Analisi clonale del cuore di topo neonatale utilizzando la modellazione del vicino più vicino

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per l'utilizzo del tracciamento del lignaggio multicolore e della modellazione del vicino più vicino per identificare i cardiomiociti derivati clonalmente durante la crescita e la rigenerazione nei topi. Questo approccio è oggettivo, funziona in diverse condizioni di etichettatura e può essere adattato per incorporare una varietà di pipeline di analisi delle immagini.

Abstract

Sostituendo il miocardio perso o disfunzionale, la rigenerazione dei tessuti è un approccio promettente per il trattamento dell'insufficienza cardiaca. Tuttavia, la sfida di rilevare la rigenerazione cardiaca in buona fede limita la convalida dei potenziali fattori rigenerativi. Un metodo per rilevare nuovi cardiomiociti è il tracciamento del lignaggio multicolore con analisi clonale. Gli esperimenti di analisi clonale possono essere difficili da intraprendere, perché le condizioni di marcatura troppo scarse mancano di sensibilità per eventi rari come la proliferazione dei cardiomiociti e la marcatura diffusa limita la capacità di risolvere i cloni. Qui viene presentato un protocollo per intraprendere l'analisi clonale del cuore del topo neonatale utilizzando la modellazione statistica delle distribuzioni dei vicini più prossimi per risolvere i cloni dei cardiomiociti. Questo approccio consente la risoluzione dei cloni in una serie di condizioni di marcatura e fornisce un solido approccio analitico per quantificare la proliferazione e la rigenerazione dei cardiomiociti. Questo protocollo può essere adattato ad altri tessuti e può essere ampiamente utilizzato per studiare la rigenerazione tissutale.

Introduzione

Un segno istologico caratteristico dell'insufficienza cardiaca è la perdita di cardiomiociti (CM), a seguito di lesione, senescenza o apoptosi¹. Il reintegro del miocardio perduto o disfunzionale attraverso la rigenerazione dei tessuti rappresenta una potenziale strategia terapeutica per la cura dei pazienti con insufficienza cardiaca. Negli ultimi decenni, i progressi fondamentali nella biologia dello sviluppo e rigenerativa hanno portato alla luce una limitata capacità del cuore dei mammiferi di reintegrare i CM persi 2,3,4,5. Questo entusiasmante lavoro ha sollevato la possibilità che i meccanismi di crescita innati possano essere utilizzati per la rigenerazione. Poiché le risposte rigenerative innate sono funzionalmente assenti nel cuore adulto dei mammiferi, sono necessari metodi per migliorare la robustezza della riparazione endogena per realizzare la rigenerazione terapeutica del cuore.

I meccanismi per la rigenerazione innata del cuore sembrano essere conservati in tutte le specie. A seguito di lesioni, i CM preesistenti proliferano per generare nuovi CM nel pesce zebra ^6,7, nei tritoni ^8,9, nei topi ^4,10, nei ratti¹¹ e nei maiali^12,13. Di conseguenza, molti gruppi stanno cercando di identificare mitogeni in grado di promuovere la cardiomiogenesi. Tuttavia, questo lavoro è impegnativo. Non solo il compito di far proliferare i CM dei mammiferi adulti è scoraggiante, ma essere in grado di identificare eventi proliferativi rari è difficile ^1,14. La sfida di identificare i CM ciclici rari è aggravata dalla tendenza dei CM adulti dei mammiferi a sottoporsi preferenzialmente all'endomitosi. Ad esempio, dopo una lesione al cuore del topo, quasi il 25% dei CM nella zona di confine rientra nel ciclo cellulare, ma solo il 3,2% dei CM si divide^{in 4}. Poiché la maggior parte dei CM ciclici duplica il proprio genoma ma non riesce a sottoporsi a citochinesi, il semplice test di un aumento del numero di CM ciclici è ambiguo per la cardiomiogenesi in buona fede. Pertanto, i saggi per l'incorporazione nucleosidica da parte dei CM o per la presenza di marcatori proliferativi sui CM potrebbero non indicare completamente la rigenerazione. Man mano che emergono più fattori candidati per la rigenerazione del cuore, sono necessari test per identificare meglio l'iperplasia CM.

L'analisi clonale mediante tracciamento del lignaggio è un approccio prezioso per il dosaggio della cardiomiogenesi perché consente la visualizzazione diretta delle cellule e della loro progenie. Gli approcci tradizionali per l'analisi clonale prevedono la rara marcatura di singole cellule con un gene reporter. Tuttavia, il tracciamento della linea monocolore di cellule rare può essere di valore limitato per eventi poco frequenti come la proliferazione di CM perché le probabilità di marcare un CM proliferante sono basse¹⁵. In alternativa, il tracciamento del lignaggio multicolore può aumentare la sensibilità per l'analisi clonale¹⁶. In breve, le singole cellule sono geneticamente marcate con una delle numerose proteine fluorescenti a caso, in modo tale che le cellule proliferanti generino gruppi di cellule di colore omogeneo che possono essere risolti dalle cellule fluorescenti vicine. Questo metodo è stato utilizzato per tracciare la crescita in una varietà di organi ed è stato più recentemente applicato agli studi sulla rigenerazione del cuore dei mammiferi^17,18. Mentre il tracciamento del lignaggio multicolore può rilevare l'espansione clonale dei CM negli stadi embrionali e neonatali, le risposte rigenerative innate non sono facilmente rilevabili nel cuore del topo adulto dopo un danno cardiaco^17,19. Un approccio per migliorare la sensibilità del tracciamento del lignaggio multicolore sarebbe quello di aumentare il livello di etichettatura e aumentare la probabilità di visualizzare eventi rari. Tuttavia, un'etichettatura più ampia ha il costo di non essere in grado di distinguere le cellule marcate in modo simile come originarie di un antenato comune rispetto alle cellule che sono state marcate in modo indipendente con lo stesso fluoroforo. Qui viene presentato un protocollo che utilizza la modellazione del vicino più vicino per identificare i CM clonalmente correlati nel cuore del topo neonatale. Questo metodo è imparziale, quantitativo e funziona su una vasta gamma di condizioni di etichettatura.

Protocollo

Tutte le procedure per la manipolazione dei topi, l'esecuzione di interventi chirurgici di sopravvivenza e il prelievo di cuori richiedono l'approvazione di un comitato istituzionale locale per l'uso degli animali.

1. Topi per analisi clonale di CM

1. Incrociare i topi Myh6-MerCreMer ²⁰ con i topi Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-Cerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw 21} per generare Myh6-MerCreMer; R26R-Topi bitransgenici arcobaleno.
   1. Mantenere stock di topi omozigoti per l'allele R26R-Rainbow e incrociare con topi eterozigoti per l'allele Myh6-MerCreMer, in modo tale che tutti gli esperimenti vengano eseguiti in topi eterozigoti per l'allele R26R-Rainbow. In alternativa, utilizzare topi omozigoti per l'allele R26R-Rainbow per aumentare la diversità dei colori, ma ciò richiederà un sistema di imaging in grado di discriminare fedelmente i fluorofori EGFP, mCerulean, mOrange e mCherry.
2. Eseguire la genotipizzazione al momento del prelievo cardiaco.
   NOTA: I topi Myh6-MerCreMer esprimono una ricombinasi Cre inducibile dal tamoxifene nei CM e possono essere genotipizzati utilizzando i primer PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) e GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) per generare un prodotto di 200 coppie di basi (bp). I topi R26R-Rainbow esprimono costitutivamente EGFP, ma esprimeranno stocasticamente mCerulean, mOrange o mCherry dopo la ricombinazione mediata da Cre. R26R-Rainbow può essere genotipizzato con i primer PCR CTCTGCTGCCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) e TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). L'allele wild type dà un prodotto di 350 bp e l'allele Rainbow dà un prodotto di 250 bp.

2. Criolesione e marcatura dei cardiomiociti

1. Eseguire criolesioni come descritto in precedenza con piccole modifiche^22,23. Posizionare con cura i topi di un giorno (P1) su un letto di ghiaccio tritato per 3 minuti per indurre l'arresto cardiaco. Confermare un'anestesia adeguata eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi senza ritiro riflessivo.
   NOTA: La tempistica dell'anestesia è fondamentale. La sopravvivenza può essere compromessa se i topi vengono raffreddati troppo a lungo. Inoltre, l'età dei topi è fondamentale. La capacità rigenerativa diminuisce bruscamente durante la prima settimana di vita¹⁰.
2. Posizionare il cucciolo anestetizzato su un impacco freddo e sotto l'obiettivo di un microscopio chirurgico da dissezione. Utilizzare microforbici da 6 mm per eseguire una toracotomia tra la 4a e la 5a costola per esporre la superficie anteriore del cuore.
3. Utilizzando una criosonda raffreddata in azoto liquido, posizionare la sonda sul ventricolo sinistro per 1-2 s. Per le lesioni fittizie, eseguire la toracotomia senza criolesione.
   NOTA: La durata della criolesione determina l'entità della lesione. Le lesioni prolungate diminuiscono i tassi di sopravvivenza.
4. Chiudere l'incisione con una sutura in polipropilene 6-0 attaccata a un ago di 0,15 mm di diametro.
5. Riscalda rapidamente il cucciolo e stimola manualmente per riprendere il flusso sanguigno. Una volta che il cucciolo si muove spontaneamente, posizionalo su un termoforo.
6. Iniettare ai cuccioli recuperati 20 μg di tamoxifene per via intraperitoneale. A questo punto, iniettare analgesici, come bupivacaina allo 0,25% lungo la linea di sutura, se necessario. Riporta i cuccioli alla diga.
   NOTA: I cuccioli di una singola cucciolata vengono recuperati insieme e riportati alla diga insieme. Questo flusso di lavoro migliora la sopravvivenza e la riaccettazione della lettiera da parte della diga.

3. Prelievo di cuori ed elaborazione per analisi istologica

1. Raccogliere i cuori a 20 giorni dopo l'infortunio (dpi) o il giorno postnatale (P21), poiché le risposte rigenerative possono essere osservate da questo punto^{temporale 10}. Prima sopprimere i topi in una camera inalatoria di CO₂ e poi trasferirli in un microscopio operatorio.
   NOTA: L'eutanasia deve essere eseguita in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso degli animali.
2. Una volta confermata una sufficiente anestesia, eseguire una doppia toracotomia utilizzando microforbici chirurgiche per esporre il cuore. Quindi, perfondere il cuore con 1 mL di 1 M KCl, 1 mL di paraformaldeide al 4% e 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: È necessario un lavaggio adeguato per limitare i coaguli di sangue intraventricolari che possono causare l'autofluorescenza durante l'acquisizione dell'immagine.
3. Dopo la perfusione, sezionare il cuore e metterlo in una provetta contenente almeno 1 mL di PBS.
4. Utilizzare un microscopio da dissezione per tagliare i cuori al fine di ottimizzare l'inclusione. Una fetta orizzontale sotto l'atrio fornisce una buona superficie per incorporare i cuori per le sezioni ad asse corto.
   NOTA: In alternativa, è possibile tagliare trasversalmente il cuore se si desiderano sezioni dell'asse lungo.
5. Immergere i cuori potati in 1 ml di saccarosio al 30% (peso/volume) a 4 °C per 12-18 ore. Rimuovere i campioni dalla soluzione di saccarosio. Incorporare il tessuto tagliato in blocchi utilizzando un mezzo di congelamento dei tessuti.
6. Congelare rapidamente il tessuto incorporato su ghiaccio secco e conservare i blocchi a -80 °C.
7. Sezionare i blocchi di cuore intero congelati in sezioni da 10 μm con un criostato, montarli su vetrini carichi e conservarli a -20 °C. Seziona in serie i cuori su 10 diapositive. Questo viene fatto montando una sezione su ciascuna delle 10 diapositive prima di tornare alla prima diapositiva per aggiungere un'altra sezione. Tale strategia limita la possibilità di catturare gli stessi CM su più sezioni di una determinata diapositiva.
   NOTA: Fare attenzione a limitare l'esposizione alla luce per evitare la perdita di fluorescenza.
8. Quando sono pronti per l'imaging, scongelare i vetrini e reidratarli in PBS. Aggiungere un mezzo di montaggio anti-sbiadimento prima di applicare un vetrino coprioggetti in vetro #1.5. Conservare i vetrini con coperchio in un contenitore coperto a 4 °C.
   NOTA: Per i risultati attesi per la criolesione, il lettore è indirizzato al lavoro precedente su questo argomento²³. Le sezioni cardiache hanno alti livelli di autofluorescenza. L'uso di agenti estinguenti, come il Sudan Black, prima dell'applicazione di un vetrino coprioggetti può aiutare a mitigare l'autofluorescenza. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per evitare di estinguere i fluorofori di interesse.

4. Imaging

NOTA: I passaggi seguenti si applicano all'uso di un microscopio commerciale (vedere la Tabella dei materiali) dotato di un sistema di fluorescenza verticale a campo largo con cubi filtranti attrezzati per discriminare i fluorofori mCerulean, EGFP, mOrange e mCherry e il software associato a questa configurazione (vedere la Tabella dei materiali). I passaggi aggiuntivi variano a seconda dell'esatto sistema di imaging utilizzato.

1. Immagine dell'intera diapositiva con un ingrandimento 5x con il solo filtro GFP per creare una mappa diapositiva.
2. Selezionare le singole sezioni della mappa di scorrimento che siano intatte e con autofluorescenza limitata per l'imaging. A causa del sezionamento seriale in set di 10 vetrini, le sezioni adiacenti saranno distanti almeno 100 μm, impedendo l'imaging degli stessi CM.
3. Esegui l'imaging a scansione delle piastrelle per le singole sezioni utilizzando un obiettivo 20x con i filtri mCerulean, mOrange, mCherry ed EGFP. Le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 1.
4. Salvare le immagini in un formato che consenta di recuperare le informazioni sui singoli canali. Fai attenzione a nominare i file in un formato che consenta di identificare il cuore, il fluoroforo e la posizione della sezione all'interno del cuore. Per le fasi computazionali riportate di seguito è necessario un approccio sistematico alla denominazione.

5. Analisi delle immagini per identificare i CM etichettati

1. Seleziona le sezioni di immagine che sono intatte da ciascun set e distribuiscile in modo casuale a tutti gli screener. Assicurati che gli screener rispettino i seguenti passaggi per ogni immagine.
2. Per ciascun canale (mCerulean, mOrange e mCherry), utilizzare lo strumento "Bilanciamento colore" su ImageJ²⁴ per regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine e aiutare l'utente a identificare le celle etichettate.
   NOTA: ImageJ è uno strumento gratuito di analisi delle immagini che può essere scaricato da https://imagej.net. Questo protocollo utilizzava la versione 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. In ImageJ, selezionare 'Imposta misure' dal menu a discesa 'Analizza'. Nella finestra che si apre, seleziona 'Area | Centro di massa | Rettangolo di delimitazione | Limite alla soglia».
   NOTA: Il modulo di sottrazione dell'immagine può talvolta essere utilizzato per migliorare il segnale del fluoroforo rispetto all'autofluorescenza di fondo. Tuttavia, se eseguita, la sottrazione deve essere eseguita sistematicamente per tutte le immagini in un set di dati.
4. Con l'immagine di interesse aperta, seleziona "Strumenti" e quindi seleziona "ROI manager" dal menu a discesa "Analizza". Si aprirà la finestra "ROI Manager".
5. Selezionare lo strumento "Selezioni a mano libera" dalla barra degli strumenti di ImageJ e tracciare la cella di interesse (Figura 2A). Una volta tracciato, premere 't' o utilizzare il pulsante 'Aggiungi [t]' nella finestra 'ROI manager' (Figura 2B). Ripetere per tutte le celle di un singolo canale.
   NOTA: La segmentazione e il ROI devono essere eseguiti separatamente per ciascun canale.
6. Una volta selezionate tutte le celle per un determinato canale, salva le ROI come file di .zip. Fallo selezionando prima "Deseleziona" nella finestra "ROI Manager" per assicurarti che non venga evidenziato alcun ROI. Quindi, fai clic sulla scheda "Altro" nella finestra "Gestione ROI" e seleziona l'opzione "Salva". Si aprirà il navigatore desktop, dove le ROI vengono salvate come file .zip.
7. Esporta le misurazioni per ciascuna delle ROI come file di .csv. Per fare ciò, assicurati che non sia evidenziato alcun ROI singolo, sempre selezionando "Deseleziona", quindi seleziona "Misura" nella finestra "Gestione ROI". Si aprirà una nuova finestra "Risultati" con tutte le misurazioni selezionate in precedenza.
8. Nella finestra 'Risultati' selezionare 'File', quindi selezionare 'Salva con nome' dal menu a discesa (Figura 2C). Questo aprirà nuovamente il navigatore desktop, in modo che il file possa essere salvato nel formato .csv.
   NOTA: Assicurati di salvare le ROI e le misurazioni prima di passare alla segmentazione del canale successivo.
9. Fai attenzione a nominare i file in un formato che consenta di identificare il cuore, il canale e la posizione della sezione all'interno del cuore. Ad esempio, "HeartType#_Set#_Section#_Channel" (ad esempio, "CI-1_Set4_S3_mOrange.zip" per le ROI e "CI-1_Set4_S3_mOrange.csv" per le misurazioni corrispondenti).
   NOTA: il codice seguente presuppone la convenzione di denominazione di cui sopra. Una diversa convenzione di denominazione richiederà la modifica del codice.

6. Analisi statistica

NOTA: Le cellule che portano lo stesso fluoroforo sono un mix di cellule di derivazione clonale (kin) e cellule non correlate che hanno subito un evento di ricombinazione casuale per esprimere lo stesso fluoroforo (non-kin). Sulla base dei dati precedenti¹⁷, si presume che le cellule parentali abbiano una vicinanza fisica più stretta rispetto alle cellule non parentali che esprimono lo stesso fluoroforo. Pertanto, le cellule parentali e non parentali possono essere differenziate in base a una soglia di distanza. Tuttavia, per determinare la soglia, le distribuzioni dei vicini più prossimi per le celle parentali e non parentali devono essere deconvolte. Fortunatamente, le distribuzioni dei vicini più prossimi per le cellule non parenti possono essere stimate valutando i valori dei vicini più vicini da ciascuna cella alla cella più vicina che trasporta un fluoroforo diverso. Qui viene presentata la metodologia per determinare statisticamente una distanza di soglia per definire la clonalità e per assegnare una probabilità di parentela tra le cellule.

1. Utilizzando i file .csv ottenuti dalla sezione 5, calcola le distanze dei vicini più prossimi per ogni cellula all'interno di una fetta di cuore. Compila questi risultati in distanze all'interno del canale (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange e mCherry-mCherry) e tra i canali (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry e mCherry-mCerulean). Salva i risultati in due file .csv: uno per le distanze all'interno del canale e uno per le distanze tra i canali.
   1. Installa il codice Python²⁵ che richiede le librerie numpy e pandas.
      > pip install numpy; pip install panda
   2. Calcola le distanze ed esporta i file .csv per le distanze all'interno del canale e tra i canali utilizzando Python snippet_6_1.py.
2. Leggi le distanze all'interno del canale e tra i canali in un frame di dati R²⁶ , convertendo gli identificatori del cuore in una variabile categoriale. Applicare una soglia scelta ad hoc osservando gli istogrammi dei vicini più vicini (Figura 3A,C) per ridurre al minimo i valori anomali. Assicurati di scegliere una soglia che copra oltre il 90% delle distanze tra i canali e all'interno dei canali, escludendo la coda lunga per evitare di compensare eccessivamente il rumore alle grandi distanze dei vicini più vicini. Questo protocollo utilizza una soglia di 400 μm (Figura 3). Utilizzare Rscript snippet_6_2.R per eseguire questo passaggio.
   NOTA: In alternativa, è possibile modellare più sezioni come variabili individuali. Questo protocollo limita la complessità del modello al livello del cuore per facilitare la modellazione e la stima.
3. Ottenere i logaritmi naturali per le distanze all'interno del canale e tra i canali. Poiché le celle sono entità non puntiformi che occupano spazio, la distribuzione minima della distanza del vicino più vicino è centrata attorno a un valore diverso da zero e ha code asimmetriche poiché la distanza massima tra le coppie di celle può essere sostanzialmente superiore ai valori mediani (Figura 3A,C). Utilizzare la distribuzione log-normale per modellare tali distribuzioni (Figura 3B, D). A tale scopo, utilizzare Rscript snippet_6_3.R.
4. Utilizzare il seguente modello bayesiano per stimare le medie e le varianze delle distribuzioni dei parenti (α₂, σ²₂) e dei non parenti (α₁, σ²₁) e la probabilità delle distanze all'interno del canale derivanti dalla distribuzione dei parenti (π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   dove Unif(a,b) è la distribuzione uniforme sull'intervallo [a,b], N(μ,σ²|l2 vincolate all'intervallo (l,u), T₁(0,1|x>0) è la distribuzione standard di Cauchy (T con 1 grado di libertà) vincolata alla semiretta positiva, bw.dist_i è la^{distanza tra le} coppie di canali registrata e wi.dist_i è la^{distanza tra le} coppie di canali registrata. Si noti che le distanze registrate all'interno del canale hanno una distribuzione di miscela a due componenti che riflette la mescolanza di coppie di celle parentali e non parentali.
   1. Se possibile, fornisci al modello delle informazioni preliminari. Ad esempio, questo protocollo prevede che le celle parentali siano più vicine l'una all'altra rispetto alle celle non parentali, quindi questo viene fornito come priori per la media della distribuzione delle distanze. Quindi, utilizzare i pacchetti R runjags²⁷ e coda²⁸ e il programma JAGS²⁹ per la stima dei parametri (Rscript snippet_6_4.R).
5. Eseguire il modello JAGS con il numero di catene corrispondente al numero di CPU disponibili. Utilizzare Rscript snippet_6_5.R per eseguire questo passaggio. Consentire l'esecuzione del software fino alla convergenza.
6. Utilizza le metriche per testare la convergenza dell'algoritmo, come la dimensione effettiva del campione (disponibile con runjags), la diagnostica di convergenza Gelman-Rubin (disponibile con runjags) e la sua autocorrelazione (autocorr/autocorr.diag disponibile in coda). Verificare la bontà dell'adattamento del modello stimato per le distanze dei vicini più prossimi ispezionando un grafico Q-Q, che traccia un confronto a livello di quantile dei valori effettivi e stimati per le distanze dei vicini più vicini utilizzando Rscript snippet_6_6.R (Figura 4C,F). Questo script richiede all'utente di modificare i valori nelle righe 25-29 di snippet_6_6.R in base all'output del comando 6.
   NOTA: Idealmente, per ciascuno dei parametri³⁰ si dovrebbe ottenere una dimensione del campione efficace (SSeff) superiore a 10.000. Tuttavia, un SSeff maggiore di 2.500 può essere adatto per alcuni modelli complessi. La diagnostica di Gelman Rubin è 1,00 per una convergenza perfetta e deve essere inferiore a 1,05 per una convergenza soddisfacente. Un'elevata autocorrelazione indica un lento mescolamento all'interno delle catene ed è un indicatore di lenta convergenza. Il grafico di autocorrelazione deve seguire un decadimento esponenziale nel caso di un buon modello. Il grafico Q-Q delle distribuzioni reali e modellate del vicino più vicino (Figura 4C,F) dovrebbe seguire la diagonale il più fedelmente possibile.
7. Dopo aver verificato l'accuratezza dei modelli, ottenere la probabilità che una coppia di celle sia imparentata in funzione della loro distanza. Per determinare una distanza di soglia per determinare se è probabile che le cellule all'interno del canale siano parenti, identificare la distanza alla quale la probabilità di essere parenti scende al di sotto di 0,5. Questo può essere fatto utilizzando Rscript snippet_6_7.R.
   NOTA: Soglie alternative possono essere scelte in base agli obiettivi sperimentali. Per alcune applicazioni, le soglie potrebbero non essere rilevanti e la probabilità di essere una coppia di parenti può essere utilizzata direttamente per pesare le coppie di cellule.

Risultati

Seguendo il protocollo per la criolesione neonatale si dovrebbero ottenere cuori P21 con e senza lesioni. I cuori crioferiti hanno una lesione ben circoscritta mentre la superficie dei cuori fittizi è liscia e omogenea. Nei cuori crioferiti, l'area della lesione dovrebbe essere coerente da cuore a cuore. Dopo la microscopia, si dovrebbero ottenere immagini simili alla Figura 1. Si noti che la risoluzione dell'immagine consente l'identificazione dei singoli CM e le condizioni di imaging conse...

Discussione

Il tracciamento del lignaggio multicolore è un approccio potente per identificare i modelli di crescita degli organi con la risoluzione di una singola cellula. Tuttavia, una delle principali limitazioni al tracciamento del lignaggio multicolore è la necessità di una marcatura sparsa delle cellule, che può ridurre la sensibilità per l'identificazione di eventi rari. Per organi come il cuore con livelli notoriamente bassi di turnover cellulare parenchimale, questo può portare a sottostime ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#1.5 vetrino coprioggetti	in vetro FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Mezzo di montaggio anti-sbiadimento	FisherScientific	00-4958-02
			inalazione CO2
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Cubi filtranti
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mouse
Software ImageJ			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Criostato Leica CM3050
azoto
, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2	topi The Jackson Laboratory	005657
Supporto per ago	World Precision Instruments	14109
Paraformaldeide 4%	FisherScientific
Pitone
salino tamponato
R			https://cran.r-project.org/
Shaker
rotante Stereoscopio
Saccarosio 30% (peso/vol)	FisherScientific	BP220
Forbici da dissezione chirurgica	World Precision Instruments	14393
Siringa per tamoxifene	VWR	BD328438
Tamoxifene, 20 μ g	Sigma	T5648
Terreno di congelamento dei tessuti	VWR	15148-031
Bianco Smerigliato/Vetrini Plus	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 sistema
Zen 2.5 Blu software