Articolo metodologico

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

DOI:

10.3791/61629

⸱

19 novembre 2020

 ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Abstract

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Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) per sviluppare modelli cellulari ex vivo per lo studio della funzione della barriera eculare-encefalica (BBB). Questo protocollo modificato fornisce passaggi dettagliati per ricavare, espandere e crioconservare IPC dagli iPSC umani utilizzando un donatore e reagenti diversi da quelli riportati nei protocolli precedenti. Gli iPSC vengono trattati con 6 mezzi essenziali per 4 giorni, seguiti da 2 giorni di mezzo di coltura senza siero endoteliale umano integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base, acido retinoico e integratore B27. Al giorno 6, le cellule vengono sotto-coltivate su una matrice di collagene / fibronectina per 2 giorni. L'immunocitochimica viene eseguita al giorno 8 per l'analisi dei marcatori BMEC utilizzando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. Il western blotting viene eseguito per confermare l'espressione del marcatore BMEC e l'assenza di SOX17, un marcatore endodermico. Il potenziale angiogenico è dimostrato con un saggio di germogliazione. La resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) viene misurata utilizzando elettrodi a bacchetta e voltohmmetro a partire dal giorno 7. L'attività del trasportatore Efflux per la sottofamiglia di cassette di binding ATP B membro 1 e la sottofamiglia di cassette di binding ATP C membro 1 viene misurata utilizzando un lettore multi-piastra al giorno 8. Una derivazione riuscita dei BMEC è confermata dalla presenza di marcatori cellulari rilevanti, bassi livelli di SOX17, potenziale angiogenico, attività del trasportatore e valori TEER ~2000 Ω x cm2. I BMEC vengono espansi fino al giorno 10 prima di passare su piastre di collagene/fibronectina appena rivestite o crioconservate. Questo protocollo dimostra che i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi almeno una volta. Tuttavia, dopo la crioconservazione sono stati osservati valori TEER più bassi e una localizzazione più scarsa dei marcatori BMEC. I BMEC possono essere utilizzati in esperimenti di co-coltura con altri tipi di cellule (neuroni, glia, periciti), in modelli cerebrali tridimensionali (organ-chip e idrogel), per la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali e per lo studio della disfunzione BBB nei disturbi neuropsichiatrici.

Introduzione

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Funzione barriera ematico-encefalica
La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l'unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integritàdella barriera 1,2. I BMEC hanno anche proteine che aiutano con il movimento transcellulare come l'endocitosi, la tracitosi e la trasmigrazione, così come l'estravasazione dei leucociti durante una risposta immunitaria3. I BMEC si affidano ai trasportatori di afflussi ed efflux per il nutrimento e la rimozione dei prodotti di scarto, al fine di mantenere un equilibrio omeostatico nelcervello 3. Ad esempio, solute carrier family 2 membro 1 (SLC2A1) è un trasportatore di afflusso responsabile del movimento del glucosio attraverso il BBB 4 ,mentrei trasportatori efflux come la sottofamiglia di cassette binding ATP B membro 1 (ABCB1) e la sottofamiglia di cassette binding ATP membro C 1 (ABCC1) sono responsabili della restituzione dei substrati nel flussosanguigno 3,5,6,7. I substrati ABCB1 includono morfina, verapamil4e antipsicotici come olanzapina e risperidone8, mentre il trasportatore ABCC1 ha una varietà di substrati tra cui coniugati solfati, vincristina e coniugatiglucuronide 4.

Applicazione di modelli BBB nei disturbi psichiatrici
La disfunzione della BBB è stata implicata in una serie di disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui schizofrenia e disturbobipolare 9,10. Recentemente, i modelli cellulari ex vivo derivati da iPSC vengono utilizzati per interrogare le basi cellulari e molecolari dei disturbi psichiatrici, ma questi modelli attualmente non tengono conto del ruolo potenziale svolto dalla neurovascolarizzazione11,12,13. Si ipotizza che le citochine infiammatorie periferiche che circolano nel sangue possano avere un impatto negativo sulla BBB14,15,16,17, ma ci sono anche prove diparacellulare 18,19,20,21, 122, matrice transcellulare23,24,25,26,27,28,29e matrice extracellulare20,29,30,31,32 anomalie che contribuiscono alla disfunzione BBB. L'interruzione della BBB può comportare l'ingresso del contenuto di sangue nel parenchima cerebrale e l'attivazione di astrociti e / o microglia per rilasciare citochine proinfiammatorie, che a loro volta avviano unarisposta infiammatoria 33 che può avere effetti dannosi sulcervello 34. I BMEC sono la componente primaria della BBB e l'esame della struttura e della funzione di queste cellule può migliorare la comprensione della disfunzione BBB nei disturbi neurologici e psichiatrici.

Modelli BMEC alternativi
Prima dello sviluppo di protocolli efficienti per la derivazione di BMEC da iPSC1,6,35,36, i ricercatori avevano utilizzato BMECimmortalati 37 per studiare la funzione BBB. Tuttavia, molti di questi modelli non sono riusciti a raggiungere i fenotipi BBB desiderabili, un tale intervallo fisiologico di valori TEER38,39. L'utilizzo degli iPSC ha il vantaggio di mantenere il background genetico dell'individuo da cui derivano le cellule. Gli scienziati stanno lavorando attivamente alla definizione di modelli di microambiente ex vivo derivati da iPSC che ricapitolano la struttura e la funzione del cervello umano. I ricercatori hanno sviluppato metodi per ricavare BMEC strutturalmente e fisiologicamente simili ai BMEC trovati in vivo. I metodi per ottenere popolazioni purificate di BMEC derivati da iPSC richiedono una serie di passaggi diversi con protocolli ottimizzati negli ultimianni 1,6,35,36. Generalmente, i BMEC derivati da iPSC sono coltivati in mezzo Essential 6 (E6) per 4 giorni, seguiti da 2 giorni nel mezzo umano endoteliale senza siero (hESFM) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), acido retinoico (RA) e integratore B27. Le cellule vengono quindi coltivate su una matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per ottenere >90% BMEC omogenei1.

L'identità dei BMEC è confermata dall'immunofluorescenza che mostra la coesimozione di proteine BMEC tra cui molecola di adesione delle cellule piastrine-endoteliali-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteine di giunzione stretta come la proteina di giunzione stretta 1 (TJP1), l'occludina (OCLN) e la claudina-5 (CLDN5)6. I test di germinazione sono stati utilizzati per confermare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. 6 L'integrità BBB dei BMEC è valutata dalla presenza di valori teer fisiologici in vitro (~2000Ω x cm2)37 e attività misurabile per trasportatori di efflux come ABCB1 e ABCC11,6,36. I recenti progressi metodologici del gruppo Lippmann hanno portato a protocolli BMEC derivati da iPSC con ridotta variabilità sperimentale e maggiore riproducibilità1. Tuttavia, non è noto se possano essere espansi e superati oltre lo stadio di sotto-ristrutturazione. Il nostro protocollo modificato mira ad affrontare questo problema passando i BMEC derivati da iPSC oltre il giorno 8 e valutando se possono essere ulteriormente ampliati per mantenere le proprietà BBB dopo la crioconservazione. Sebbene nessuno studio abbia descritto la passaging di BMEC derivati da iPSC, esiste un protocollo per la crioconservazione BMEC che mantiene proprietà fisiologiche BBB dopo aver subito un ciclo di congelamento-disgelo40. Tuttavia, non è noto che i BMEC post-crioconservazione possano essere passaggi e mantenere le proprietà BBB.

I BPC derivati da iPSC che utilizzano il protocollo Lippmann sono stati utilizzati per modellare l'interruzione della BBB in disturbi neurologici come la malattia di Huntington7. Tali BMEC derivati da iPSC sono stati utilizzati anche per indagare gli effetti di infezioni batteriche come Neisseria meningitidis o Gruppo B Streptococcus sull'interruzione della barriera ematica-CSF e BBBrispettivamente 41,42. Inoltre, utilizzando BMEC derivati da iPSC da pazienti con sindrome da cancellazione di 22q con schizofrenia, i ricercatori hanno osservato un aumento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una delle principali molecole di adesione nei BMEC che aiutano con il reclutamento e l'estravasione dei leucocitinel cervello 43. Nel loro insieme, questi studi dimostrano l'utilità di BMEC derivati dall'iPSC per lo studio dell'interruzione della BBB nei disturbi neuropsichiatrici complessi.

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Protocollo

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Gli iPSC umani sono stati riprogrammati dai fibroblasti di donatori sani utilizzando un protocollo approvato dagli Institutional Review Boards del Massachusetts General Hospital e del McLean Hospital, e caratterizzato come descritto negli studiprecedenti 44,45,46.

NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite riprogrammazione genetica basata sull'mRNA47. Gli iPSC sono stati mantenuti in mezzo a cellule staminali (SCM) (vedi elenco dei materiali) e conservati ad una densità di ~1,2 x 102 cellule/mL con 1 mL di SCM, 10 μM con inibitore della protein chinasi rho-associata (ROCKi) Y-27632 e 10% (v/v) solfuro dimetile (DMSO), in fiale crioconservate in azoto liquido a -160 °C. Tutte le seguenti procedure sono eseguite in un armadio per la biosicurezza, salvo diversa indicazione.

1. Diluizione della matrice della membrana basale e rivestimento della piastra

  1. Il fattore di crescita diluito (1:50) ha ridotto la matrice della membrana basale purificata dal tumore Engelbreth-Holm-Swarm nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco senza rosso fenolo.
  2. Rivestire piastre di coltura cellulare con la quantità appropriata di matrice di membrana basale diluita (cioè piastra a 6 porri = 1mL, piastra da 12 porri = 0,5 mL) e incubare queste piastre a 37 °C per almeno 1 ora.

2. manutenzione iPSC

NOTA: La massima confluenza per pozzo in una piastra a fondo piatto a 6 po 'è ~1,2 x 106 celle.

  1. Scongelare gli iPSC crioconservati in SCM con 10 μM Y-27632 e placcare su una piastra a 6 porri rivestita con fattore di crescita diluito ridotta matrice di membrana basale.
  2. Mantenere gli IPSC in SCM con 10 μM Y-27632 per le prime 24 ore dopo lo scongelamento. Passare al mezzo fresco dopo 24 ore.
  3. Mantenere gli IPSC in SCM fino a quando le celle non raggiungono l'80-90% di confluenza prima della passaging.
    1. Calcolare quanti iPSC saranno necessari per la differenziazione moltiplicando la densità desiderata per la differenziazione (15.600 celle/cm2) per la superficie del pozzo. Per una piastra a fondo piatto a 6 po', moltiplicare 15.600 celle/cm2 per 9,6 cm2 per un totale di 149.760 cellule/pozzo.
  4. Per passare, lavare le cellule con la soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBBS). Quindi, incubare le cellule con acido etilendiamminatetraacetico non enzimatico (EDTA) (vedi elenco dei materiali) per 5 minuti a 37 °C.
    1. Utilizzare un raschietto per rimuovere delicatamente le cellule. Raccogliere celle in SCM fresco.
    2. Celle a piastre su piastre di coltura cellulare rivestite con SCM diluito e mantenere le celle come descritto al passaggio 2.3 o conservarle a ~1,2 x10 6 celle/mL in 1 mL di SCM, 10 μM Y-27632 e 10% DMSO (v/v) in fiale crioconservate in azoto liquido a temperatura di -160 °C.

3. Differenziazione degli iPSC in BMEC

NOTA: L'EDTA non enzimatica separa le cellule in grumi. L'EDTA enzimatica (vedi Tabella dei materiali)separa le cellule in sospensioni a cella singola. L'acido retinoico (RA) deve essere protetto dalla luce.

  1. Lavare gli iPSC una volta con la salina tampone fosfato (DPBS) di Dulbecco. Incubare con EDTA enzimatica (1 mL per piastra a 6 potte, 0,5 mL per piastra da 12 pocchi e 0,25 mL per piastra a 24 po porsi) per circa 5 minuti a 37 °C per produrre una sospensione a cella singola.
  2. Raccogliere cellule e centrifughe a 300 x g (forza centrifuga relativa) per 5 minuti a temperatura ambiente. Pellet di cellule resuspend in SCM contenenti 10 μM Y-27632.
  3. Determinare la densità cellulare utilizzando Trypan Blue e il contatore automatico delle celle o un dispositivo emocitometro. Celle a piastre ad una densità di 15.600 celle/cm2 o 149.760 celle/pozzo di una piastra a fondo piatto a 6 po' (con una superficie di 9,6 cm2/pozzo)in SCM contenente 10 μM Y-27632 per 24 ore.
  4. Avviare la differenziazione dopo 24 ore cambiando SCM in mezzo E6. Cambia mezzo E6 ogni giorno per i prossimi 4 giorni.
  5. Il giorno 4 della differenziazione, sostituire il mezzo E6 con hESFM integrato con supplemento B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA. Non cambiare questo supporto per le prossime 48 ore.
  6. Preparare 200 mL di hESFM con B27 diluito (1:200), mescolare 1 mL di 50x concentrato B27 supplemento a 199 mL di hESFM.
  7. Preparare 20 ng/mL di bFGF ricostituendo 50 μg di bFGF in 250 μL di tampone Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) per realizzare una soluzione stock di 200 μg/mL. Preparare 200 mL di hESFM contenente 20 ng/mL bFGF mescolando 20 μL di 200 μg/mL bFGF con 200 mL di hESFM.
  8. Preparare 10 μM RA facendo prima una soluzione di 40 mg/mL di RA stock aggiungendo 2,5 mL di DMSO a 100 mg di polvere RA. Diluire questa concentrazione a 3 mg/mL per realizzare una soluzione stock da 10 mM. Preparare 200 mL di hESFM contenente 10 μM RA mescolando 200 μL di 10μM RA in 200 mL hESFM.

4. Rivestimento collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) Matrice per la purificazione del BMEC derivato da iPSC

  1. Aggiungere 2 mL di acqua sterile a 2 mg di FN per fare 1 mg/mL di soluzione di calcio FN. Aggiungere 5 mL di acqua sterile a 5 mg di COL4 per fare una soluzione di 1 mg/mL COL4.
    1. Lasciare sciogliere FN per almeno 30 minuti a 37 °C e il COL4 per sciogliersi a temperatura ambiente.
  2. Diluire la soluzione stock di FN in acqua sterile ad una concentrazione finale di 100 μg/mL e soluzione di stock COL4 ad una concentrazione finale di 400 μg/mL.
  3. Rivestire le piastre desiderate (piastra a 6 po porsi = 1 mL di soluzione COL4/FN, piastra a 12 po porsi = 0,5 mL, piastra a 24 po porsi = 0,25 mL e piastra filtrata a 12 transwell = 0,25 mL) con la miscela di 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Incubare le piastre per un minimo di 2 ore o pernottamento a 37 °C; per le piastre filtrate Transwell, si consiglia un minimo di 4 ore.

5. Sottocoltura e purificazione dei BMEC derivati da iPSC

NOTA: L'incubazione con EDTA enzimatica può richiedere più di 15 minuti a seconda della confluenza delle cellule il giorno 6 della differenziazione.

  1. Il giorno 6 della differenziazione, lavare le cellule due volte con DPBS. Incubare con 1 mL di EDTA enzimatica per almeno 15 minuti a 37 °C fino a ottenere una sospensione a singola cella.
  2. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Pellet di cellule resuspend con hESFM fresco con integratore B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA.
  3. Cellule di semi su piastre rivestite con una miscela di 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Sementi di iPSC indifferenziati dalla stessa linea cellulare su piastra filtrata col4/FN rivestita a 12 transwell come controllo negativo per l'analisi TEER.
  5. Dopo 24 ore di sotto-coltura, cambiare medio-hESFM solo con supplemento B27. Non sono necessarie modifiche medie dopo questo passaggio.

6. Saggio di germinazione

  1. Raccogli i BMEC derivati da iPSC del giorno 8 e seminali a 100.000 cellule / pozzo su una piastra a fondo piatto da 24 po 'appena rivestita con 200 μL / cm2 di matrice di membrana basale.
  2. Trattare queste cellule con hESFM con diluito (1:200) B27 e 40 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA165).
  3. Osservare le cellule ogni 24 ore e cambiare il mezzo ogni due giorni.

7. Immunocitochimica (ICC)

NOTA: ICC viene eseguito su piastre a fondo piatto da 24 pozzi.

  1. Dopo 48 ore di sotto-coltivazione (giorno 8), lavare le cellule due volte con DPBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti.
  2. Lavare le celle tre volte con DPBS, 5 minuti per lavaggio. Preblocchiare le celle per 1 ora a temperatura ambiente in DPBS con il 5% di siero d'asino e lo 0,3% di Tritone X-100 (v/v).
  3. Incubare con anticorpi primari: topo anti-umano-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), coniglio anti-umano-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), topo anti-umano-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/mL), topo anti-umano-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL) e coniglio anti-umano-SLC2A1(1:100, stock 0,2 mg/mL) in DPBS contenente il 5% di siero d'asino durante la notte a 4°C.
    1. Risciacquare le cellule una volta con DPBS e quindi lavare cinque volte per 5 minuti per lavaggio con DPBS.
  4. Incubare le cellule con anticorpi secondari: asino-anti-coniglio Alexa Fluor 555 (1:200) e asino-anti-topo 488 (1:200) in DPBS contenente il 5% di siero d'asino per 1 ora.
  5. A seguito di questa incubazione, aggiungere hoechst 33342 triidrocloruro triidrato diluito (1:1000) in DPBS per 10 minuti.
    1. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e risciacquare una volta con DPBS e lavare quattro volte con DPBS per 5 minuti per lavaggio.
  6. Visualizza le cellule su microscopi a fluorescenza per cercare espressione e localizzazione dei produttori di cellule.

8. Misurazione e analisi TEER

NOTA: Le piastre filtrate Corning 12-Transwell sono dotate di filtri costituiti da membrane in polietilene tereftalatoda 1,12 cm e pori da 0,4 micrometri. Le misurazioni TEER sono ottenute in repliche tecniche (3 per pozzo) e biologiche (3 pozzi per linea cellulare e/o condizione).

  1. 24 ore dopo la sotto-coltura (giorno 7), misurare TEER usando elettrodi a bacchetta e un voltohmmetro ogni 24 ore. Fare riferimento al manuale d'uso del voltohmmetro per istruzioni specifiche sull'ottenimento delle misurazioni.
    1. Per misurare teer, caricare lo strumento voltohmmetro la sera prima. Pulire leggermente lo strumento e gli elettrodi a bacchetta con il 70% di etanolo prima di posizionarli nella cappa di sicurezza.
    2. Accendere e calibrare il misuratore ohm come raccomandato dal produttore.
    3. Collegare gli elettrodi a bacchetta e sciacquare gli elettrodi con il 70% di etanolo seguito da DPBS.
    4. Posizionare l'elettrodo finale più corto nell'inserto trans-pozzo (la camera apicali) e l'estremità più lunga nella camera basolaterale.
    5. Per prima cosa misurare un pozzo vuoto rivestito solo con COL4 / FN. Quindi misurare gli altri pozzi.
    6. Risciacquare rapidamente gli elettrodi a bacchetta con il 70% di etanolo seguito da DPBS quando si misurano condizioni diverse (cioè misurare diverse linee cellulari).
  2. Dopo aver registrato tutte le misurazioni (in Ω) , sciacquare gli elettrodi di bacchetta con il 70% di etanolo e quindi acqua sterile. Pulire delicatamente l'elettrodo e lasciarlo asciugare all'aria nella cappa di sicurezza.
  3. Mediare i valori TEER triplicati (in Ω) dal pozzo vuoto e sottrarre questo valore medio da ogni valore TEER non elaborati per condizione.
    1. Mediare i valori sottratti e moltiplicarli per 1,12 cm2 (la superficie dell'inserto a 12 transwell).
    2. Usare i valori trasformati del passaggio 6 per generare il grafico che mostra il valore TEER e gli errori standard per ogni giorno di misurazione TEER.

9. Attività e analisi del trasportatore Efflux

NOTA: Il test di attività del trasportatore Efflux viene eseguito su una piastra a fondo piatto da 24 po '. I trasportatori Efflux di interesse includono ABCB1 e ABCC1. Si raccomanda di eseguire ogni condizione in triplice copia con pozzi di controllo (cioè pozzi vuoti senza i rispettivi inibitori).

  1. Dopo 48 ore di sotto-coltivazione (giorno 8), incubare cellule con 10 μM Valspodar (inibitore ABCB1) o 10 μM MK571 (inibitore ABCC1) per 1 ora a 37 °C.
    1. Preparare 10 mM di brodo di Valspodar sciogliendo 5 mg di polvere (1214,64 g/mol) in 412 μL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM Valspodar, mescolare 10 μL di 10 mM di stock di Valspodar con 10 mL di hESFM.
    2. Preparare 10 mM MK571 stock sciogliendo 5 mg di polvere (537,07 g/mol) in 931 μL e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM MK571, mescolare 10 μL di 10 mM MK571 stock con 10 mL di hESFM.
  2. Dopo 1 ora, incubare le cellule con 10 μM di rodiammina 123 (substrato ABCB1) o 10 μM 2',7'-dilodiidrofluoresceina diacetato (substrato H2DCFDA, ABCC1) con o senza i rispettivi inibitori per 1 ora a 37 °C.
    1. Preparare 10 mM di rodiammina 123 sciogliendo 10 mg di polvere (380,82 g/mol) in 875 μL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM di rodiammina 123, mescolare 10 μL di 10 mM di rodiammina 123 stock con 10 mL di hESFM.
    2. Preparare 10 mM H2DCFDA sciogliendo 50 mg di polvere (487,29 g/mol) in 10,26 mL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM di rodiammina 123, mescolare 10 μL di 10 mM di rodiammina 123 stock con 10 mL di hESFM.
  3. Lavare le celle due volte con 0,5 mL di DPBS e lisciviare utilizzando DPBS contenente il 5% di Triton-X (v/v).
  4. Misurare la fluorescenza delle cellule liscitte utilizzando un lettore multipiastra o micropiastra (vedi elenco dei materiali).
    1. Impostare lo strumento lettore di lastre fluorescenti su eccitazione di 485 nanometri e emissione di 530 nanometri e misurare la fluorescenza a queste lunghezze d'onda.
    2. Per i pozzi non utilizzati nel saggio del trasportatore, lavare le cellule due volte con DPBS prima di fissarle con il 4% di PFA per la quantificazione dei nuclei cellulari.
  5. Incubare le cellule con Hoechst 33342 tricloruro di triidrato diluito (1:1000) in DPBS per 10 minuti. Immagine di più campi visivi in ogni pozzo per calcolare il conteggio medio dei nuclei cellulari utilizzando microscopi a fluorescenza.
  6. Conta i nuclei usando le Figi e normalizza i valori di fluorescenza per cella in base a questi conteggi.
    1. Calcolare l'accumulo medio di fluorescenza sottraendo il valore di accumulo di fluorescenza grezza per ogni condizione dal rispettivo valore in bianco.
    2. Valori medi sottratti per ogni condizione.
    3. Dividere i valori medi dal passaggio 9.6.1 per il conteggio medio delle celle. Utilizzare questi valori per normalizzare i valori di fluorescenza per cella.
    4. Utilizzare valori normalizzati per generare una rappresentazione grafica per ogni condizione inibitore ed eseguire qualsiasi analisi statistica necessaria.

10. BMEC di passaging, espansione e crioconservazione

  1. Reintegrare le colture BMEC del giorno 8 con hESFM fresco integrato con B27 diluito (1:200) e consentire alle cellule di espandersi per altri due giorni sulla matrice COL4 / FN.
  2. Rivestire una nuova piastra filtrata 12-Transwell e una piastra a fondo piatto da 24 po 'con 400 μg / mL COL4 e 100 μg / mL FN e incubare per 4 ore.
  3. Il giorno 10, lavare le cellule con DPBS e incubare con 1 mL di EDTA enzimatica per almeno 15 minuti a 37 °C fino a ottenere una sospensione a singola cella.
  4. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    1. Per crioconservare queste cellule, resuspend cell pellets con hESFM fresco con 30% siero bovino fetale (FBS) e 10% DMSO.
    2. Conservare i BMEC derivati da iPSC in flaconcini crioconservati in un contenitore isopropanolo per le prime 24 ore a -80 °C, quindi mettere in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine a -160 °C.
    3. Per passare queste cellule, pellet di cellule resuspend con hESFM fresco integrato con B27 diluito (1:200).
  5. Cellule di semi su piastre rivestite preparate nella fase 10.2. Cellule di semi che utilizzano un rapporto di 1 pozzo di una piastra da 6 po 'a 3 pozzi di una piastra filtrata a 12 transwell e a 6 pozzi di una piastra da 24 po '. Consentire alle cellule di crescere ed espandersi per 24 ore.
  6. Il giorno 11 misurare TEER seguendo i passaggi elencati nel passaggio 8.
  7. Il giorno 12 eseguire ICC seguendo i passaggi elencati nel passaggio 9.
  8. Per scongelare i BMEC crioconservati, posizionare le fiale crioconservate in acqua tiepida o bagno di perline a 37oC. Quindi trasferire i BMEC scongelati a 5 mL di hESFM integrati con B27 diluito (1:200).
    1. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimescolare le cellule in hESFM integrate con B27 diluito (1:200), 10 μM RA e 10 μM Y-27632.
    2. Dopo 24 ore, passare da medio a hESFM integrato con diluito (1:200) B27 e 10 μM Y-27632 senza RA.

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Risultati

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Differenziazione BMEC
È necessario seguire con precisione alcuni passaggi critici di questo protocollo (figura 1). L'uso medio E6 il primo giorno è importante, poiché viene spesso utilizzato per derivare il lignaggio neuroectoderma dagli IPSC in un periodo di tempo relativamente breve producendo risultati riproducibili su più lineecellulari 36. Un altro passo importante è il giorno 4 della differenziazione, dove il mezzo E6 dovrebbe essere passato ...

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Discussione

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Modifiche e risoluzione dei problemi

In questo protocollo sono state apportate alcune modifiche all'utilizzo di una matrice extracellulare comunemente utilizzata e di supporti di coltura cellulare durante la coltura iPSC per la derivazione di BMEC (Figura 1). Queste modifiche non hanno influito sulla capacità di ricavare BMECS dagli iPSC umani come descritto nel protocolloLippmann 1. Una linea iPSC di un donatore sano diver...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da un National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (a R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (a R.K.), un Sydney R Baer Jr Foundation Grant (a P.L.) il Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), il Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), l'Harvard Stem Cell Institute (a R.K.) e da Steve Willis ed Elissa Freud (a R.K.). Ringraziamo la dott.ssa Annie Kathuria per la sua lettura critica e il feedback sul manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetatoSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Segnalazione cellulare mAb di topo3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagene IV da placenta umanaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Fiala criogenica in polipropilene filettato interna Corning  8670
Corning  Piastre per colture cellulari a fondo piatto Costar (6 pozzetti)Corning353046
Corning  Piastre per colture cellulari a fondo piatto Falcon (24 pozzetti)Piastra a
Corning Transwell con inserti a membrana in poliestere permeabile (12 pozzetti)Vetrini Corning3460
CountessThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (senza rosso fenolo)Thermo Fisher Scientific 
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Siero d'asinoSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Misuratore epiteliale Volt/Ohm (TEER) (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher Scientific
Siero fetale bovino (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinaSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex Senza LDEV Matrice di membrana basale a fattore di crescita ridottoThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution con calcio e magnesioThermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Tricloridrato, TriidratoThermo Fisher ScientificH3570
Terreno privo di siero endoteliale umanoThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen  Contacellule automatizzato CountessThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldeide 16%Servizi di microscopia elettronica15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-piastra LettorePerkin ElmerN/A
VEGF umano ricombinante 165Peprotech100-20
FGF-basic umano ricombinante (154 a.a.)Peprotech100-18B
Acido retinoicoSigma AldrichR2625-100MG
Rodamina 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Segnalazione cellulare81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%) per l'uso con il contatore di cellule automatizzato CountessThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (ciclosporina A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene soluzioneThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK)Tocris/ Thermo Fisher Scientifico1254
pozzetti multipli Corning 353047 A1413202A1516401

Riferimenti

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