Articolo metodologico

Decellularizzazione senza detergenti del pancreas umano per la produzione di matrice extracellulare solubile (ECM)

DOI:

10.3791/61663

⸱

4 settembre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

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Sommario

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Il protocollo descritto in questo manoscritto spiega le fasi per la fabbricazione di una matrice extracellulare solubile (ECM) dal pancreas umano. La polvere solubilizzata di ECM ottenuta attraverso questo protocollo può essere utilizzata per la ricapitolazione del microambiente delle isole pancreatiche in vitro e, potenzialmente, in vivo.

Abstract

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Il trapianto di isole (ITx) ha il potenziale per diventare lo standard di cura nella medicina di sostituzione delle cellule beta, ma i suoi risultati rimangono inferiori a quelli ottenuti con il trapianto di pancreas intero. I protocolli attualmente utilizzati per l'isolamento delle isole umane sono sotto esame perché si basano sulla digestione enzimatica dell'organo, per cui il pancreas viene demolito, le sue connessioni con il corpo vengono perse e le isole vengono danneggiate in modo irreversibile. Il danno alle isole è caratterizzato da fattori critici come la distruzione della matrice extracellulare (ECM), che rappresenta il quadro 3D della nicchia insulare e la cui perdita è incompatibile con l'eufisiologia delle isole insulari. I ricercatori stanno proponendo l'uso di scaffold basati sulla MEC derivati dal pancreas dei mammiferi per affrontare questo problema e, in ultima analisi, migliorare la vitalità, la funzione e la durata della vita delle isole. I metodi attualmente disponibili per ottenere tali scaffold sono difficili perché sono in gran parte a base di detergenti. Pertanto, proponiamo un nuovo metodo privo di detergenti che crea meno danni alla MEC e può preservare i componenti critici della MEC pancreatica. I risultati mostrano che il protocollo di decellularizzazione di nuova concezione ha permesso di ottenere la completa clearance del DNA mentre i componenti della ECM sono stati mantenuti. La ECM ottenuta è stata testata per la citotossicità e incapsulata con isole pancreatiche umane che hanno mostrato un comportamento cellulare positivo con la secrezione di insulina quando stimolate con la sfida al glucosio. Collettivamente, proponiamo un nuovo metodo per la decellularizzazione del pancreas umano senza l'uso di detergenti chimici ionici e non ionici convenzionali. Questo protocollo e l'ECM ottenuto con esso potrebbero essere utili sia per applicazioni in vitro che in vivo.

Introduzione

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L'isolamento delle isole pancreatiche è un processo meticoloso effettuato attraverso la digestione enzimatica delle connessioni tra le isole e la loro struttura di supporto extracellulare circostante. Questa distruzione della matrice extracellulare (ECM) è uno dei fattori critici nella caratterizzazione del danno alle isole che avviene durante i processi di isolamento 1,2,3,4. L'ECM peri-insulare è un componente acellulare essenziale del pancreas endocrino. È composto da proteine e polisaccaridi, che interagiscono e si legano per formare una rete tridimensionale che supporta strutturalmente e biochimicamente l'omeostasi fisiologica e aiuta nella ricreazione di questo microambiente in vitro 2,5,6. La perdita di processi di segnalazione fondamentali tra le isole e la MEC è riconosciuta come uno dei fattori che contribuiscono a limitare la sopravvivenza delle isole in vitro e in vivo 2,7,8,9,10.

Le ECM di origine animale e umana sono state ampiamente utilizzate per la ricapitolazione del microambiente delle isole pancreatiche 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Poiché la capacità della ECM di migliorare l'attaccamento, la proliferazione e il mantenimento a lungo termine della coltura delle cellule insulari di ratto è stata riportata per la prima volta in ref.20, molti altri studi hanno fornito prove evidenti che il ripristino dell'interazione nativa della ECM con le isole umane migliora la funzione delle isole21,22. Ad esempio, dati recenti hanno dimostrato che le isole incapsulate con ECM hanno migliorato significativamente il controllo glicemico nei topi diabetici, migliorando e facilitando la somministrazione di insulina in una nuova piattaforma di somministrazione di insulina basata su cellule23. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che l'incorporazione di componenti critici della MEC pancreatica può migliorare significativamente la funzione endocrina delle cellule β 24,25,26,27.

I protocolli di produzione ECM presenti in letteratura si basano sull'applicazione di detergenti chimici, ad esempio Triton X-100 o sodio dodecil solfato (SDS). Nonostante forniscano un'eccellente clearance del DNA, le sostanze chimiche utilizzate nei processi di decellularizzazione sono citotossiche, costose e i residui sul tessuto decellularizzato destano preoccupazioni in vista di una potenziale applicazione clinica.

Sulla base di queste osservazioni, gli obiettivi di questo studio erano triplici: in primo luogo, sviluppare un metodo di decellularizzazione per il pancreas umano con un uso minimo di detergenti chimici ionici o non ionici; In secondo luogo, per produrre un'impalcatura ECM solubile per la coltura dei tessuti; In terzo luogo, caratterizzare la MEC pancreatica al fine di valutarne la citotossicità e l'impatto sulla funzione delle cellule insulari. La caratterizzazione è necessaria per tutte le applicazioni basate su colture cellulari, in quanto dimostra che la ECM pancreatica solubilizzata potrebbe essere utile nella ricapitolazione del microambiente pancreatico per le isole isolate. Nel presente documento viene descritto un metodo di decellularizzazione efficace e privo di detergenti per il pancreas umano, la caratterizzazione della MEC e l'effetto della MEC sulla vitalità e la funzione delle isole pancreatiche umane isolate incapsulate.

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Protocollo

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Questo studio di ricerca è stato approvato dal comitato di ricerca umana del Wake Forest Baptist Medical Center. Il pancreas umano è stato ottenuto eticamente da donatori di organi attraverso i servizi di donazione della Carolina. I donatori di organi sono stati sottoposti a screening per le malattie infettive rilevanti per l'uomo, secondo le normative UNOS. Gli organi sono stati ricevuti in una soluzione di conservazione sterile dove sono stati conservati fino all'uso. Al momento della consegna al laboratorio, tutti gli organi sono stati ispezionati e sono stati raccolti campioni del pancreas nativo per scopi istologici. Gli organi sono stati quindi congelati e conservati in condizioni sterili a -20 °C fino a un nuovo utilizzo.

1. Preparazione chirurgica del pancreas umano

NOTA: I pancreas congelati sono stati scongelati per una notte a 4 °C.

  1. Prima di iniziare la dissezione chirurgica del pancreas umano, preparare 1 L di soluzione di lavaggio, composta da 950 mL di acqua deionizzata (dH2O), 50 mL di reagente a base di iodio e soluzione Pen/Streptococco all'1%.
  2. Indossare guanti sterili e un camice da laboratorio durante la dissezione chirurgica. Eseguire tutti gli interventi chirurgici sotto una cappa per colture cellulari per evitare possibili contaminazioni.
  3. Trasferire il pancreas dalla sacca di trasporto sterile nella bacinella sterile della placenta. Assicurarsi che il pancreas sia orientato con la testa dell'organo a sinistra e la coda a destra.
  4. Sezionare con cura il duodeno dalla testa del pancreas utilizzando forbici sterili e pinze non dentate. Fare attenzione a non fare un buco nel duodeno, poiché ciò aumenta le possibilità di contaminazione.
    NOTA: Se viene praticato un foro nel tratto gastrointestinale, bloccare rapidamente il foro e procedere con la dissezione.
  5. Una volta completata la dissezione della testa del pancreas, smaltire il duodeno in un'apposita sacca per il rischio biologico e seguire le linee guida istituzionali per il suo smaltimento.
  6. Sezionare ed eliminare tutto il tessuto extra-pancreatico rimasto intorno alla testa del pancreas, compresi i principali vasi sanguigni e il dotto biliare comune, che di solito sono contrassegnati al momento del prelievo degli organi con suture non assorbibili. Smaltire il fazzoletto seguendo le linee guida istituzionali.
  7. Sezionare ed eliminare tutto il tessuto extra-pancreatico e il tessuto adiposo peripancreatico che circonda la coda del pancreas, esponendo i vasi sanguigni splenici.
  8. Una volta esposto il peduncolo vascolare della milza, rimuovere la milza e sezionare i vasi sanguigni della milza nella loro interezza, compresi quelli attaccati alla superficie posteriore del pancreas (l'arteria e la vena splenica). Smaltire la milza e rimuovere il tessuto seguendo le linee guida istituzionali.
  9. Sezionare e smaltire in modo appropriato il grasso extrapancreatico chiaramente visibile, in particolare il grasso peripancreatico.
    NOTA: A livello della coda del pancreas, il retroperitoneo può essere visibile. Questo deve essere sollevato con una pinza non dentata, rimosso di conseguenza con una pinza chirurgica e smaltito correttamente. Il pancreas dovrebbe ora essere libero da qualsiasi tessuto extra-pancreatico.
  10. Sezionare il pancreas per ottenere 1 cm3 cubi di tessuto pancreatico utilizzando forbici chirurgiche, lame istologiche sterilizzate o bisturi chirurgici. I cubi di tessuto pancreatico ottenuti dopo questa dissezione subiranno il processo di decellularizzazione. Il numero medio di cubi pancreatici che subiscono decellularizzazione dipende dalle caratteristiche intrinseche dell'organo. In media, tra i 40 e i 60 cubi pancreatici sono stati sottoposti a decellularizzazione nello studio presentato.
  11. Procedi al passaggio 2.1

2. Decellularizzazione del tessuto pancreatico

NOTA: Questo protocollo è stato utilizzato con pancreas con un peso medio di 100 g; Pertanto, non è consigliabile superare questo peso quando si utilizza questa tecnica di decellularizzazione.

  1. Porre tutto il tessuto pancreatico precedentemente sezionato al punto 1.10 in un contenitore di plastica sterile (vedi Tabella dei materiali) con la soluzione di lavaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
  2. Rimuovere il tessuto pancreatico con l'aiuto di una pinza sterile e metterlo in un nuovo contenitore sterile che contenga acqua deionizzata sterile e priva di endotossine. Chiudere saldamente il tappo del contenitore e posizionarlo su uno shaker orbitale refrigerato con una temperatura impostata di 4 °C e una velocità di agitazione compresa tra 180 e 200 giri/min per 24 ore.
  3. Rimuovere il contenitore con il tessuto pancreatico e pulire adeguatamente l'esterno prima di inserirlo nella cappa per continuare il processo.
  4. Rimuovere il tessuto pancreatico utilizzando una pinza chirurgica e metterlo in un nuovo contenitore sterile, insieme a 1 litro di acqua deionizzata, 50 mg di DNasi I e cloruro di magnesio allo 0,0025%. Chiudere bene il tappo del contenitore e inserirlo in uno shaker orbitale, con una temperatura preimpostata di 37 °C e una velocità di agitazione di 100 giri/min per 6 h.
  5. Preparare la soluzione EDTA-Trizma
    1. Raccogli un nuovo contenitore sterile da 1 L e puliscilo adeguatamente prima di introdurlo nella cappa. Per preparare 1 litro di soluzione di EDTA-Trizma, aggiungere quanto segue: 985 ml di acqua deionizzata sterile, 7,5 ml di tampone Tris-HCl e 7,5 ml di soluzione di EDTA. Conservarlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
  6. Rimuovere il contenitore che racchiude il tessuto pancreatico e pulire opportunamente l'esterno prima di introdurlo nella cappa per il proseguimento del processo.
  7. Rimuovere il tessuto pancreatico con l'aiuto di una pinza chirurgica e metterlo in un nuovo contenitore sterile con 1 L di soluzione a base di EDTA-Trizma. Chiudere saldamente il tappo del contenitore e metterlo in uno shaker orbitale, con una temperatura preimpostata di 4 °C e una velocità di agitazione compresa tra 180 e 200 giri/min per 18 ore.
  8. Rimuovere il contenitore contenente il tessuto pancreatico e pulire adeguatamente l'esterno prima di introdurlo nella cappa per il processo.
  9. Rimuovere il tessuto pancreatico con l'aiuto di una pinza sterile e metterlo in un nuovo contenitore sterile con acqua deionizzata sterile priva di endotossine. Chiudere bene il tappo del contenitore e posizionarlo su uno shaker orbitale refrigerato, con una temperatura impostata di 4 °C e una velocità di agitazione compresa tra 180 e 200 giri/min per 24 h.
    NOTA: Durante questo periodo di lavorazione, ci sarà un notevole cambiamento di colore, in cui il tessuto apparirà più luminoso.
  10. Raccogliere il tessuto pancreatico e conservarlo in provette da centrifugazione sterili da 50 mL, raggiungendo un massimo di 25 mL per provetta per il successivo congelamento e liofilizzazione. Il numero di provette da centrifugazione varia a seconda delle dimensioni del pancreas. Conservare i campioni a -80 °C.

3. Produzione di polvere ECM pancreatica – liofilizzazione e crio-macinazione

  1. Dopo un minimo di 24-40 ore di conservazione del materiale decellularizzato a -80 °C, trasferire la ECM pancreatica in un liofilizzatore.
  2. Trasferire il materiale congelato in un liofilizzatore, evitando che il materiale si scongeli.
    NOTA: La fase di liofilizzazione dura circa 3-5 giorni a seconda di diversi fattori, come la quantità di materiale in ogni tubo sottoposto al processo e la superficie esposta per la liofilizzazione. Si raccomanda che il tessuto decellularizzato non superi il livello di 25 mL in ciascuna provetta e che le provette siano congelate a un angolo di 45°, consentendo una maggiore esposizione di una superficie maggiore una volta iniziata la liofilizzazione. Rimuovere i coperchi dai tubi.
  3. Dopo la liofilizzazione, trasferire i materiali in una cappa per colture cellulari.
  4. Taglia ogni pezzo della ECM essiccata a metà delle sue dimensioni usando delle forbici sterili. Questi pezzi ECM essiccati saranno sottoposti a un processo di macinazione automatizzato per produrre una polvere ECM. Utilizzare un processore automatico criomacinato per evitare un aumento della temperatura e la conseguente denaturazione delle proprietà biologiche dell'ECM. Assicurarsi di regolare l'impostazione della criofresatrice per ottenere una polvere fine dopo il processo di macinazione.
    NOTA: In questo studio è stato utilizzato pancreas di donatori con un BMI < 30. La pancreata da donatori con un BMI > 30 ha mostrato una tendenza a contenere più grasso intraparenchimale. Il processo di liofilizzazione non è considerato ottimale e può essere inibito dal contenuto di grassi. Se dopo la liofilizzazione il tessuto è visibilmente oleaginoso, deve essere scartato in quanto non sarà ottimale per la produzione della polvere ECM.

4. Solubilizzazione della ECM pancreatica

NOTA: A questo punto, da un pancreas di medie dimensioni (100 g), la resa della polvere pancreatica decellularizzata è di 1-2 g.

  1. Pesare 1 g di polvere ECM con l'aiuto di una spatola di plastica sterile.
  2. Ottenere la solubilizzazione seguendo i protocolli precedentemente descritti: Solubilizzare 1 g di ECM in 100 mL di 0,01 M HCl e 100 mg di pepsina per 48 ore a RT con agitazione costante28.
  3. Dopo 48 ore, utilizzare NaOH per neutralizzare il pH (pH = 7) della ECM acida, mantenendo il becher contenente la ECM acida sul ghiaccio per evitare la gelificazione.
    NOTA: La cinetica di gelificazione varia in base alla temperatura, al contenuto di collagene, al pH e alla soluzione neutralizzante. In questo studio di ricerca, sono stati utilizzati 0,01 M di NaOH. Il volume di NaOH aggiunto per la neutralizzazione del pH è stato di circa 100 ml. Prendere in considerazione la possibilità di misurare il pH più volte mentre si neutralizza la soluzione acida della ECM.
  4. Trasferire la soluzione neutra ECM in provette da centrifuga sterili da 50 mL. Chiudere le provette e metterle in una centrifuga. Centrifugare le provette contenenti la MEC solubilizzata alla massima velocità (12.000 x g) per 15 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, trasferire le provette in una cappa per coltura cellulare.
    NOTA: Dopo la centrifugazione del campione, il componente insolubile della MEC verrà depositato sul fondo della provetta, mentre la soluzione ECM solubilizzata si troverà nella parte superiore del surnatante.
  5. Utilizzando tecniche sterili, raccogliere il surnatante della provetta contenente la soluzione ECM solubilizzata e trasferirlo in provette fresche da 50 mL, raggiungendo un massimo di 25 mL per provetta.
  6. Conservare le provette della soluzione ECM a -80 °C.

5. Produzione di polvere ECM pancreatica – liofilizzazione e conservazione

  1. Dopo almeno 24-40 ore di conservazione della soluzione ECM solubile a -80 °C, trasferire le provette in un liofilizzatore.
  2. Trasferire il materiale congelato in un liofilizzatore, assicurandosi che il materiale non si scongeli.
    NOTA: La fase di liofilizzazione dura circa 3-5 giorni a seconda di diversi fattori, come la quantità di materiale in ogni tubo sottoposto al processo e la superficie esposta per la liofilizzazione. Si raccomanda che la soluzione ECM solubilizzata non superi il livello di 25 mL in ciascuna provetta e che le provette siano congelate a un angolo di 45° per consentire una maggiore esposizione di una superficie maggiore una volta iniziata la liofilizzazione. Rimuovere i coperchi dal tubo di falco prima della liofilizzazione.
  3. Dopo la liofilizzazione della soluzione ECM solubilizzata, trasferire il materiale in una cappa per colture cellulari. Dopo la completa liofilizzazione, sarà visibile una polvere fine di ECM.
    NOTA: La resa ottenuta è di 700 mg da 1 g di tessuto decellularizzato.
  4. Conservare la polvere ECM solubilizzata o utilizzarla per la coltura cellulare.
    NOTA: Si consiglia di conservare l'ECM a 4 °C per un uso immediato, a -20 °C per un uso successivo e a -80 °C per una conservazione a lungo termine.

6. Caratterizzazione della MEC pancreatica con colorazione istologica

  1. Raccogliere un pezzo di pancreas nativo subito dopo la consegna dell'organo e prima della decellularizzazione. Fissare questo per 24 ore in formalina al 10%. Lavare i campioni in acqua deionizzata. Disidratarlo in alcool graduato prima di immergerlo nella paraffina e tagliarlo in sezioni di 5 mm.
  2. Al termine del processo di decellularizzazione, raccogliere un campione del materiale decellularizzato e fissarlo per 24 ore in formalina al 10%. Lavare il campione in acqua deionizzata. Disidratarlo in alcool graduato prima di immergerlo nella paraffina e tagliarlo in sezioni di 5 mm.
  3. Per verificare la riuscita della decellularizzazione, eseguire la colorazione H&E e DAPI sia sul pancreas nativo che sulla controparte decellularizzata.
  4. Per la caratterizzazione istologica, eseguire le colorazioni Trichrome (MT) e Alcian Blue (AB) di Masson, che evidenzieranno rispettivamente le strutture collagene e GAG.

7. Caratterizzazione della polvere solubile di ECM

  1. Eseguire l'analisi del contenuto di DNA e del collagene totale del tessuto pancreatico nativo e della polvere ECM solubile come descritto in precedenza29.
  2. Quantificare i glicosaminoglicani solfatati (sGAG) in base al protocollo fornito da un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per misurare il contenuto di sGAG solfato nella ECM pancreatica a una lunghezza d'onda di 595 nm30.
    NOTA: Riportare il contenuto di DNA come ng/mg di tessuto secco e il contenuto di collagene e GAG come μg/mg di tessuto secco.

8. Incapsulamento delle isole umane con la ECM e la cultura

NOTA: Le isole pancreatiche umane sono state ottenute commercialmente (vedi Tabella dei materiali).

  1. All'arrivo, la coltura delle isole pancreatiche umane in piastre trattate con coltura non tissutale per 24 ore in condizioni standard con una densità approssimativa di 2.000 IEQ in ogni piastra da 10 cm.
  2. Manipolare le isole umane per testare l'effetto della ECM sulla funzionalità e la vitalità delle isole con i seguenti gruppi sperimentali: Isole libere, Isole incapsulate in alginato e Isole incapsulate in alginato-ECM.
    NOTA: I suddetti gruppi di isole sono stati coltivati in vitro in condizioni standard per un massimo di 8 giorni per valutare l'effetto della ECM sulla funzionalità e sulla vitalità delle isole.
  3. Pesare l'alginato su una bilancia e sospenderlo con HBSS in una provetta da centrifugazione per ottenere un rapporto dell'1,5% (p/v). Posizionare la provetta da centrifuga su un rotatore per una notte a 4 °C.
    NOTA: Il produttore ha riportato un peso molecolare compreso tra 75 e 200 kDA e un rapporto G/M di ≤ 1 per l'alginato.
  4. Pesare 0,1 mg di ECM e sospenderlo in 1 mL di alginato precedentemente preparato in modo da avere una concentrazione di ECM di 0,1 mg/mL.
  5. Incapsulare le isole pancreatiche umane in alginato e alginato-ECM secondo un protocollo31 precedentemente descritto. La procedura è descritta in breve di seguito.
    1. Raccogliere e miscelare delicatamente 3.000 IEQ in 1 mL di alginato e 3.000 IEQ in 1 mL di alginato-ECM a una concentrazione ECM di 0,1 mg/mL precedentemente preparata nella fase 8.4.
    2. Pompare le sospensioni ottenute attraverso un dispositivo di incapsulamento microfluidico impostato a 0,2 mL/min e portata e pressione dell'aria di 2,0 Pa, rispettivamente.
    3. Al momento della produzione, raccogliere le microcapsule in 100 mM di bagno CaCl2 con 10 mM di HEPES. Lasciare reticolare l'alginato per 10 minuti.
    4. Prima di essere coltivate, lavare le isole incapsulate con HBSS in condizioni standard, per 2-3 minuti a 37 °C, con CO2 al 5%.
    5. Aggiungere i terreni di coltura (vedere Tabella dei materiali) e cambiare due terzi dei terreni a giorni alterni fino alla fine dell'esperimento.
      NOTA: I passaggi di cui sopra devono essere eseguiti sia per le isole in alginato che per le isole in alginato-ECM.
  6. Il giorno 8, dopo l'incapsulamento, eseguire la secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) e l'analisi del DNA per valutare rispettivamente la produzione di insulina e la vitalità delle isole.
  7. Ottenere immagini in campo chiaro e colorazione Live/Dead di isole libere e incapsulate per valutare la morfologia e la vitalità cellulare.
    NOTA: La valutazione qualitativa delle immagini è stata eseguita per valutare la salute delle isole. I parametri presi in considerazione includono la forma, il bordo, l'integrità e il diametro delle isole, nonché la presenza di singole cellule in coltura.

9. Rilascio di insulina stimolato dal glucosio (GSIS) e misurazione del DNA

NOTA: Il giorno 8, dopo l'incapsulamento, le isole pancreatiche umane sono state raccolte e incubate con il tampone di Kreb, contenente concentrazioni di glucosio basse (2,8 mM) e alte (16,8 mM), seguite da una soluzione di depolarizzazione KCl (25 mM). Il test di provocazione del glucosio è stato eseguito con la modifica di un protocollo precedentemente descritto32.

  1. Inserire la resina filtrante su gel in colonne di polipropilene.
  2. Inserire i gruppi di trattamento (isole libere o isole incapsulate) nella parte centrale della resina di filtrazione su gel all'interno delle colonne in polipropilene.
  3. Pipettare il glucosio e le soluzioni depolarizzanti nelle colonne di polipropilene sopra descritte e incubare per 1 ora, nel seguente ordine: eseguire un periodo di pre-incubazione con una soluzione di glucosio a bassa molarità, quindi procedere con una serie di incubazioni con soluzione di glucosio bassa, alta, bassa e depolarizzante come indicato nella NOTA all'inizio della sezione 9.
  4. Raccogliere il terreno da ogni fase di incubazione e conservarlo a -80 °C per la successiva analisi.
  5. Dopo l'incubazione e la raccolta della soluzione depolarizzante, incubare le isole pancreatiche umane con 1 mL di tampone di estrazione del DNA e conservarlo fino a ulteriori analisi.
  6. Misurare il contenuto di insulina dall'incubazione del glucosio e della soluzione depolarizzante con un test ELISA per insulina, seguendo il protocollo del produttore.
  7. Misurare il contenuto di DNA dal tampone di estrazione raccolto al punto 9.5 utilizzando un kit per il dosaggio del DNA seguendo il protocollo del produttore.
  8. Normalizzare le misurazioni dell'insulina in base al contenuto di DNA.

10. Analisi statistica

NOTA: I confronti di gruppo si riferiscono allo stesso lotto di isole umane con n = 3 valutazioni indipendenti condotte per ogni saggio descritto in questo manoscritto. I valori sono espressi come media ± SD.

  1. Utilizzare un software statistico per eseguire il test di Mann-Whitney per la valutazione della decellularizzazione e l'analisi dei residui di DNA, confrontare la ECM nativa, quella decellularizzata e quella solubilizzata.
  2. Eseguire un t-test spaiato per la valutazione dei glicosaminoglicani e del collagene tra il nativo, il pancreas decellularizzato e la ECM solubilizzata.
  3. Eseguire un'ANOVA a 2 vie con confronti multipli post-hoc della Turchia per il test di stimolazione del glucosio nella valutazione della stimolazione delle isole il giorno 8.
  4. Si consideri la significatività statistica a p < 0,05 con la designazione di *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001.

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Risultati

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I campioni pancreatici nativi e acellulari sono stati processati per la colorazione istologica con H&E, MT e AB. La colorazione H&E ha mostrato la completa assenza di materiale nucleare e cellule, confermando il successo della decellularizzazione. Le colorazioni MT e AB hanno mostrato la struttura della ECM, evidenziando rispettivamente le componenti qualitativamente collagene e stromale (Figura 1).

Questo metodo ha permesso la generazione costante di una ...

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Discussione

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L'obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo di decellularizzazione più delicato e privo di detergenti per produrre ECM pancreatica. L'attenzione è stata rivolta alla conservazione dei componenti ECM del parenchima pancreatico e all'evitare una lunga esposizione tissutale a detergenti chimici ionici o non ionici convenzionali durante il processo di decellularizzazione.

L'aspetto più innovativo del metodo di decellularizzazione sviluppato...

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Dichiarazioni

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Non ci sono interessi finanziari concorrenti da dichiarare da parte di nessuno dei coautori.

Ringraziamenti

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 646272. Le isole pancreatiche umane sono state ottenute dai laboratori Prodo, Aliso Viejo, CA 92656.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Corning 1L Easy Grip Polistirene Storage Bottles con tappi da 45 mmThermoFisher430518Contenitore per la decellularizzazione
Mulino criogenicoSPEX Certiprep6870-230
Deossiribonucleasi I da pancreasbovino Sigma AldrichDN25
Acqua distillataThermoFisher15230147
Falcon 50mL conico Provette da centrifugaCorning352070
Pancreas umanoe
insulina-ElisaMercodia10-1113-01
Cloruro di magnesio, 1M, sterileBio-World41320004-1
Pepsina dalla mucosa gastrica suinaSigma AldrichP7012-5G
Bacino della placenta senza coperchio, sterileDeRoyal32-881
Provette per cromatografia PolypreBio-rad731-1500Colonne in polipropilene
Quant-iT PicoGreen dsKit per il dosaggio del DNAInvitrogenP7589Kit DNA
SamplePrep Accessorio per congelatore/mulino di grande capacità SPEX6801Set di fiale di macinazione grandi
Perle Sephadex G-10Cytiva17001001Resina
per filtrazione in gelKit chirurgicocon
UltraPur 0,5 M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7,5ThermoFisher15567027
Acqua distillata UltraPure DNasi/RNasiThermoFisher10977023

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

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Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

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