Articolo metodologico

Isolamento di tessuti ad alta purezza dai semi d'orzo in via di sviluppo

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DOI:

10.3791/61681

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26 ottobre 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento manuale ad alta purezza e il controllo di qualità di embrioni, endosperma e tessuti materni da seme durante lo sviluppo dell'intero seme d'orzo.

Abstract

Comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo delle sementi di cereali è essenziale per la selezione delle piante e l'aumento della resa. Tuttavia, l'analisi dei semi di cereali è impegnativa a causa delle dimensioni minime, del carattere liquido di alcuni tessuti e delle strette connessioni tra i tessuti. Qui, dimostriamo un protocollo dettagliato per la dissezione dell'embrione, dell'endosperma e dei tessuti materni del seme nelle fasi iniziali, medie e tardive dello sviluppo del seme d'orzo. Il protocollo si basa su una dissezione manuale dei tessuti con strumenti a punta fine e un microscopio binoculare, seguita da un controllo della purezza basato sull'analisi della ploidia. I tessuti materni e gli embrioni sono diploidi, mentre l'endosperma è un tessuto triploide. Ciò consente il monitoraggio della purezza del campione mediante citometria a flusso. Ulteriori misurazioni hanno rivelato l'alta qualità dell'RNA isolato da tali campioni e la loro utilizzabilità per analisi ad alta sensibilità. In conclusione, questo protocollo descrive come sezionare praticamente i tessuti puri provenienti da chicchi in via di sviluppo di orzo coltivato e potenzialmente anche da altri cereali.

Introduzione

I semi sono strutture complesse composte da diversi tessutidi origine materna e filiale1. I chicchi di cereali rappresentano un tipo speciale di seme, la maggior parte dei quali è formata dall'endosperma, un tessuto triploide specializzato che protegge e nutre l'embrione. I cereali forniscono circa il 60% delle risorse alimentari globali e sono la produzione più preziosa della produzione vegetale2. La conoscenza dei processi molecolari che controllano lo sviluppo delle sementi di cereali è importante per la loro importanza economica e il ruolo centrale nella riproduzione delle piante 1,3.

L'orzo coltivato (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5,1 Gbp) è la quarta coltura cerealicola più importante a livello mondiale. Viene utilizzato per i mangimi, gli alimenti e le biotecnologie4. Oltre a ciò, è anche una specie modello di coltura cerealicola classica della zona temperata di crescente importanza5. Le risorse genomiche dell'orzo includono mappe genetiche, collezioni di cultivar, varietà autoctone e mutanti, assemblaggi e annotazioni genomiche di alta qualità, nonché dati trascrittomici delle principali fasi di sviluppo 5,6,7. Inoltre, i geni dell'orzo vengono utilizzati per miglioramenti genetici di altri cereali. La resistenza agli stress abiotici come la siccità e la salinità, ai patogeni specifici e l'alto contenuto di composti benefici (ad esempio, β-glucano) rendono l'orzo una preziosa fonte di tratti per l'allevamento del grano8.

Lo sviluppo del seme viene avviato dalla fecondazione il giorno dell'impollinazione (DOP). La DOP è definita dalla valutazione della morfologia dello stigma e delle antere secondo la scala di Waddington (W10.0)9. Le spighe contenenti fiori non impollinati erano caratterizzate da stimmi compatti (non ramificati) e antere verdi, mentre le spighe impollinate contenevano spiklets estesi, stimmi estesi e ampiamente ramificati, ovuli rigonfi, antere aperte e polline libero. I fiori alla DOP rappresentavano un fenotipo intermedio. Le antere avevano un colore giallo, si rompevano facilmente e poi rilasciavano polline. Lo stigma aveva rami sigmatici ampiamente diffusi del pistillo (Figura 1C).

Lo sviluppo dei semi d'orzo comprende tre fasi parzialmente sovrapposte 1,10. La fase I (0 – 6 giorni dopo l'impollinazione; DAP) si avvia per doppia fecondazione, caratterizzata dalla proliferazione cellulare e dall'assenza di sintesi di amido; lo stadio II (7 – 20 DAP) comprende la differenziazione e un grande guadagno di biomassa accompagnati dalla produzione di molecole di stoccaggio di amido e proteine; Lo stadio III (dopo 21 DAP) corrisponde alla maturazione del seme, alla riduzione del peso mediante essiccazione e all'inizio della dormienza. In alternativa, le fasi sono chiamate precoce, media e tardiva, rispettivamente11.

Il chicco d'orzo è coperto da gusci che consistono nel lemma, nella palea e nelle glume12. Nella maggior parte dei genotipi di orzo, i gusci avvolgono strettamente i semi secchi. Il seme stesso è formato dall'embrione, dall'endosperma e dai tessuti materni del seme (Figura 1A). L'embrione diploide ha origine dalla fecondazione della cellula uovo da parte di un nucleo di spermatozoi. Nel seme completamente sviluppato, l'embrione è costituito dall'asse embrionale con la coleorhiza che circonda la radichetta, il coleoptile che racchiude il meristema del germoglio e le foglie primarie e lo scutello (cotiledone)1,10,13,14. L'endosperma triploide è il risultato della fecondazione della cellula centrale diploide da parte del secondo nucleo di cellule spermatiche. La proliferazione dell'endosperma inizia con lo stadio sinciziale (cenocita), in cui i nuclei in divisione vengono spinti verso la periferia dal vacuolo centrale. Al termine della fase sinciziale, i microtubuli formano una rete radiale attorno ai nuclei e indicano la formazione della parete cellulare anticlinale e l'inizio della cellularizzazione dell'endosperma. La differenziazione dell'endosperma avviene contemporaneamente alla cellularizzazione e si traduce in cinque tessuti principali: l'endosperma amidaceo, le cellule di trasferimento, gli strati aleurone e subaleurone e la regione circostante l'embrione. I tessuti materni da seme sono una struttura diploide multistrato di origine materna contenente pericarpo e rivestimenti del seme10,12. I tessuti materni del seme includono una proiezione nucellare sul lato dorsale del chicco che ha una funzione correlata al trasporto e viene incorporata nell'endosperma nelle fasi successive dello sviluppo del seme15.

figure-introduction-1
Figura 1: Sviluppo dei semi d'orzo. (A) Il disegno schematico del chicco di cereale al piano sagittale con indicati i tessuti materni del seme (SMT, verde), l'endosperma (END, giallo), l'embrione (EMB, arancione) e i gusci (H, grigio). (B) Morfologia della spiga d'orzo vicino all'antesi. Barra della scala = 1 cm. (C) Morfologia dello stigma e delle antere nelle fasi prima, durante e dopo l'impollinazione. Il riquadro mostra il dettaglio dello stigma con granuli di polline (punte di freccia). Barra graduata = 5 mm, barra inserita = 200 μm. (D) Sezioni sagittali e trasversali di 4, 8, 16 e 24 semi DAP. (NP, proiezione nucellare) Barra della scala = 5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I recenti progressi nella genomica ad alto rendimento forniscono gli strumenti per lo studio dello sviluppo dei singoli tessuti delle sementi. Tuttavia, l'ostacolo principale di questo scopo è la struttura compatta e la stretta adesione dei tessuti del seme1. Abbiamo sviluppato un protocollo per la dissezione ad alta purezza dei tessuti dei semi, dai semi d'orzo in via di sviluppo, con possibilità di utilizzo successivo per analisi altamente sensibili, come il sequenziamento dell'RNA. Inoltre, il protocollo presentato può essere facilmente adattato ad altri cereali.

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Protocollo

1. Piante in crescita

NOTA: Considerando che una singola pianta d'orzo di solito ha da 5 a 6 tiller e solo le 5 o 6 spighette centrali di ciascuna spiga dovrebbero essere utilizzate per la dissezione, allora una resa massima per pianta è di 72 semi per le cultivar a due file e 216 semi per le cultivar a sei file.

  1. Per far germogliare i semi d'orzo, prepara una capsula di Petri imbottita con tre strati di carta velina di cellulosa ricoperti da uno strato di carta da filtro. Idratatela con acqua distillata, in modo che non ci sia acqua in eccesso, mettete i semi sulla superficie e chiudete la capsula di Petri. La carta filtrante evita la crescita delle radici attraverso il tessuto di cellulosa. Germinare i semi per 3 giorni a 25 °C al buio.
    NOTA: In alternativa, fai germogliare i semi mettendoli direttamente in una miscela di terreno umido (vedi passaggio 1.2).
  2. Trasferisci i semi germinati con una radichetta visibile e un germoglio di circa 5 cm in vasi di torba di 5 cm x 5 cm con una miscela di terra e sabbia (3:1, v/v). Innaffia regolarmente. Dopo 10 giorni, trasferisci le piante in vasi di 12 cm x 12 cm riempiti con la stessa miscela di terreno.
  3. Coltivare le piante in camera climatica in regime di giornata lunga controllata (16 h giorno 20 °C, 8 h notte 16 °C; intensità luminosa 200 μmol m-2 s-1; umidità 60%).
    NOTA: L'orzo primaverile richiede circa 8-10 settimane dalla semina all'inizio dell'antesi, senza necessità di vernalizzazione. L'orzo invernale ha bisogno di 7-8 settimane di vernalizzazione (condizioni di giorno corto, 8 ore al giorno 4 °C, 16 ore di notte a 4 °C; intensità della luce 200 μmol m-2 s-1; umidità 85%) per indurre la fioritura.

2. Determinazione dell'impollinazione

NOTA: Per una corretta stima della progressione dello sviluppo è necessaria una determinazione precisa dell'impollinazione. L'orzo è una specie autoimpollinante. Per definire il giorno dell'impollinazione (DOP), abbiamo monitorato il giorno dell'autoimpollinazione. Questo tratto è specifico della cultivar, ma la sporgenza iniziale delle alette dalla guaina fogliare è un buon indicatore dell'avvicinarsi alla DOP (Figura 1B).

  1. Aprire la guaina fogliare che copre la punta. Usa una pinzetta a punta fine per controllare le antere e l'ovaio all'interno delle spighette nella parte centrale della punta. Le spighette con antere gialle e stigma "soffice" impollineranno entro poche ore16 e sono considerate DOP (Figura 1B).
  2. Taglia la punta vicino alla punta dell'ultima spighetta e rimuovi la foglia della bandiera e la parte superiore delle tende da sole. Quindi, taglia via il 1/3 superiore degli scafi in ogni spighetta. Questo asciuga le antere e porta alla loro apertura e rilascio più sincronizzati di polline.
  3. Coprire la spiga con un sacchetto di glassine con l'ID della punta, il numero della pianta e la data DOP definita. Ciò impedisce anche l'impollinazione incrociata, che può compromettere esperimenti specifici.
  4. Annotare le informazioni in un editor tabulare. Utilizzare la seguente formula per calcolare il giorno dopo l'impollinazione (DAP) in cui dovrebbe avvenire l'isolamento dei tessuti.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP previsto
    NOTA: I valori devono avere il formato 'Dati'.
  5. Per la dissezione dei tessuti delle sementi, raccogliere le punte al DAP secondo il calendario tabellare preparato.

3. Dissezione dei tessuti del seme

NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti utilizzando uno stereomicroscopio. Rimuovere i gusci prima della dissezione utilizzando una pinzetta. Si noti che gli scafi diventano più asciutti e più aderenti a partire da circa 16 DAP. Per mantenere le condizioni fisiologiche ed evitare l'essiccazione dei materiali vegetali durante la dissezione, inumidire i campioni mettendoli in una goccia di 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4). Utilizzare un nuovo seme per la dissezione di ogni tessuto per evitare la degradazione di DNA, RNA o proteine a causa del tempo di raccolta del campione prolungato. Per l'isolamento dell'RNA dal materiale sezionato, utilizzare solo materiali e sostanze chimiche prive di RNasi. Non superare il tempo totale di dissezione di 15 minuti per un campione costituito tipicamente da tessuti sezionati da 5-10 semi per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.

  1. Rimuovere il resto dei gusci usando una pinzetta a punta fine prima della dissezione dei tessuti. Idratare con 1× PBS per 1 minuto aiuta a rimuovere i residui secchi della spighetta.
  2. Posizionare il seme sbucciato su una capsula di Petri con una goccia di 1× PBS e sezionare le singole parti utilizzando una pinzetta a punta fine, un ago sottile e una pipetta microcapillare. Una strategia leggermente diversa viene applicata per la dissezione di singoli tessuti: i tessuti materni del seme (fase 3.3), l'embrione (fase 3.4) e l'endosperma (fase 3.5).
  3. Dissezione dei tessuti materni del seme
    1. Dissezione da semi fino a 8 DAP
      1. Posizionare un seme sul lato dorsale e tagliare delicatamente il seme lungo un asse longitudinale, quindi staccare i tessuti materni del seme tranne l'ultimo strato che confina con l'endosperma dalla parte apicale a quella basale usando una pinzetta.
      2. Raccogliere i tessuti materni da 5 a 10 semi in una provetta da 1,5 ml con 50 μl di PBS 1×, scartare il tampone con una pipetta, sciacquare il tessuto due volte con 100 μl di PBS, rimuovere il tampone in eccesso mediante pipettaggio e chiudere la provetta e congelare in azoto liquido o utilizzare direttamente per la misurazione della ploidia citofluorimetrica. La quantità di materiale è sufficiente per un'applicazione a valle (ad esempio, isolamento dell'RNA o misurazione della ploidia citofluorimetrica).
    2. Dissezione dai semi dopo 8 DAP
      1. Posizionare un seme sul lato dorsale, tagliare delicatamente al centro del lato ventrale dei tessuti materni del seme e staccare gradualmente il tessuto attorno al seme intero, compresa la proiezione nucellare. Per ogni applicazione a valle, raccogliere e lavare il tessuto da 5 a 10 semi come descritto al punto 3.3.1.
  4. Dissezione dell'embrione
    1. Dissezione da semi a 8 DAP e più giovani
      1. Metti un seme sul lato dorsale e taglia 1/3 basale del seme. Dividere con cura la parte separata a metà e rilasciare l'embrione. Per ogni applicazione a valle, raccogliere e lavare gli embrioni da 10 a 20 semi, come descritto al punto 3.3.1.
    2. Dissezione dai semi dopo 8 DAP
      1. Metti un seme sul lato dorsale e rimuovi i tessuti materni del seme dalla parte basale del lato ventrale. Disturbare delicatamente il sottile strato di endosperma attorno al perimetro dell'embrione con aghi sottili o pinzette a punta fine e staccare l'embrione. Per ogni applicazione a valle, raccogliere e lavare gli embrioni da un massimo di 5 semi, come descritto al punto 3.3.1.
  5. Dissezione dell'endosperma
    1. Dissezione dell'endosperma sinciziale da 4 semi DAP.
      1. Metti un seme sul lato dorsale e rimuovi i tessuti materni del seme tranne l'ultimo strato di cellule che confina con l'endosperma. Perforare delicatamente lo strato al centro del lato ventrale con un ago sottile e aspirare l'endosperma sinciziale con un'azione capillare utilizzando una pipetta microcapillare.
      2. Per ogni applicazione a valle, raccogliere endosperme liquide da 10 a 15 semi in una nuova provetta da 1,5 mL con tampone adatto all'analisi a valle pianificata (ad esempio, 1x PBS, tampone di isolamento dell'RNA, tampone per citometria a flusso). Il volume del tampone deve riflettere il protocollo per l'applicazione a valle pianificata. Congelare in azoto liquido.
    2. Dissezione dell'endosperma celullarizzante da 5 a 8 semi DAP
      1. Metti un seme sul lato dorsale e rimuovi tutti i tessuti materni e l'embrione del seme. Per ogni applicazione a valle, raccogliere e lavare l'endosperma da 10 a 15 semi in una nuova provetta da 1,5 ml con 1x PBS e congelare in azoto liquido.
    3. Dissezione dell'endosperma celullarizzato dal seme dopo 8 DAP
      1. Posizionare un seme sul lato dorsale, rimuovere tutti i tessuti materni del seme e l'embrione. Per ogni applicazione a valle, raccogliere e lavare l'endosperma da un singolo seme per provetta, come descritto nella fase 3.3.1.
  6. Conservare le provette con materiale isolato a – 80 °C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Controllo della purezza dei tessuti mediante citometria a flusso

NOTA: La purezza del campione può essere verificata utilizzando la citometria a flusso prima dell'isolamento dell'RNA. Una corretta taratura dello strumento è fondamentale per l'analisi del campione biologico. L'ottica del citometro a flusso/analizzatore di ploidia deve essere regolata utilizzando perle di calibrazione (microsfere di polistirene colorate in fluorescenza altamente uniformi rispetto alle loro dimensioni e intensità di fluorescenza) fino alla massima nitidezza del picco, raggiungendo tipicamente il coefficiente di variazione (CV) < 2%. I tessuti delle sementi di cereali contengono principalmente popolazioni di G1, G2 e nuclei endoreduplicati; Pertanto, si consiglia di utilizzare una scala logaritmica. Inizia con un tessuto fogliare che contiene principalmente nuclei G1 e funge da controllo della ploidia basale.

  1. Utilizzare campioni appena preparati conservati su ghiaccio (vedere il passaggio 3.3.1) o tessuto congelato come descritto17.
    NOTA: Poiché l'intero campione DAP < 8 viene utilizzato per la citometria a flusso, questo rappresenta solo un controllo indiretto. Raccomandiamo ai ricercatori di eseguire più isolamenti e misurazioni fino a raggiungere un'elevata percentuale di campioni puri (>90%) prima di procedere all'isolamento dell'RNA con < 8 campioni DAP.
  2. Rilasciare i nuclei dai campioni di embrioni DAP da 4 e 8 (per gli altri campioni vedere il passaggio 4.4) omogeneizzando i tessuti mediante 5-10 giri del pestello di plastica in una provetta da 1,5 ml contenente 300 μl di tampone Otto I (0,1 M di acido citrico monoidrato, 0,5% (v/v) Tween 20, filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm)18.
  3. Filtrare la sospensione grezza attraverso una rete di nylon da 50 μm in una provetta per analisi di citometria a flusso e aggiungere 600 μL di tampone Otto II (0,4 M Na2HPO4·12H2O) contenente 2 μg di mL-1 DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo)18 per colorare il DNA.
  4. Posizionare tutti gli altri tessuti (compresi 16 embrioni DAP o più vecchi) su una piastra di Petri contenente 500 μl di tampone Otto I e omogeneizzare tritando con una lama di rasoio. Filtrare la sospensione come al punto 4.3 e colorare con 1 mL di tampone Otto II contenente DAPI.
    NOTA: La manipolazione con una lama di rasoio affilata a doppio taglio richiede un'attenzione particolare. Per ridurre il rischio di lesioni, sono disponibili lame di rasoio a filo singolo o supporti per lame speciali.
  5. Stimare il contenuto di DNA nucleare del campione utilizzando un citometro a flusso. Per analizzare la purezza del campione sono necessarie almeno 2000 particelle per campione.

5. Isolamento dell'RNA e misurazione della qualità

  1. Utilizzare il tessuto congelato per prevenire la degradazione dell'RNA da parte delle ribonucleasi endogene. Da semi, tessuti materni e campioni di embrioni, isolare l'RNA utilizzando kit disponibili in commercio o il reagente TRIzol19. A causa dell'elevato contenuto di amido nei tessuti dell'endosperma, isolare l'RNA totale da tutti i campioni utilizzando protocolli commerciali di estrazione dell'RNA su colonna per tessuti problematici (ad esempio, Spectrum Plant Total RNA Kit) con un trattamento DNasi I su colonna20.
  2. Misura la concentrazione e l'integrità dell'RNA utilizzando un protocollo dedicato per l'elettroforesi su gel di RNA o il bioanalizzatore Agilent 2100.
    NOTA: L'RNA totale intatto ha bande/picchi di rRNA 18S e 25S chiari di dimensioni rispettivamente intorno a 1,9 e 3,7 kb. La banda dell'rRNA 25S dovrebbe essere circa due volte più intensa della banda dell'rRNA 18S.

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Risultati

Per eseguire un'analisi trascrittomica tessuto-specifica dello sviluppo dei semi d'orzo, abbiamo stabilito un protocollo per l'isolamento dei tessuti ad alta purezza. Il protocollo si basa sulla dissezione manuale di embrioni, endosperma e tessuti materni da seme da grani pelati (dopo la rimozione manuale del guscio) (Figura 1A). Il protocollo è stato utilizzato con successo per isolare materiali da diverse cultivar di orzo primaverile a due e sei file, e le spighe sono state raccolte in un ...

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Discussione

Qui presentiamo un protocollo che consente l'isolamento ad alta purezza dei tessuti dei semi d'orzo. Sebbene sia stato sviluppato e testato per l'orzo, può essere facilmente adottato da altri membri della tribù delle Triticeae come il grano, l'avena, la segale o il triticale27. La parte iniziale del protocollo, incentrata sulla dissezione del tessuto del seme, non richiede attrezzature non standard o costose e quindi dovrebbe essere accessibile a molti sc...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Jan Vrána e il Dr. Mahmoud Said per la manutenzione dei citometri a flusso, Eva Jahnová per la preparazione dei tamponi, Marie Seifertová per l'elenco dei materiali e Zdenka Bursová per la cura delle piante. Questo lavoro è stato sostenuto principalmente dalla sovvenzione della Czech Science Foundation 18-12197S. A.P. è stato ulteriormente sostenuto dalla borsa di studio J. E. Purkyně dell'Accademia ceca delle scienze e dal progetto FESR "Le piante come strumento per lo sviluppo globale sostenibile" (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro da 0,22 umMerckSLGSV255F
1,5 ml Eppendorf tuboSarstedt72.690.001
4',6-diamidido-2-fenilindoloInvitrogenD21490
50 um rete di nylonSilk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Bulb AssemblyDrummond Scientific Company1-000-9000
Perline di calibrazioneInvitrogenA16502
velina di cellulosa
Acido citrico monoidratoPenta13830-31000
Camera climaticaWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter cartaFagron
Pinzette a punta fineFine Science Tools11254-20
Citometro a flussoSysmex-Partec
Tubo per citometria a flussoSarstedt55.484
Congelatore
Glassine bag
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Azoto liquidoLinde
Pipetta microcapillareFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Vasi per torbaJiffy5x5 cm
Piastra
PortaspilliFine Science Tools26016-12
Pestello in plasticap-LabA199001
Vasi12x12 cm
Lama di rasoioGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Forbici da sabbia
Strumenti di scienza fine14060-11
Kit RNA totale per piante con spettro
StereomicroscopioOlympus
P2287
Reagente TRIzolInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
Carta Petri del suolo Sigma Aldrich STRN50 Tween 20 Sigma Aldrich

Riferimenti

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