Qui è riportato un sistema per l'imaging del calcio nel comportamento libero di Caenorhabditis elegans con vibrazioni ben controllate e non localizzate. Questo sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento su scala nanometrica e di quantificare le correnti di calcio durante le risposte di C. elegans alle vibrazioni.
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Articolo metodologico
Imaging del calcio in Caenorhabditis elegans che si comporta liberamente con vibrazioni ben controllate e non localizzate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze meccaniche non localizzate, come le vibrazioni e le onde acustiche, influenzano un'ampia varietà di processi biologici dallo sviluppo all'omeostasi. Gli animali affrontano questi stimoli modificando il loro comportamento. Comprendere i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale richiede la quantificazione dell'attività neurale durante il comportamento di interesse. Qui, riportiamo un metodo per l'imaging del calcio nel comportamento libero caenorhabditis elegans con vibrazione non localizzata di frequenza, spostamento e durata specifici. Questo metodo consente la produzione di vibrazioni ben controllate e non localizzate utilizzando un trasduttore acustico e la quantificazione delle risposte calciche evocate a risoluzione a singola cellula. Come prova di principio, viene dimostrata la risposta al calcio di un singolo interneurone, AVA, durante la risposta di fuga di C. elegans alle vibrazioni. Questo sistema faciliterà la comprensione dei meccanismi neurali alla base delle risposte comportamentali agli stimoli meccanici.
Introduzione
Gli animali sono spesso esposti a stimoli meccanici non localizzati come vibrazioni o onde acustiche 1,2. Poiché questi stimoli influenzano l'omeostasi, lo sviluppo e la riproduzione, gli animali devono modificare i loro comportamenti per affrontarli 3,4,5. Tuttavia, i circuiti neurali e i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale sono poco compresi.
Il comportamento meccanosensoriale nel nematode, Caenorhabditis elegans, è un semplice paradigma comportamentale, in cui i vermi di solito cambiano comportamento dal movimento in avanti a una risposta di fuga all'indietro quando incontrano la vibrazione non localizzata6. Il circuito neurale alla base di questo comportamento è composto principalmente da cinque neuroni sensoriali, quattro coppie di interneuroni e diversi tipi di motoneuroni 7,8. Inoltre, i vermi si abituano a tali stimoli meccanici dopo un allenamento distanziato che comporta una stimolazione ripetuta 9,10,11. Pertanto, questa semplice risposta comportamentale costituisce un sistema ideale per studiare i meccanismi neurali alla base sia del comportamento evocato dalla vibrazione non localizzata che della memoria. Viene illustrato un protocollo per l'imaging del calcio in vermi che si comportano liberamente sotto l'influenza di vibrazioni non localizzate. Rispetto ai sistemi precedentemente segnalati, questo sistema è semplice in quanto non richiede una telecamera aggiuntiva per il tracciamento; tuttavia, ci consente di modificare la frequenza, lo spostamento e la durata della vibrazione non localizzata. Poiché l'attivazione degli interneuroni AVA induce la risposta di fuga all'indietro, i vermi che co-esprimono GCaMP, un indicatore di calcio, e TagRFP, una proteina fluorescente insensibile al calcio, sotto il controllo di un promotore specifico dell'AVA sono stati usati come esempio (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). Il protocollo dimostra l'attivazione dei neuroni AVA mentre un worm passa dal movimento in avanti a quello all'indietro. Questo protocollo facilita la comprensione del meccanismo del circuito neurale alla base del comportamento meccanosensoriale.
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Protocollo
1. Coltivazione di vermi fino all'imaging del calcio
- Quattro giorni prima di un esperimento di imaging del calcio, trasferire due vermi ST12 adulti in una nuova piastra del mezzo di crescita del nematode (NGM) (Table of Materials) su cui Escherichia coli OP50 sono striati in uno schema quadrato (circa 4 mm x 4 mm) utilizzando uno spargitore cellulare in modo che il verme trascorra la maggior parte del tempo nei batteri durante l'imaging del calcio12.
- Incubare questa piastra NGM per 4 giorni a 20 °C in un incubatore (Tabella dei materiali).
2. Configurazione hardware
- Preparare un microscopio dotato di un dispositivo piezoelettrico per la stimolazione13, una lente obiettivo 2x, una fotocamera sCMOS ad alta velocità, ottica di divisione delle immagini, uno stadio motorizzato x-y, una sorgente luminosa a LED per l'eccitazione e un computer (Figura 1). Le specifiche essenziali della fotocamera sCMOS includono 2560 x 2160 pixel attivi, dimensioni 6,5 μm, con un collegamento fotocamera a 10 tocchi come opzione di interfaccia. Le specifiche chiave dello stadio motorizzato X-Y includono un intervallo di corsa di 110 mm x 75 mm, una velocità massima di 250 mm/s, un'accelerazione massima di 2.000 mm/s2 e una ripetibilità unidirezionale di 0,25 μm.
- Accendere il computer e il controller dello stage motorizzato x-y.
- Accendere l'amplificatore e impostare il regolatore di volume su 10 e i regolatori di bassi e alti su 8.
- Per entusiasmare GCaMP e TagRFP, accendi le luci a 488 nm e 560 nm della sorgente luminosa a LED. Impostare gli indicatori di 470 nm e 550 nm del pod di controllo nella sorgente luminosa al 5% in modo che l'intensità della luce LED sia adatta per l'imaging.
NOTA: a questa intensità del LED, la fotosbiancamento della fluorescenza GCaMP e TagRFP non si verifica durante la registrazione.
3. Configurazione del software per l'imaging del calcio
- Scarica e installa tre pacchetti software in Windows: software macro del mouse, software per il controllo della proprietà delle vibrazioni, software per l'esecuzione del software di tracciamento e software per l'analisi dei dati (Tabella dei materiali).
- Fare doppio clic sul file del software di tracciamento.
- Premere il pulsante Esegui e attendere 5 minuti per stabilizzare il software (Figura 2A).
- Fornire le informazioni sul tempo di esposizione e sul binning. Il tempo di esposizione di 0,033 s con binning 2 x 2 garantisce un'acquisizione fluida delle immagini (Figura 2B).
NOTA: viene visualizzata solo ogni10a immagine acquisita per ridurre il carico di memoria. - Fornire le informazioni per l'acquisizione delle immagini (Figura 2C). Ad esempio, quando 500 immagini vengono registrate due volte con un intervallo di 10 s, immettere 1.000 nella casella Totale immagini, 500 nella casella Immagini e 10 nella casella Intervallo (s).
- Attivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Dividere l'immagine di fluorescenza utilizzando l'ottica di scissione dell'immagine e le due immagini (canale GCaMP, 500-525 nm (Figura 2E); Il canale TagRFP, 584-676 nm (Figura 2F)) viene proiettato su due metà della telecamera sCMOS. Calibrare le coordinate dei canali GCaMP e TagRFP (Figura 2G). Salvare le impostazioni del software.
- Impostare la directory per l'output del file di dati (Figura 2H).
- Disattivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Fare doppio clic sul software di sistema macro del mouse (Figura 3A) e impostare le proprietà di vibrazione (Figura 3B). Leggere il file Assay.txt con il sistema macro del mouse in modo che il cursore del mouse sia controllato in base alle coordinate e alla pianificazione in tale file (Figura 3A). Impostare le coordinate del cursore del mouse (quadrati magenta nella Figura 3A) e attendere il tempo fino alla stimolazione dopo l'avvio della registrazione (magenta nella Figura 3A). Impostare i valori di frequenza e ampiezza nel software per il controllo delle vibrazioni (Figura 3B).
4. Preparazione di vermi per l'imaging del calcio
- Trasferire un singolo verme che esprime sia GCaMP che TagRFP dalla piastra incubata a una nuova piastra NGM fresca su cui E. coli OP50 è stato striato.
- Fissare la piastra NGM al trasduttore acustico piezoelettrico utilizzando nastro adesivo trasparente (Figura 4). Non premere la piastra sull'attuatore perché questo altera la frequenza di vibrazione.
5. Imaging del calcio sotto il controllo di specifiche proprietà di vibrazione
- Attivare il pulsante Acquisizione (Figura 2D).
- Trova il verme sotto luce intensa e luce di eccitazione (488 nm e 560 nm).
- Impostare il valore di zoom della microscopia su 2,5x. Il campo visivo è di 1,1 mm x 1,1 mm con una risoluzione di 2,6 μm/pixel.
- Spegnere la luce intensa e attivare il pulsante Homing (Figura 2I) per tracciare il punto fluorescente di un worm. Questo pulsante di homing avvia il movimento dello stadio X-Y per mantenere la regione di massima intensità del worm al centro del campo visivo nell'immagine TagRFP.
NOTA: In termini di promotore flp-18 , l'intensità fluorescente dei neuroni AVA è più forte e quelli di altri neuroni sono deboli o non rilevati. Pertanto, il sistema a basso ingrandimento non è necessario per il tracciamento e il palco si muove durante la registrazione. - Assicurarsi che i valori delle barre di intensità nelle Figure 2E e 2F siano circa 1.000. In caso contrario, mettere a punto i calibri da 470 nm e 550 nm del pod di controllo nella sorgente luminosa.
- Premere il pulsante Esegui nel sistema di macro del mouse per consentire il controllo del cursore del mouse in base a una pianificazione descritta nella Figura 3A. Questo inizia a registrare utilizzando il software di tracciamento e stimolare il software del gene dell'onda durante il monitoraggio del worm.
- Verificare se il file BMP di output è stato creato in modo appropriato.
6. Analisi dei dati
- Creare una cartella sul desktop e denominarla CalciumImaging.
- Creare una cartella all'interno della cartella CalciumImaging e denominarla CIResult, per i file dei risultati di output.
- Fare doppio clic sul file DualViewImaging.nb scritto nel software di analisi dei dati per Windows.
- Inserire il percorso del file nella cartella CIResult (ad esempio, Nome Directory[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figura 5).
- Inserire il percorso del file nella cartella, incluso il file BMP (ad esempio, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figura 5), in cui XXX indica il nome della cartella, inclusi i file BMP.
- Premere contemporaneamente i tasti Maiusc e Invio per avviare un'analisi automatica. Questa analisi utilizza il valore di una regione di intensità massima del campo visivo nell'immagine TagRFP (vedere la legenda della Figura 6 per la procedura di calcolo dettagliata nel programma).
- Verificare se i seguenti file di output sono stati creati in modo appropriato nella cartella CIResult.
XXX-GCaMP.tif (file immagine che illustra le tracce delle intensità GCaMP per tutte le immagini)
XXX-GCaMP.xls (file di foglio di calcolo che elenca le intensità GCaMP in tutte le immagini)
XXX-TagRFP.tif (file immagine che illustra tracce di intensità di TagRFP per tutte le immagini)
XXX-TagRFP.xls (file di foglio di calcolo che elenca le intensità TagRFP in tutte le immagini)
XXX-Ratio.tif (file immagine che illustra le tracce del valore del rapporto per tutte le immagini)
XXX-Ratio.xls (file di foglio di calcolo che elenca il valore del rapporto in tutte le immagini)
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Risultati
Qui, un worm che esprime sia GCaMP che TagRFP sotto il controllo del promotore specifico dell'interneurone AVA viene utilizzato come esempio di imaging del calcio nel comportamento libero di C. elegans. I dati dei canali GCaMP e TagRFP sono stati ottenuti come una serie di immagini, alcune delle quali sono mostrate nella Figura 6 e come filmato (Filmato supplementare 1). È stato anche quantificato lo spostamento della piastra di Petri indotto dal nostro sistema di v...
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Discussione
Generalmente, la quantificazione dell'attività neurale richiede l'introduzione di una sonda e/o restrizioni sul movimento del corpo animale. Tuttavia, per gli studi sul comportamento meccanosensoriale, l'introduzione invasiva di una sonda e le restrizioni stesse costituiscono stimoli meccanici. C. elegans fornisce un sistema per aggirare questi problemi, perché le sue caratteristiche sono trasparenti e perché ha un circuito neurale semplice e compatto che comprende solo 302 neuroni. Combinando questi vantaggi co...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center per aver fornito i ceppi utilizzati in questo studio. Questa pubblicazione è stata sostenuta da JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sul progetto "Science of Soft Robot" delle aree innovative (Grant no. JP18H05474), il PRIME dell'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (numero di sovvenzione 19gm6110022h001) e la fondazione Shimadzu.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software per l'analisi dei dati | |||
| DualViewImaging.nb | autore | Per l'analisi dei dati acquisiti | |
| Mathematica12 | Wolfram | Per l'esecuzione del software per l'analisi dei dati DualViewImaging | |
| Escherichia coli e C. elegans ceppi | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Cibo per C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) ceppo | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | ceppo mutante insensibile alla luce |
| lite-1(ce314) che esprime NLS-GCaMP-NLS e TagRFP sotto il controllo dell'autore del promotore specirico | AVA ST12 | lite-1(ce314) mutante che trasporta i geni che esprimono NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; segnale di localizzazione nucleare) e TagRFP sotto il controllo del promotore flp-18 come array extracorososomico | |
| Vibrometro Doppler laser | |||
| Lase | Polytec Japan | IVS-500 | Per quantificare la frequenza e lo spostamento generati dal trasduttore acustico |
| Sistema macro del mouse | |||
| Autore | Script per il controllo temporalmente e speciale del cursol del mouse in Windows | ||
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Software di download gratuito per il controllo del cursore del mouse basato su una piastra di crescita script |
| Nematode | |||
| Agar purificato, polvere | Nakarai tesque | 01162-15 | per preparazione di piastre NGM |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Cloruro di calcio | Wako | 036-00485 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Colesterolo | Wako | 034-03002 | Per la preparazione di piastre NGM |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Brodo LB, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Per la coltura di E. coli OP50 |
| Solfato di magnesio anidro | TGI | M1890 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Diidrogenofosfato di potassio | Nakarai tesque | 28720-65 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Cloruro di sodio | Nakarai tesque | 31320-05 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Piastre di Petri (60 mm) | Nunc | 150270 | Per la preparazione di piastre NGM |
| Dispositivo di vibrazione non localizzata | |||
| Amplificatore | LEPY | LP-A7USB | Per la stimolazione con vibrazione controllabile |
| Trasduttore acustico | MinebeaMitsumi | LVC25 | Per la stimolazione con vibrazione controllabile |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Download gratuito del software per il controllo delle proprietà delle vibrazioni |
| imaging del calcio non invasivo | |||
| 2 canali da banco Servocontrollore CC brushless trifase | Thorlabs | BBD202 | Controller compatibile per stadi MLS203-1 |
| 479/585 nm Filtro passa-banda dual-band BrightLine | Semrock | FF01-479/585-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard a epifluorescenza dicroica beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 512/25 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine | Semrock | FF01-512/25-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| 630/92 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine | Semrock | FF01-630/92-25 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 con CPU Intel Xeon ES-2630 e 8 GB di RAM |
| Stadio motorizzato x-y ad alta velocità | Thorlabs | MLS203-1 | Stadio di scansione XY veloce |
| Ottica di divisione delle immagini | Hamamatsu | fotonica A12801-01 | Per l'acquisizione di immagini a due canali (GCaMP e TagRFP) generate da W-VIEW GEMINI Ottica di divisione delle immagini |
| Sorgente luminosa a LED | CoolLED | pE-4000 | Per la generazione di luce di eccitazione a 470 nm e 560 nm |
| Microscopio Fotocamera | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS | Andor | Zyla | |
| x 2 Obiettivo | Olympus | MVPLAPO2XC | Distanza di lavoro 20 mm e numerica apertura 0,5 |
| Plasmide | |||
| pKDK66 | autore | pKDK66 | Marcatore di co-iniezione |
| pTAK83 autore del plasmide | pTAK83 | Plasmide per l'espressione di TagRFP sotto il controllo del flp-18 promotore | |
| pTAK144 | plasmide autore | pTAK144 | Plasmide per l'espressione di NLS-GCaMP5G-NLS sotto il controllo di the flp-18 promoter |
| Tracking softwarehomingback.vi | |||
| autore | File SubVi per il tracciamento di un punto fluorescente di un worm attraverso il controllo del feedback della telecamera sCMOS e dello stadio motorizzato x-y | ||
| LabVIEW | National instruments | Per l'esecuzione del software | |
| di tracciamento Zyla Control ver.2.6CI.vi | autore | Per l'inseguimento di un punto fluorescente di un verme attraverso il controllo del feedback della fotocamera sCMOS e dello stadio motorizzato x-y |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
