il pannello A è riprodotto da ref.11 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Separazione di cellule stromali adipogeniche e non adipogeniche mediante separazione immunomagnetica delle sfere. (A) Panoramica schematica della procedura: Fase 1: le cellule CD31+ e CD45+ si legano al magnete. Questo rimuove sia le cellule endoteliali che quelle ematopoietiche. L'eluato contenente cellule CD31 e CD45 è stato raccolto e quindi incubato con anticorpi che riconoscono rispettivamente LY6C e CD9. Passaggio 2: le cellule CD9+ e LY6C+ si legano al magnete. Fase 3: Il surnatante (frazione non legata) contenente le cellule CD9 e LY6C è stato raccolto in quanto rappresentava la frazione adipogenica (APC). Le cellule CD9+ e LY6C+ non adipogeniche legate alle nanosfere sono state eluite come frazione non APC contenente FIP. (B) Analisi di citometria a flusso per valutare la frequenza di APCs (LY6C- CD9-) e FIPs (LY6C+) all'interno di frazioni adipogeniche e non adipogeniche, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La microscopia ottica e l'analisi dell'espressione genica dimostrano che le APC isolate mediante FAC o attraverso la separazione di biglie magnetiche da gWAT di topi di 6-8 settimane si sono differenziate in adipociti contenenti lipidi ad un grado elevato entro 7-10 giorni dalla placcatura iniziale delle cellule in terreni di coltura APC gonadici (Figura 3). Al contrario, i precursori non adipogenici (come i precursori fibro-infiammatori o FIP) sono rimasti simili ai fibroblastie non diventano adipociti se mantenuti nello stesso terreno di coltura (Gonadal APC Culture Media) (Figura 3). Va notato che poche cellule nelle colture non-APCs hanno mostrato un certo accumulo di lipidi (Figura 3D). Questi probabilmente derivano dalla contaminazione da APC durante l'isolamento cellulare. Ulteriori lavaggi potrebbero migliorare la purezza di questa frazione.

Figura 3: Differenziazione in vitro di PDGFR β + popolazioni di cellule stromali isolate da gWAT di topi adulti. (A-D) Immagini rappresentative in campo chiaro di sottopopolazioni di cellule stromali differenziate isolate mediante separazione di microsfere immunomagnetiche (AB) o FACS (CD) da gWAT SVF di topo di 6-8 settimane. Le immagini sono state scattate sette giorni dopo la pianura delle cellule in Gonadal APC Culture Media. Entro 7-10 giorni dalla piastra, le APC vanno incontro a una differenziazione spontanea degli adipociti. Ingrandimento 10X. Scala = 250 μM. (E-F) Livelli di mRNA di geni selettivi per gli adipociti in colture differenziate mostrate in A-D. I grafici a barre rappresentano media + SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: sequenze di primer qPCR utilizzate per convalidare l'isolamento di FIP e APC

T.A.P. è un dipendente e azionista di Novo Nordisk A/S