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La traduzione nei sistemi eucarioti avviene prevalentemente attraverso vie 7-metilguanosina (m7G) cap-dipendenti1. Gli studi indicano che la fase di iniziazione della traduzione eucariota è la limitazione del tasso e un obiettivo comune perla regolamentazione 2,3,4. I meccanismi di traduzione dipendente dal tappo sono stati ampiamente studiatiutilizzando approcci genetici 5,biochimici 6,7,8,strutturali 9e genomici a 10 rinfuse. Sebbene questi metodi abbiano identificato diversi meccanismi che regolano l'iniziazione dipendente dal limite, la loro risoluzione li limita alla media dei segnali provenienti da eventi di iniziazione eterogenei e asincroni. Più recentemente, singoli eventi di traduzione in vivo sono stati visualizzati con metodi che misurano il legame degli anticorpi fluorescenti agli epitopi sui polipeptidinascenti 11,12,13,14. Tuttavia, questi nuovi approcci sono anche limitati nella loro capacità di risolvere singoli eventi di iniziazione perché più anticorpi fluorescenti devono legare un peptide nascente per consentire a singoli eventi di traduzione di essere risolti da un alto sfondo di fluorescenza intracellulare. In molte interazioni biologiche, i singoli eventi cinetici risolti hanno fornito approfondimenti critici sulla comprensione di complessi processi biologici multistep e ripetitivi che non sono possibili sincronizzare a livello molecolare. Sono necessari nuovi metodi in grado di tenere traccia delle dinamiche dei singoli eventi di traduzione per una migliore comprensione dell'avvio e della regolazione dipendenti dal limite.
Recentemente abbiamo sviluppato un saggio in vitro che misura la cinetica di iniziazione dipendente dal tappo con risoluzione a singola molecola15. Considerando il gran numero di fattori proteici noti e sconosciuti coinvolti in questa viadi iniziazione 3,16, il saggio a singola molecola è stato sviluppato per essere compatibile con i sistemi di traduzione in vitro esistenti per beneficiare della loro conservazione dei fattori cellulari e della robusta attività ditraduzione 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Inoltre, l'uso di sistemi di traduzione senza cellule consente confronti più compatibili tra osservazioni a singola molecola e risultati di massa precedenti. Questo approccio fornisce un'integrazione diretta di nuove intuizioni cinetiche a singola molecola nel quadro meccanicistico esistente di iniziazione dipendente dal tappo. Per stabilire il saggio a singola molecola, il tradizionale sistema di traduzione senza cellule viene modificato in tre modi: una sequenza di codifica epitopica viene inserita all'inizio del frame di lettura aperto (ORF) di un mRNA reporter; l'estremità 3′ dell'mRNA reporter è biotinilata per facilitare il end-tethering dell'mRNA alla superficie di rilevamento a singola molecola; e gli anticorpi con etichetta fluorescente sono integrati nell'estratto di traduzione. Queste modifiche richiedono solo tecniche di biologia molecolare di base e reagenti comunemente disponibili. Inoltre, queste modifiche e le condizioni di imaging a singola molecola preservano la cinetica di traduzione delle reazioni di traduzione senza cellule sfuse15.
In questo saggio (Figura 1), l'mRNA del reporter biotinilato 5′-end limitato e 3′-end è immobilizzato su una superficie di rilevamento rivestita di streptavidina in una camera di flusso. La camera di flusso viene quindi riempita con una miscela di traslazione priva di cellule integrata con anticorpi etichettati fluorescentmente. Dopo che la traduzione dell'mRNA si è verificata per circa 30-40 codoni a valle della sequenza epitopica26,27, l'epitopo emerge dal tunnel di uscita ribosoma e diventa accessibile per interagire con anticorpi etichettati fluorescentmente. Questa interazione è rapida e il suo rilevamento da parte di tecniche di imaging a fluorescenza a singola molecola consente il tracciamento della cinetica di traslazione con risoluzione a singola molecola durante la traduzione attiva senza cellule. Questo saggio dovrebbe ampiamente giovare agli studi in vitro sulla cinetica traslazione dipendente dal tappo e sulla sua regolazione, in particolare per i sistemi con una massa di lavoro in test in vitro.
Un prerequisito per stabilire questo saggio a singola molecola è un saggio di traduzione senza cellule sfuse funzionante, che può essere ottenuto utilizzando estratto di traduzione disponibile in commercio o preparato seguendo i metodiprecedentemente descritti 28. L'estratto di traduzione eucariotica può essere ottenuto da diverse cellule, tra cui fungino, mammifero e pianta28. Per l'imaging, questo test richiede un microscopio TIRF dotato di intensità laser tonnibile e angolo incidente, uno stadio campione motorizzato, un sistema di fluidic motorizzato e un dispositivo di controllo della temperatura del campione. Tali requisiti sono generici per i moderni esperimenti TIRF a singola molecola in vitro e possono essere raggiunti in modo diverso. L'esperimento qui presentato utilizza un sistema TIRF di tipo oggettivo composto da microscopio, software e accessori disponibili in commercio tutti elencati nella Tabella dei Materiali.