Qui è riportato un sistema per l'imaging del calcio nel comportamento libero di Caenorhabditis elegans con vibrazioni ben controllate e non localizzate. Questo sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento su scala nanometrica e di quantificare le correnti di calcio durante le risposte di C. elegans alle vibrazioni.
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Articolo metodologico
Imaging del calcio in Caenorhabditis elegans che si comporta liberamente con vibrazioni ben controllate e non localizzate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze meccaniche non localizzate, come le vibrazioni e le onde acustiche, influenzano un'ampia varietà di processi biologici dallo sviluppo all'omeostasi. Gli animali affrontano questi stimoli modificando il loro comportamento. Comprendere i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale richiede la quantificazione dell'attività neurale durante il comportamento di interesse. Qui, riportiamo un metodo per l'imaging del calcio nel comportamento libero caenorhabditis elegans con vibrazione non localizzata di frequenza, spostamento e durata specifici. Questo metodo consente la produzione di vibrazioni ben controllate e non localizzate utilizzando un trasduttore acustico e la quantificazione delle risposte calciche evocate a risoluzione a singola cellula. Come prova di principio, viene dimostrata la risposta al calcio di un singolo interneurone, AVA, durante la risposta di fuga di C. elegans alle vibrazioni. Questo sistema faciliterà la comprensione dei meccanismi neurali alla base delle risposte comportamentali agli stimoli meccanici.
Introduzione
Gli animali sono spesso esposti a stimoli meccanici non localizzati come vibrazioni o onde acustiche 1,2. Poiché questi stimoli influenzano l'omeostasi, lo sviluppo e la riproduzione, gli animali devono modificare i loro comportamenti per affrontarli 3,4,5. Tuttavia, i circuiti neurali e i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale sono poco compresi.
Il comportamento meccanosensoriale nel nematode, Caenorhabditis elegans, è un semplice paradigma comportamentale, in cui ....
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Protocollo
1. Coltivazione di vermi fino all'imaging del calcio
- Quattro giorni prima di un esperimento di imaging del calcio, trasferire due vermi ST12 adulti in una nuova piastra del mezzo di crescita del nematode (NGM) (Table of Materials) su cui Escherichia coli OP50 sono striati in uno schema quadrato (circa 4 mm x 4 mm) utilizzando uno spargitore cellulare in modo che il verme trascorra la maggior parte del tempo nei batteri durante l'imaging del calcio12.
- Incubare questa piastra NGM per 4 giorni a 20 °C in un incubatore (Tabella dei materiali).
2. Configur....
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Risultati
Qui, un worm che esprime sia GCaMP che TagRFP sotto il controllo del promotore specifico dell'interneurone AVA viene utilizzato come esempio di imaging del calcio nel comportamento libero di C. elegans. I dati dei canali GCaMP e TagRFP sono stati ottenuti come una serie di immagini, alcune delle quali sono mostrate nella Figura 6 e come filmato (Filmato supplementare 1). È stato anche quantificato lo spostamento della piastra di Petri indotto dal nostro sistema di v.......
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Discussione
Generalmente, la quantificazione dell'attività neurale richiede l'introduzione di una sonda e/o restrizioni sul movimento del corpo animale. Tuttavia, per gli studi sul comportamento meccanosensoriale, l'introduzione invasiva di una sonda e le restrizioni stesse costituiscono stimoli meccanici. C. elegans fornisce un sistema per aggirare questi problemi, perché le sue caratteristiche sono trasparenti e perché ha un circuito neurale semplice e compatto che comprende solo 302 neuroni. Combinando questi vantaggi co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center per aver fornito i ceppi utilizzati in questo studio. Questa pubblicazione è stata sostenuta da JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sul progetto "Science of Soft Robot" delle aree innovative (Grant no. JP18H05474), il PRIME dell'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (numero di sovvenzione 19gm6110022h001) e la fondazione Shimadzu.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software per l'analisi dei dati | |||
| DualViewImaging.nb | autore | Per l'analisi dei dati acquisiti | |
| Mathematica12 | Wolfram | Per l'esecuzione del software per l'analisi dei dati DualViewImaging | |
| Escherichia coli e C. elegans ceppi | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Cibo per C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) ceppo | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | ceppo mutante insensibile alla luce |
| lite-1(ce314) che esprime NLS-GCaMP-NLS e TagRFP sotto il controllo dell'autore del promotore specirico | AVA ST12 | lite-1(ce314) mutante che trasporta i geni che esprimono NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; segnale di localizzazione nucleare) e TagRFP sotto il controllo del promotore flp-18 come array extracorososomico | |
| Vibrometro Doppler laser | |||
| Lase | Polytec Japan | IVS-500 | Per quantificare la frequenza e lo spostamento generati dal trasduttore acustico |
| Sistema macro del mouse | |||
| Autore | Script per il controllo temporalmente e speciale del cursol del mouse in Windows | ||
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Software di download gratuito per il controllo del cursore del mouse basato su una piastra di crescita script |
| Nematode | |||
| Agar purificato, polvere | Nakarai tesque | 01162-15 | per preparazione di piastre NGM |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Cloruro di calcio | Wako | 036-00485 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Colesterolo | Wako | 034-03002 | Per la preparazione di piastre NGM |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Brodo LB, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Per la coltura di E. coli OP50 |
| Solfato di magnesio anidro | TGI | M1890 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Diidrogenofosfato di potassio | Nakarai tesque | 28720-65 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Cloruro di sodio | Nakarai tesque | 31320-05 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Piastre di Petri (60 mm) | Nunc | 150270 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Dispositivo di vibrazione non localizzata | |||
| Amplificatore | LEPY | LP-A7USB | Per la stimolazione con vibrazione controllabile |
| Trasduttore acustico | MinebeaMitsumi | LVC25 | Per la stimolazione con vibrazione controllabile |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Download gratuito del software per il controllo delle proprietà delle vibrazioni |
| imaging del calcio non invasivo | |||
| 2 canali da banco Servocontrollore CC brushless trifase | Thorlabs | BBD202 | Controller compatibile per stadi MLS203-1 |
| 479/585 nm Filtro passa-banda dual-band BrightLine | Semrock | FF01-479/585-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard a epifluorescenza dicroica beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 512/25 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine | Semrock | FF01-512/25-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 630/92 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine | Semrock | FF01-630/92-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 con CPU Intel Xeon ES-2630 e 8 GB di RAM |
| Stadio motorizzato x-y ad alta velocità | Thorlabs | MLS203-1 | Stadio di scansione XY veloce |
| Ottica di divisione delle immagini | Hamamatsu | fotonica A12801-01 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) generate da W-VIEW GEMINI Ottica di divisione delle immagini |
| Sorgente luminosa a LED | CoolLED | pE-4000 | Per la generazione di luce di eccitazione a 470 nm e 560 nm |
| Microscopio Fotocamera | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS | Andor | Zyla | |
| x 2 Obiettivo | Olympus | MVPLAPO2XC | Distanza di lavoro 20 mm e numerica apertura 0,5 |
| Plasmide | |||
| pKDK66 | autore | pKDK66 | Marcatore di co-iniezione |
| pTAK83 autore del plasmide | pTAK83 | Plasmide per l'espressione di TagRFP sotto il controllo del flp-18 promotore | |
| pTAK144 | plasmide autore | pTAK144 | Plasmide per l'espressione di NLS-GCaMP5G-NLS sotto il controllo di the flp-18 promoter |
| Tracking softwarehomingback.vi | |||
| autore | File SubVi per il tracciamento di un punto fluorescente di un worm attraverso il controllo del feedback della telecamera sCMOS e dello stadio motorizzato x-y | ||
| LabVIEW | National instruments | Per l'esecuzione del software | |
| di tracciamento Zyla Control ver.2.6CI.vi | autore | Per l'inseguimento di un punto fluorescente di un verme attraverso il controllo del feedback della fotocamera sCMOS e dello stadio motorizzato x-y |
Riferimenti
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M.
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Ristampe e permessi
