Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Summary

La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

Abstract

L'immunoistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche strutture tissutali, nonché l'espressione e la localizzazione delle proteine. Due approcci alternativi sono ampiamente utilizzati per gestire le sezioni di tessuto durante la procedura di colorazione, un approccio consiste nel montare le sezioni direttamente su vetrini, mentre un secondo approccio, il free-floating, consente di mantenere e colorare le sezioni fisse mentre sono sospese in soluzione. Sebbene gli approcci montati su scorrimento e fluttuanti possano produrre risultati simili, la tecnica free-floating consente una migliore penetrazione degli anticorpi e quindi dovrebbe essere il metodo di scelta quando sezioni più spesse devono essere utilizzate per la ricostruzione 3D dei tessuti, ad esempio quando l'obiettivo dell'esperimento è ottenere informazioni sulle proiezioni dendritiche e assonali nelle regioni del cervello. Inoltre, poiché le sezioni sono mantenute in soluzione, una singola aliquota può facilmente ospitare da 30 a 40 sezioni, la cui gestione è meno laboriosa, in particolare negli studi biomedici su larga scala. Qui, illustriamo come applicare il metodo free-floating alla colorazione immunoistochimica fluorescente, con particolare attenzione alle sezioni cerebrali. Discuteremo anche di come la tecnica del flottante libero possa essere facilmente modificata per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori e adattata ad altri tessuti, nonché ad altre colorazioni a base istochimica, come l'ematossilina e l'eosina e il violetto cresilico, purché i campioni di tessuto siano correttamente fissati, tipicamente con paraformaldeide o formalina.

Introduction

L'immunocolorazione è una pratica di ricerca popolare iniziata 130 anni fa con la scoperta degli anticorpi sierici nel 1890 da parte di Von Behring¹. Durante i primi anni del 20^° secolo, i coloranti furono attaccati agli antigeni e successivamente agli anticorpi come un modo per quantificare e visualizzare le reazioni¹, e nel 1941 Albert Coons sviluppò le prime etichette di anticorpi fluorescenti, una scoperta che rivoluzionò la microscopia ottica ^2,3. Il termine "immunocolorazione" comprende molte tecniche che sono state sviluppate utilizzando questo ....

Protocol

1. Preparazione tissutale per criosezione

1. Incorporare tessuti fissi in uno stampo di incorporamento appropriato (vedi Tabella dei materiali) per creare un blocco di campioni utilizzando una matrice di campioni appropriata (vedi Tabella dei materiali) e congelare su ghiaccio secco. Conservare i blocchi di campioni a -80 °C fino al momento della sezione.
   NOTA: I tessuti fissi sono tipicamente preparati perfondendo roditori maschi o femmine adulti (di circa 2,5 – 30 mesi) (topo o ratto)³⁴, in conformità con il permesso etico disponibile, con un fissativo appropriato (ad esempio formalina al 10%), segu....

Results

Lo schema generale dell'utilizzo del metodo free-floating per eseguire un test immunoistochimico fluorescente è illustrato nella Figura 1. Un esempio rappresentativo di IHC fluorescente che utilizza il metodo del fluttuante nel cervello di topo che esamina l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è mostrato nella Figura 2 sia a ingrandimento inferiore che superiore per illustrare la qualità complessiva della colorazione. Questo approccio è app.......

Discussion

L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica versatile che è diventata cruciale nell'identificazione dell'espressione e della localizzazione delle proteine all'interno delle sezioni tissutali. Questo test viene utilizzato in tutta la comunità scientifica per comprendere ulteriormente le caratteristiche del tessuto attraverso le fasi della normale funzione fino agli stati di malattia. IHC è impiegato in una varietà di campi dalla diagnosi clinica di malattie come il cancro alle scoperte iniziali nella ricerca preclinica

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a 12 pozzetti	Corning	3513
Piastre a 6 pozzetti	Corning	3516
Smalto trasparente	Preferenze dell'utente	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Stampi per inclusione	Thermo Scientific	1841
Glicole etilenico	Preferenze dell'utente	N/A
Soluzione di formalina	Fisher Scientific	SF98-4
Siero di cavallo, inattivato	a caldo Gibco	26050088
Scatole per vetrini per microscopia	Servizi di microscopia	elettronica 71370
PBS	Preferenza dell'utente	N/A
Anticorpo primario	Preferenza dell'utente	N/A
Vetrini coprioggetti rettangolari	VWR	48393-081	24 x 50 mm
di microscopia	elettronica	70312
Pennello rotondo per artisti #2	Princeton Select Series	3750R	Marca non importante
Anticorpo secondario	Preferenza dell'utente	N/A
Matrice campione per l'inclusione	di OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Vassoio antimacchia – sistema di colorazione per vetrini Servizi di	microscopia elettronica	71396-B	Utilizzare il coperchio scuro
Saccarosio	Preferenza dell'utente	N/A
Superfrost Plus Micro Vetrini	VWR	48311-703
TBS	Preferenza dell'utente	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield supporto di montaggio antisbiadimento	Vector Laboratories	H-1000	pozzetti non indurenti
per piastre a 12 pozzetti	Corning Netwells	3477
Inserti a pozzetti per piastre a 6 pozzetti	Corning Netwells	3479
Carta da filtro Whatman	Millapore-Sigma	WHA1440042