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Articolo metodologico

Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi

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DOI:

10.3791/61672

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1 maggio 2021

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Qui è presentato un protocollo per l'isolamento e l'amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.

Abstract

La superficie oculare era un tempo considerata immune privilegiata e abiotica, ma recentemente sembra che ci sia una piccola ma persistente presenza commerciale. L'identificazione e il monitoraggio delle specie batteriche nella mucosa oculare sono stati impegnativi a causa della loro bassa abbondanza e della limitata disponibilità di una metodologia appropriata per la crescita e l'identificazione commensal. Esistono due approcci standard: metodi basati sulla cultura o sequenziamento del DNA. Il primo metodo è problematico a causa dei batteri recuperabili limitati e il secondo approccio identifica sia i batteri vivi che morti che portano a una rappresentazione aberrante dello spazio oculare. Abbiamo sviluppato un metodo robusto e sensibile per l'isolamento batterico basandoci su tecniche di coltivazione microbiologiche standard. Questa è una tecnica a base di tampone, utilizzando un tampone sottile "in-lab" realizzato che si rivolge alla congiuntiva inferiore, seguita da una fase di amplificazione per i generi anaerobici aerobici e facultativi. Questo protocollo ci ha permesso di isolare e identificare specie congiuntivali come Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. L'approccio è adatto a definire la diversità commenale nei topi in diverse condizioni di malattia.

Introduzione

Lo scopo di questo protocollo è quello di migliorare l'isolamento specifico di microbi anaerobici aerobici e facultativi vitali e rari dalla congiuntiva oculare per caratterizzare il microbioma oculare. Studi approfonditi hanno profilato le comunità mucose commenali sulla pelle, l'intestino, le vie respiratorie e genitali e mostrano che queste comunità influenzano lo sviluppo del sistema immunitarioe la risposta 1,2,3. Le comunità commenali oculari hanno dimostrato di cambiare durante alcune patologie della malattia, come la malattia dell'occhiosecco 4,la sindrome di Sjogren5 e il diabete6. Tuttavia, la capacità di definire una tipica comunità commensale di superficie oculare è ostacolata dalla loro abbondanza relativamente bassa rispetto agli altri siti dimucosa 6,7,8. Ciò suscita una controversia sul fatto che esista un microbioma oculare residente e se esiste, se differisce dal microbioma cutaneo e, di conseguenza, il suo effetto locale sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario innato. Questo protocollo può aiutare a risolvere questa domanda.

Generalmente, gli approcci per definire la nicchia commensal oculare si basano sul sequenziamento e sulle tecnichebasate sulla cultura 4,7,9. 16 Il sequenziamento s rDNA e l'analisi BRISK7 mostrano una diversità più ampia rispetto alle tecniche basate sulla cultura, ma non sono in grado di distinguere tra microbi vivi e morti. Poiché la superficie oculare è ostile a molti microbi a causa delle proprietà antimicrobiche4 del film lacrimale che generano una vasta gamma di frammenti di DNA, gli approcci basati sul DNA rileveranno questi artefatti che possono distorcere i dati verso l'identificazione di batteri morti come commensal residenti piuttosto che contaminanti. Ciò si traduce in un'identificazione commensale aberrante e nella caratterizzazione dello spazio oculare come più elevato nell'abbondanza e nella diversità dei microbi10. Ciò rende difficile definire il microbioma oculare residente tramite metodi basati sul DNA. Considerando che le tecniche standard basate sulle impostazioni cultura non sono in grado di rilevare commensals perché il carico ètroppo basso 11. Il nostro metodo migliora le pratiche standard utilizzando un tampone sottile in grado di colpire la congiuntiva, evitando così la contaminazione dalla pelle vicina, così come il concetto che gli organismi vitali possono essere arricchiti da una breve coltura in mezzi densi di nutrienti con l'obiettivo di rianimare vitale ma non culturabile, oltre che arricchente per rari microbi vitali.

I risultati, l'abbondanza relativa di commensali oculari per tampone oculare, caratterizzano il microbioma residente congiuntiva e sono importanti per scopi comparativi. I nostri dati mostrano che c'è una differenza tra pelle e microbiota congiuntivale, così come una maggiore diversità con l'aumento dell'età e una differenza di abbondanza specifica per sesso. Inoltre, questo approccio ha trovato riproducibilmente differenze commenali nei topi knock-out12. Questo protocollo può essere applicato per descrivere il microbioma oculare che può variare a causa di pratiche di permanenza in gabbia, geografia o stato di malattia, così come gli effetti locali dei metaboliti commensali e dei prodotti sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi seguono le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Segui le linee guida sulla sicurezza di laboratorio (come indicato dal tuo dipartimento istituzionale per la salute e la sicurezza ambientale) quando lavori con microrganismi e materiali potenzialmente contaminati. Utilizzare recipienti di rifiuti appropriati e procedure di decontaminazione prima dello smaltimento di materiali contaminati potenzialmente a rischio biologico.

1. Preparazione del tampone oculare, configurazione del campo di lavoro, tampone per gli occhi del topo e arricchimento del campione

  1. Preparare tamponi sterili per gli occhi
    NOTA: I tamponi sterili per gli occhi sono stuzzicadenti in legno sottilmente rivestiti con uno strato sottile di fibra di cotone che batte e realizzato in casa.
    1. Autoclave quantità appropriata di batting di cotone e stuzzicadenti per il numero di topi da tamponare.
    2. Pizzicare un pezzo di cotone lungo mezzo centimetro che batte con pollice e indice. Stuzzicare la battuta tirando i bordi con pollici e indice per formare un singolo strato poroso piatto, fermandosi poco prima che la battuta cada a pezzi (piccoli pezzi di cotone dispersi durante la battuta allungata sono accettabili).
    3. Ruotare la battuta attorno a una delle estremità affilate dello stuzzicadenti tenendo leggermente il pezzo allungato sulla punta dello stuzzicadenti mentre è attorcigliato, vedere Figura 1. Il tampone per gli occhi "completato" avrà uno strato molto sottile di cotone allungato sulla punta, che si estende a circa la metà-un centimetro di distanza dalla punta.
    4. Inserire tamponi "completati" in un piccolo becher, lato tampone verso il basso e coprire. autoclave.
  2. Configurare l'area di lavoro
    1. Preparare l'anestesia contenente 2 ml di ketamina (100 mg/mL), 400 μL di xiazina (100 mg/ml) e 27,6 ml di soluzione salina sterile (0,9% NaCl in dH2O) in un tubo sterile sterile di centrifuga da 50 ml sterile. Sterilizzare il filtro e l'anestesia aliquota per un uso immediato (può essere conservato a 4 °C per 1 mese; consentire sempre di equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso).
    2. Pulire e pulire l'area di lavoro con disinfettante per ridurre al minimo la contaminazione.
    3. Aliquota 0,5 ml di supporti sterili per infusione di cuore cerebrale (BHI) in tubi di microcentrifugo sterile da 1,5 ml etichettati (1 tubo per mouse e controllo); disporre in rack a microcentrifugo. Mettere il rack sul ghiaccio.
    4. Impostare il flusso di lavoro come segue (da sinistra a destra): stazione di anestetizzazione del topo (gabbia contenente topi sperimentali, gabbia sterile vuota, anestesia a temperatura ambiente, ago da 25 G e siringa da 1 ml), stazione di tamponamento degli occhi (BHI aliquota sul ghiaccio, tamponi sterilizzati per gli occhi, asciugamani di carta puliti, spray isopropanolo al 70%) e stazione di placcatura (piastre di agar del sangue a temperatura ambiente, pipette da 10 μL , 10 μL discariche sterili, contenitore di rifiuti a rischio biologico).
  3. Tampone oculare
    1. Somministrare 10 μL di anestesia per 1 g di dosaggio del peso del topo di chetamina e xiazina rispettivamente per via intraperitoneale a ciascun topo adulto e posizionare in una gabbia autoclavata. Testare l'anestesia spremendo il cuscinetto del piede posteriore; nessun movimento indica un'anestesia appropriata.
    2. Assegnare una mano per gestire solo topi anestetizzati e l'altra mano per gestire solo il tampone oculare e la coltura. Per tamponare, rimuovere il topo completamente anestetizzato dalla gabbia; posto sopra la superficie di lavoro pulita posizionata sul lato con l'occhio sinistro esposto. Mani guantate spray con isopropanolo, asciutte con tovagliolo di carta pulito.
    3. Uncap ha etichettato specificamente il tubo di micro-centrifuga BHI con mano di movimentazione dei supporti dedicata. Riposizionare il tubo nel rack della micro-centrifuga sul ghiaccio.  Immergere la punta rivestita di cotone del tampone per gli occhi in BHI, ritirare il tampone per gli occhi dal tubo ruotando la punta 2 volte contro la camera d'aria per rimuovere il liquido in eccesso.
    4. Con la mano di movimentazione del mouse, tenere delicatamente il mouse per la tracolla del collo. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro, vedere figura 2A. Premere leggermente il bulbo oculare e spostare il tampone in un movimento di lavaggio della finestra (Figura 2B) avanti e indietro, tra la palpebra inferiore e l'occhio, 10 volte. Mantenere una pressione costante.
    5. Senza toccare la pelliccia, rimuovere delicatamente la punta del tampone, perpendicolare al punto in cui è stata inserita, e posizionare il lato di cotone tampone verso il basso direttamente in un tubo di micro-centrifuga etichettato contenente supporti BHI. Applicare un colliro lubrificante sull'occhio tamponato.
    6. Riportare il topo nella gabbia.
    7. Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio e rimuovere il tampone per gli occhi con la mano guantata sterilizzata mescolando la punta nel supporto per 10 rotazioni. Ritirare il tampone ruotando la punta contro la parete interna del tubo di micro-centrifuga per 5 rotazioni. Smaltire il tampone in un contenitore a rischio biologico.
    8. Ripetere i passaggi da 1.3.2 a 1.3.7 per ogni mouse e per i campioni di controllo (pelle o tampone di pelliccia). Sterilizzare i guanti in modo appropriato tra ogni tampone.
  4. arricchimento
    1. Arricchire il campione incubando il tubo in modo statico per 1 h a 37 °C
    2. Durante l'incubazione, etichettare una soia triptatasi a temperatura ambiente con una piastra di agar del sangue di pecora al 5% (piastra TSA) per topo e dividerla a metà.
    3. Dopo l'incubazione della coltura del tampone oculare, rimuovere i campioni arricchiti dall'incubatrice e posizionare sul ghiaccio.
    4. Campioni di vortice brevemente da mescolare e placcare secondo lo schema nella figura 3A. Aliquota 10 μL del campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia, ripetere 2 volte.
    5. Dall'altro lato della linea di demarcazione della piastra, punto 10 μL di campione sull'agar, ripetere 9 volte.
    6. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore, 2 giorni e 4 giorni (in una camera pulita che impedisce l'essiccazione delle piastre di agar). Contare le colonie in strisce, notare la morfologia e calcolare le unità di formazione delle colonie (CNO) per tampone per isolati morfologicamente simili. Guarda i punti per organismi unici non catturati a strisce.

2. Piastra principale, caratterizzazione e identificazione dei microbi oculari

  1. Piastra principale
    1. Disegnare griglie sul retro di una piastra TSA (Figura 3B). Scegli una colonia con uno stuzzicadenti sterile da ogni piastra del tampone per gli occhi del mouse e strisci il quadrato della piastra principale (griglie), la griglia delle etichette con il numero di colonia e le informazioni sul mouse. Scegli e placca tre diverse colonie per ogni colonia morfologicamente distinta.
    2. Incubare la piastra durante la notte a 37 °C. Continuare l'incubazione per 96 ore, controllando quotidianamente la comparsa di nuovi isolati.
      NOTA: La popolazione di Commensal varierà in base all'età del topo, all'alimentazione, allo stato della malattia e alle pratiche di permanenza in gabbia. La caratterizzazione isolata si basa sui batteri anaerobici aerobici e facultativi predominanti presenti nel nostro laboratorio.
  2. caratterizzazione
    1. Duplicarei microbi a 13 piastre sulle piastre Mannitol Salt Agar (MSA) e MacConkey (MAC), incubare durante la notte a 37 °C. Si noti la crescita per ogni isolato e la presenza di colonie cere o colonie gialle con alone su MSA.
    2. Per i cocci gram positivi, prova con il test dellacatalasi 13,14. Posizionare una goccia di perossido di idrogeno al 3% su uno scivolo di vetro pulito. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, scegliere il microbo corrispondente dalla piastra del tampone per gli occhi. Nessuna formazione di bolle indica Streptococcus spp., leggera formazione di bolle indica Corynebacterium spp. e forse Aerococcus spp.
  3. Identificazione: analisi MALDI-TOF MS
    NOTA: Le identificazioni batteriche vengono effettuate utilizzando il MALDI-TOF e il Database software. Questo sistema utilizza la ionizzazione del desorbimento laser assistito da matrice-tempo di spettrometria di massa di volo (MALDI-TOF MS) per lo sviluppo di profili di spettri che vengono confrontati con spettri batterici noti per l'identificazione. E.coli, ATCC 8739, viene utilizzato per la calibrazione del sistema.
    1. La piastra batterica si isola su piastre TSA contenenti il 5% di sangue di pecora e incuba durante la notte con il 5% di anidride carbonica a 37 °C.
    2. Utilizzando un loop da 1 μL, applicare uno strato sottile dei batteri puri allo scivolo bersaglio MALDI-TOF; 1 μL di soluzione a matrice CHCA MALDI-TOF MS (acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico) è sovrapposto e lasciato asciugare completamente all'aria prima di caricare lo scivolo nello strumento MALDI-TOF.
    3. Ogni isolato viene individuato in duplicato.
    4. I rapporti contenenti punteggi di probabilità superiori all'80%, che indicano un elevato valore di discriminazione, sono accettati come risultati affidabili e l'identificazione batterica accettata.

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Risultati

I risultati rappresentativi di una piastra per tamponi per gli occhi che dimostra diversi metodi di placcatura sono raffigurati nella figura 3A che mostra isolati morfologicamente diversi dal mouse C57BL/6. Per ogni isolato distinto, le colonie sono state contate nella striscia e l'abbondanza relativa, unità di formazione delle colonie uniche (CTU) per tampone oculare, calcolate e tracciate a scopo di confronto. Per la caratterizzazione microbiologica, i batteri sono stati prelevati da singo...

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Discussione

A causa dello stato paucibacterial della superficie oculare, molti laboratori hanno avuto difficoltà a isolare i commensaloculari 7,20, con conseguente basso numero di campioni con crescita, bassa abbondanza e bassa diversità8. Questo metodo migliora significativamente le pratiche di coltura standard4,21 con l'aggiunta di una fase di arricchimento, nonché un tampone per gli occhi r...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

I finanziamenti del P30 DK034854 hanno supportato VY, LB e studi nel Massachusetts Host-Microbiome Center e finanziamenti da NIH/NEI R01 EY022054 supportato MG.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
da 0,1 a 10 µ l puntale per pipettaUSA Scientific1110-300autoclave prima dell'uso
da 0,5 a 10 &; l. Pipetta EppendorfFisher Scientific13-690-026
Siringa da 1 mlFisher ScientificBD3096231 siringa per ogni gruppo di tampone oculare
Provette Eppendorf da 1,5 mlScientific1615-5500prima dell'uso
1000 & micro; ml punta della pipettaUSA Scientific1111-2021autoclave prima dell'uso
da 200 a 1000µ l Gilson pipetman (P1000)Fisher ScientificF123602G
ago da 25 gFisher Scientific14-826AA1 ago per gruppo di tampone oculare
3 % Perossido di idrogenoFisher ScientificS25359
37 ° C IncubatoreAttrezzature
70 % IsopropanoloFisher ScientificPX1840-4
Ana-Sed Injection (Xilazina 100 mg/ml)Santa Cruz Animal HealthSC-362949Rx
BD BBL Kit per macchie di GramFisher ScientificB12539
Bunsen BurnerAttrezzature
da laboratorio Asciugamani di carta puliti attrezzature
Cotone Imbatta/Cotone arrotolato sterileCVS
Monouso 1 ml PipetteFisher Scientific13-711-9AMper test di colorazione di Gram e catalasi
E.coliATTCATCC 8739
VetriniFisher Scientific12-550-A3per test di colorazione di Gram e catalasi
Ketamina ( 100mg/ml)Henry Schein9950001
Mac Conkey Agar PlatesFisher Scientific4321270negozio a 4 ° deg; C fino al momento dell'uso
Mannitol Salt AgarCarolina Biological Supply784641Preparare le piastre secondo le istruzioni del mfr, conservare a 4 gradi; C per 1 settimana
TopiJackson LabsC57/BL6J
Piastre di PetriFisher Scientific08-757-12per Mannitolo Sale piastre di agar
RPI Brain Heart Infusion MediaFisher Scientific50-488525preparare secondo le indicazioni e autoclave
SteriFlip (0,22 & micro; m dimensione dei pori solfone di poliestere)EMD/Millipore, Fisher ScientifcSCGP00525per sterilizzare l'anestesia
Tubo da centrifuga sterile per corningScientific430829preparazione all'anestesia
Gabbia sterile per topiAttrezzature
Stuzzicadenti (bambù rotondo)Autoclave Kitchen Essentialsprima dell'uso e preparazione
del tamponeTrypticase Soy Agar II con il 5% di piastre di sangue di pecoraFisher Scientific4321261negozio a 4 ° C fino al momento dell'uso
Vetrino bersaglioBioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MSBioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS Soluzione a matrice CHCABioMerieux Inc. Durham, NC411071
Collirio monousoCVS PharmacyBausch e Lomb Soothe Lubrificante Collirio, 28 fiale, 0,02 fl oz.
Autoclave USA da laboratorio Fisher da laboratorio

Riferimenti

  1. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
  3. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
  4. Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
  5. Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
  6. Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
  7. Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
  8. Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
  9. Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
  10. Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
  11. Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
  12. Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547(2020).
  13. Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
  14. Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
  15. UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
  16. Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
  17. Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
  18. Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
  19. Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
  20. Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117(2018).
  21. Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880(2017).
  22. Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
  23. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
  24. Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
  25. Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56(2019).
  26. Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831(2019).
  27. Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
  28. Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
  29. Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855(2016).
  30. Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
  31. Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
  32. Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
  33. Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11(2020).
  34. Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).

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