Articolo metodologico

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

DOI:

10.3791/61683

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5 agosto 2021

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1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Abstract

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Le condizioni degenerative della retina (RD) associate alla perdita dei fotorecettori come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la retinite pigmentosa (RP) e l'amaurosi congenita di Leber (LCA) causano una perdita progressiva e debilitante della vista. C'è un bisogno insoddisfatto di terapie in grado di ripristinare la visione una volta che i fotorecettori sono stati persi. Il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) (organoidi) nello spazio sottoretinico di un occhio con RD avanzata porta fogli di tessuto retinico con migliaia di fotorecettori sani privi di mutazioni e ha il potenziale per trattare la maggior parte / tutte le malattie accecanti associate alla degenerazione dei fotorecettori con un protocollo approvato. Il trapianto di tessuto retinico fetale nello spazio sottoretinico di modelli animali e persone con RD avanzata è stato sviluppato con successo, ma non può essere utilizzato come terapia di routine a causa di preoccupazioni etiche e limitato apporto di tessuti. I modelli animali di degenerazione retinica ereditaria (IRD) dei grandi occhi sono preziosi per lo sviluppo di terapie di ripristino della vista che utilizzano approcci chirurgici avanzati per trapiantare cellule / tessuti retinici nello spazio sottoretinico. Le somiglianze nelle dimensioni del globo e nella distribuzione dei fotorecettori (ad esempio, la presenza di un'area centrale della regione simile alla macula) e la disponibilità di modelli IRD che ricapitolino strettamente l'IRD umana faciliterebbero la rapida traduzione di una terapia promettente alla clinica. Qui viene presentata una tecnica chirurgica di trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC nello spazio sottoretinico di un grande modello animale che consente la valutazione di questo approccio promettente in modelli animali.

Introduzione

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Milioni di persone in tutto il mondo sono colpite dalla degenerazione retinica (RD) con conseguente compromissione visiva o cecità associata alla perdita dei fotorecettori sensibili alla luce (PR). La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una delle principali cause di cecità derivante da una combinazione di fattori di rischio genetici e fattori ambientali / stile di vita. Inoltre, oltre 200 geni e loci sono stati trovati per causare RD ereditaria (IRD)1. La retinite pigmentosa (RP), l'IRD più comune, è geneticamente eterogenea con più di 3.000 mutazioni genetiche in circa 70 geni segnalati 2,3,4. Anche l'amaurosi congenita di Leber (LCA), che causa cecità nell'infanzia, è geneticamente eterogenea 5,6. La terapia di aumento genico è stata sviluppata ed è in studi clinici per il trattamento di un piccolo numero di IRD 3,7. Tuttavia, deve essere sviluppata una terapia separata per il trattamento di ciascuna forma genetica distinta di IRD e quindi trattare solo un piccolo sottogruppo di pazienti. Inoltre, l'aumento genico si basa sulla presenza di una popolazione di fotorecettori salvabili e, pertanto, non è applicabile per la degenerazione avanzata.

Vi è, quindi, un bisogno clinico urgente e ancora insoddisfatto per lo sviluppo di terapie che affrontino e trattino le RD avanzate e la cecità da profonda a terminale. Negli ultimi 2 decenni gli impianti neuroprotesici sono stati sviluppati e testati in modelli animali di grandi dimensioni, come il gatto, prima dell'uso umano 8,9,10,11,12,13,14. Allo stesso modo, negli ultimi 20 anni sono state sviluppate terapie di sostituzione della retina retinica di mammiferi embrionali o addirittura mature innestate sottoretiniche 15,16,17,18,19,20,21,22 e persino testate con successo in pazienti con RD 23,24,25. Entrambi gli approcci utilizzano l'idea di introdurre nuovi sensori (fotodiodi fotovoltaici al silicio nel caso di dispositivi neuroprotesici26,27 e fotorecettori sani privi di mutazioni organizzati in fogli, nel caso di impianto di fogli retinici) nella retina con PR degenerati. Studi recenti hanno studiato l'uso di approcci basati su cellule staminali come il trapianto di progenitori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)28,29, fotorecettori hPSC 30 e organoidi retinici hPSC31,32,33. Gli organoidi retinici consentono la formazione di tessuto retinico in un piatto e la derivazione di fogli fotorecettori con migliaia di PR privi di mutazione, che assomigliano allo strato di fotorecettori nella retina fetale umana in via di sviluppo 34,35,36,37,38,39,40. Il trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di pazienti con condizioni di RD è uno dei nuovi e promettenti approcci di terapia cellulare sperimentale, perseguito da un certo numero di team31,32,41,42. Rispetto al trapianto della sospensione cellulare (di giovani fotorecettori o progenitori della retina), è stato dimostrato che fogli trapiantati di fotorecettori fetali determinano miglioramenti della vista negli studi clinici23,24.

Il protocollo qui presentato descrive, in dettaglio, una procedura di trapianto per la consegna sottoretinica dell'intero organoide retinico (piuttosto che dei bordi organoidi33,41) come un modo potenzialmente migliore per introdurre fogli retinici intatti con PR, per aumentare la sopravvivenza dell'innesto e migliorare la conservazione del foglio. Sebbene le procedure per l'introduzione di un pezzo piatto di retina umana e anche di cerotti RPE siano stati sviluppati43,44,45, il trapianto di innesti 3D più grandi non è stato studiato. Gli organoidi retinici derivati dalle cellule staminali forniscono una fonte inesauribile di fogli fotorecettori per lo sviluppo di tecnologie di ripristino della vista, sono privi di restrizioni etiche e sono considerati un'eccellente fonte di tessuto retinico umano per terapie incentrate sul trattamento della RD avanzata e della cecità terminale46. Lo sviluppo di metodi chirurgici per l'impianto sottoretinico preciso di organoidi retinici con lesioni minime alla nicchia retinica dell'ospite (retina neurale, epitelio pigmentato retinico e vascolarizzazione retinica e coroideale) è uno dei passi critici per far avanzare tale terapia verso applicazioni cliniche31,32. Grandi modelli animali come gatti, cani, maiali e scimmie hanno dimostrato di essere buoni modelli per studiare i metodi di consegna chirurgica e per dimostrare la sicurezza di fogli di tessuto impiantati (cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE)) e studiare l'uso di organoidi 41,44,45,47,48,49,50 . Il grande occhio animale ha dimensioni del globo simili a quelle umane e un'anatomia simile, compresa la presenza di una regione ad alta densità di fotorecettori, compresi i coni (l'area centrale), simile alla macula umana 6,51,52.

In questo manoscritto viene descritta una tecnica per l'impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di modelli animali felini di grandi dimensioni (sia gatti wild-type che CrxRdy / +), che, insieme a risultati di efficacia promettenti32,53, costruisce una base per l'ulteriore sviluppo di tale terapia sperimentale verso applicazioni cliniche per il trattamento di condizioni RD.

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Protocollo

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Le procedure sono state condotte in conformità con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Sono stati anche approvati dal Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. In questo studio sono stati utilizzati gatti wild-type e CrxRdy/+ di una colonia di gatti mantenuta presso la Michigan State University. Gli animali sono stati alloggiati sotto cicli luce-buio di 12 ore : 12 h e alimentati con una dieta commerciale completa per gatti.

1. Procedure preimpianto e assetto chirurgico

  1. Selezionare gatti wild-type o CrxRdy/+ a seconda del progetto di studio. Eseguire un esame oftalmico pre-chirurgico, compresa la biomicroscopia con lampada a fessura e l'oftalmoscopia indiretta. Escludere qualsiasi animale con anomalie del fondo oculare non correlate ai loro genotipi.
  2. Una settimana prima dell'impianto, iniziare gli animali con un protocollo immunosoppressivo di ciclosporina orale 2 mg / kg e prednisolone 1 mg / kg entrambi due volte al giorno per aiutare a prevenire il rigetto del trapianto.
  3. Digiunano gli animali oltre i 4 mesi di età durante la notte (almeno 8 ore). Fornire una quantità limitata di cibo umido durante la notte agli animali di età inferiore ai 4 mesi e quindi digiunarli per 2 ore prima dell'intervento.
  4. Eseguire un esame fisico generale, compresa l'auscultazione del torace (utilizzando uno stetoscopio). Registrare la frequenza cardiaca e respiratoria, la temperatura, il colore delle mucose e il tempo di ricarica capillare.
  5. Premedicare gli animali di età inferiore a 4 mesi con buprenorfina (0,02 mg/kg) e quelli di età superiore ai 4 mesi con buprenorfina (0,02 mg/kg) in combinazione con acepromazina (0,02 mg/kg) per via sottocutanea o intramuscolare 30-45 minuti prima dell'induzione in anestesia generale.
  6. Applicare una soluzione oftalmica topica di tropicamide all'1% e una soluzione oftalmica di fenilefrina al 10% sulla superficie oculare almeno due volte per dilatare le pupille. Ripeti se le pupille non sono ben dilatate.
  7. Posizionare un catetere endovenoso da 22 G nella vena cefalica in tutti gli animali: prima tagliare i capelli da un'area di 2 x 3 cm sopra la vena cefalica; preparare la pelle strofinandola prima con etanolo al 70% e poi con uno scrub alla clorexidina; Posizionare il catetere e fissarlo con nastro adesivo medico e lavare con soluzione salina eparinizzata. Negli animali sotto i 4 mesi, questo può essere fatto dopo l'induzione dell'anestesia.
  8. Indurre l'anestesia generale 30-45 minuti dopo la premedicazione: gli animali di età inferiore ai 4 mesi sono indotti con isoflurano somministrato mediante maschera, quelli di età superiore ai 4 mesi sono indotti utilizzando propofol per via endovenosa (4-6 mg / kg).
  9. Intubare con una dimensione appropriata del tubo endotracheale. Visualizza la laringe con una luce da esame o un laringoscopio. Spruzzare 0,1 mL di lidocaina al 2% sulla laringe, attendere alcuni secondi e quindi intubare.
  10. Mantenere l'anestesia con isoflurano (tra il 2% e il 3,5%) in ossigeno (300-600 ml/kg/min) tramite un sistema Bain.
  11. Posizionare l'animale in posizione dorsale sdraiata su un cuscino di posizionamento su cui è posizionata una coperta d'acqua riscaldata coperta da asciugamani. Collegare un monitor paziente e monitorare la frequenza cardiaca e l'elettrocardiogramma (ECG), la frequenza respiratoria, la pressione sanguigna, la saturazione di ossigeno e l'anidride carbonica end-tidal. Monitorare regolarmente la temperatura corporea durante la procedura. Una persona adeguatamente formata è responsabile del mantenimento e del monitoraggio dell'anestesia.
  12. Posizionare l'animale con l'aiuto del cuscino di posizionamento in modo tale che la superficie corneale sia orizzontale quando l'occhio viene ruotato in una posizione primaria dello sguardo. Fissare la testa in posizione utilizzando nastro medico.
  13. Coprire l'animale con coperte per aiutare a mantenere la temperatura corporea.
  14. Lavare il catetere endovenoso con soluzione salina eparinizzata e iniziare un'infusione endovenosa di lattato Ringer fornita a 2-5 ml / kg / h per tutta la durata della procedura.
  15. Preparare la superficie oculare, il sacco congiuntivale e le palpebre per la chirurgia asettica utilizzando lo 0,2% di iodio-povidone, applicatori sterili di batuffoli di cotone e batuffoli di cotone.
  16. Posizionare il microscopio operatorio con oculari anch'essi regolati in modo appropriato. Posizionare il controllo del piede per il microscopio (messa a fuoco, zoom e controllo dell'asse XY) e la macchina per vitrectomia in modo che il chirurgo possa azionarli.
  17. Prepararsi per la chirurgia asettica: tutto il personale deve indossare scrub chirurgici, un cappello chirurgico e una maschera. Assicurarsi che il chirurgo e l'assistente (i) scrub, camice e guanto come per la chirurgia asettica di routine. Tutto il personale dovrebbe avere familiarità con le tecniche asettiche.
  18. Una volta che il personale è stato lavato, vestito e guantato, aprire i pacchetti chirurgici e disporre gli strumenti. Posizionare manopole di manipolazione sterili sulle manopole di regolazione del microscopio per consentire al chirurgo o all'assistente di regolare senza rompere l'asepsi. Drappeggiare l'animale in modo di routine per la chirurgia oculare.
  19. Preparare la macchina per vitrectomia seguendo le istruzioni del produttore per una vitrectomia a due porte.
    1. Posizionare una lente a contatto vitrectomia e due porte 23 G vitrectomia sul tavolo dell'assistente. Attaccare il cauterizzazione del campo umido. Attaccare e adescare il tubo per infusione e il manipolo vitrectomia da 23 G.
    2. Posizionare gli strumenti di vitrectomia e le linee fluide sopra il drappo sterile e mantenerli in posizione utilizzando morsetti per asciugamani. Impostare la macchina per vitrectomia in modalità Vuoto proporzionale tra 1.500 e 2.500 tagli al minuto (cpm) e vuoto massimo di 500 mmHg. Questo viene eseguito premendo sui pulsanti freccia (verso l'alto o verso il basso) presenti sul pannello frontale della macchina per vitrectomia.

2. Preparazione degli organoidi per l'impianto sottoretinico (Figura 1)

  1. Ricavare organoidi retinici come descritto in precedenza31 e, se necessario, spedire durante la notte a 37 °C come precedentemente riportato54.
  2. Pulire le superfici nella sala di coltura tissutale nel laboratorio ricevente con un disinfettante e mantenere lo stesso alto livello di tecnica asettica di una suite chirurgica per interventi chirurgici oculari, per evitare contaminazioni batteriche o fungine, e portare nella sala chirurgica per evitare l'infezione del sito chirurgico.
  3. Indossare copriscarpe chirurgici, camici da laboratorio monouso, cuffie, maschere chirurgiche, maniche e scrub chirurgici all'interno della sala di coltura dei tessuti assegnata alla preparazione di organoidi per interventi chirurgici oculari.
  4. Mezzi neurali pre-equilibrati con 20 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) e 20 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) per 1 ora in un incubatore di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2). Collocare gli organoidi in mezzi in piastre a bassissima adesione utilizzando circa un quarto del volume del mezzo condizionato (dalla spedizione notturna) e tre quarti del volume del terreno fresco 31,54. Mantenere per 24-48 ore.
  5. Preparare ed equilibrare diverse piastre fresche da 60 mm con mezzo neurale (come preparato al punto 2.4) per almeno 1 ora nell'incubatore di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2) prima di anestetizzare il primo animale. Si noti che queste piastre vengono utilizzate per trasferire gli organoidi per ogni singolo intervento chirurgico, con l'ipotesi che le condizioni di pH e la saturazione di CO2 vengano mantenute nei mezzi per almeno 20 minuti, sufficienti per spostare la piastra nella sala chirurgica e caricare gli organoidi nella cannula.
  6. Utilizzare una piastra fresca da 60 mm con mezzi neurali presaturi per ogni caso di trapianto, mantenendo le piastre rimanenti nell'incubatore di coltura tissutale a 37 °C.
  7. Trasferire 6-9 organoidi in un piatto da 60 mm (con mezzo risaturo) pipettandoli con una pipetta manuale a canale singolo (20-200 μL) con punta filtrante sterile da 200 μL con un'ampia apertura (~ 0,7 mm). Questi suggerimenti possono essere preparati in anticipo o durante la procedura tagliando ~ 3-4 mm della punta con un paio di forbici sterili (fatte nel cappuccio di coltura del tessuto per evitare la contaminazione). Posizionare il piatto da 60 mm all'interno di un piatto di coltura tissutale da 100 mm (per evitare la contaminazione durante il trasporto da stanza a stanza) e trasportarlo rapidamente nella sala chirurgica.
  8. Posizionare la piastra con organoidi su un termoforo elettrico a 37 °C coperto da un drappeggio sterile.
  9. Cambiare in un nuovo paio di guanti sterili prima di preparare gli organoidi.
  10. Risciacquare gli organoidi in soluzione salina bilanciata sterile (BSS) (opzionale), quindi caricarli nell'iniettore, costituito da una cannula di vetro borosilicato a parete sottile (diametro esterno, OD 1,52 mm; diametro interno, ID 1,12 mm) con un'estremità smussata lucida fissata mediante tubo di plastica sterile a una siringa Hamilton sterile da 500 μL preriempita con BSS sterile.
  11. Passare la cannula al team chirurgico in modo sterile quando sono pronti per iniettare gli organoidi.
  12. Mantenere la durata dell'intera procedura (dalla rimozione degli organoidi dai terreni di coltura tissutale al caricamento della cannula) a 20 minuti o meno.
  13. Se c'è un ritardo nell'impianto degli organoidi, rimetterli nell'incubatore di coltura tissutale, per evitare cambiamenti nella saturazione di pH / CO2 all'interno del piatto.
  14. Conservare gli organoidi non utilizzati per 1 settimana nello stesso incubatore di coltura tissutale e monitorare eventuali prove di contaminazione.

3. Impianto di organoidi sottoretinici

  1. Eseguire una cantotomia laterale di 0,5-1 cm con forbici per tenotomia Stevens. Posizionare uno speculum palpebrale Barraquer di dimensioni appropriate per mantenere le palpebre aperte. Assicurarsi che l'assistente chirurgico irrighi regolarmente la cornea con BSS per tutta la durata della procedura.
  2. Posizionare 2 suture di sutura di seta 6-0 nella congiuntiva immediatamente adiacente al limbus a ore 4 e 8 per tenere l'occhio nello sguardo primario e ritrarre la terza palpebra. Utilizzare una pinza da legatura corneale Castroviejo 0,5 e una piccola emostatica di zanzara per afferrare delicatamente la congiuntiva bulbare vicino al limbus. Lasciare le suture lunghe e bloccare le estremità con piccoli emostatici di zanzara per aiutare con la loro manipolazione.
    NOTA: Posizionare la sutura sotto la terza palpebra è più difficile; Assicurati di posizionarlo immediatamente adiacente al limbus.
  3. Posizionare un'altra sutura a ore 12 in corrispondenza del limbus parzialmente attraverso lo spessore del limbus facendo attenzione a non penetrare nell'occhio. Annodare questa sutura in modo sciolto e tagliare le estremità corte. Ciò fornisce una robusta sutura di ancoraggio, che viene utilizzata durante l'intervento chirurgico come "maniglia" per ruotare l'occhio per consentire al chirurgo l'accesso a diverse parti del globo durante le diverse fasi della procedura.
    NOTA: i passaggi 3.2 e 3.3 possono essere invertiti. La sequenza di posizionamento delle suture di soggiorno è la preferenza del chirurgo.
  4. Riflettere la congiuntiva bulbare tra le 10 e le 2 (una perimetria). Usando le forbici per tenotomia, incidere la congiuntiva a 2-3 mm dal limbus. Minarlo e liberare la capsula del tenone per esporre la sclera nei siti per le porte di vitrectomia a ore 2 e 10, che saranno posizionate a circa 3-5 mm dal limbus a seconda dell'età dell'animale. Utilizzare lance chirurgiche di cellulosa per l'emostasi e per eliminare il sangue.
  5. Identificare i siti per la sclerotomia seguendo la riflessione della congiuntiva e della capsula del tenone usando i calibri. Scegli i siti di sclerotomia (a ore 2 e 10 con l'obiettivo di passare attraverso la pars plana), per evitare i principali vasi sclerali che possono essere prominenti nel gatto. Utilizzare la cauterizzazione in campo umido sulla sclera nei siti di sclerotomia pianificati per ridurre il sanguinamento sclerale, pianificando una regione di ~ 3 mm alla porta dello strumento (porta a ore 10 per un chirurgo destrorso) poiché questa verrà ampliata dopo la vitrectomia per consentire l'introduzione della cannula di impianto.
  6. Pre-posizionare suture a modello crociato (sutura poliglactina 6-0 o 7-0) senza legare il nodo nel sito delle sclerotomie proposte prima che vengano posizionate le porte di vitrectomia.
    NOTA: Ciò facilita la rapida chiusura delle sclerotomie alla fine della procedura. La sutura per la porta dello strumento pianificata deve avere un morso più lungo di sclera in quanto si tratterà di una lunga incisione.
  7. Una volta posizionate le suture, chiedi all'assistente di aiutare a posizionare il globo tenendo le suture a ore 12 legando o usando una pinza Bishop-Harmon. Lascia che il chirurgo stabilizzi anche il globo, usando una pinza Castroviejo da 0,12 mm per tenere il tessuto vicino al sito di sclerotomia.
    1. Introdurre una porta per vitrectomia da 23 G utilizzando un trocar attraverso la sclera sia a ore 2 che a ore 10 diretta ad angolo verso il nervo ottico per evitare il contatto con la lente.
    2. Controllare che la porta di irrigazione sia nel vitreo spingendo delicatamente sulla porta usando una pinza di legatura in modo che la punta possa essere visualizzata nel vitreo. Una volta confermato il corretto posizionamento, attaccare la linea di irrigazione alla porta e posizionare la linea utilizzando sottili bende adesive per fissarla in posizione. Impostare l'infusione vitrectomia del tampone BSS inizialmente a 30-35 mmHg premendo i pulsanti freccia (verso l'alto o verso il basso) presenti sul pannello frontale della macchina per vitrectomia.
  8. Lasciare che l'assistente tenga una lente vitrectomia di ingrandimento Machemer sulla cornea per consentire la visualizzazione del segmento posteriore dell'occhio durante le fasi successive. Attaccare la lente vitrectomia irrigante a un set di gocciolamento che fornisce un apporto costante di fluido per accoppiare la lente alla cornea.
    NOTA: potrebbero essere utilizzate anche altre forme di lenti vitrectomiche a contatto. Attenuare o spegnere le luci della stanza per facilitare la visualizzazione attraverso il microscopio operatorio.
  9. Inserire la sonda/cutter per vitrectomia da 23 G (2.500 cpm) attraverso la porta dello strumento (adiacente alla mano dominante del chirurgo, cioè la porta a ore 10 per un chirurgo destrorso) ed eseguire una vitrectomia parziale a core.
    1. Quindi, rimuovere completamente il vitreo dalla superficie retinica nella regione che riceverà il trapianto (questo è importante per il successo della procedura) staccando la faccia vitreale dalla retina.
    2. Posizionare la sonda vitrectomia sulla testa del nervo ottico con la porta rivolta verso la superficie retinica e applicare un vuoto più elevato per avviare il distacco del viso vitreale.
  10. Preparare i cristalli di triamcinolone per uso intraoculare. Se la sospensione di triamcinolone non è specificamente per uso intravitreale, lavare i cristalli e quindi risospendere in BSS.
    1. Inizialmente, filtrare la sospensione con l'aiuto di una siringa sterile a pori da 0,22 μm con membrana PES (attaccata a una siringa da 1 ml) per intrappolare i cristalli.
    2. Quindi lavare i cristalli di triamcinolone intrappolati aspirando BSS nella siringa da 1 ml e sciacquando attraverso il filtro (i cristalli rimangono intrappolati nel filtro). Questo rimuove i conservanti nella soluzione. Ripetere il lavaggio 3 volte dopo di che i cristalli vengono risospesi in 1 mL BSS.
  11. Introdurre l'ago della siringa che tiene il triamcinolone attraverso la porta dello strumento. Fare attenzione a non toccare la lente osservando la punta dell'ago attraverso la pupilla mentre si introduce l'ago attraverso la porta dello strumento. Iniettare da 0,25 a 0,5 mL di sospensione di cristallo. Quindi inserire la sonda vitrectomia attraverso la porta dello strumento e farla avanzare vicino alla testa del nervo ottico con la porta lontana dalla superficie retinica e utilizzare l'alto vuoto per aiutare a staccare la faccia vitreale dalla retina.
    NOTA: I cristalli di triamcinolone si attaccano e quindi evidenziano il vitreo rimanente. Rimuovere con cura qualsiasi vitreo sopra e accanto al sito di impianto organoide pianificato (ad esempio, il fondo tapetale centrale vicino alla regione dell'area centrale ).
  12. Creare un piccolo bleb focale di distacco di retina nel sito di impianto desiderato utilizzando un iniettore sottoretinico, ad esempio un iniettore sottoretinico da 23 G con una cannula estensibile da 41 G attaccata a una siringa Luer lock sterile da 250 μL riempita con BSS sterile.
    1. Prima di creare il bleb sottoretinico, ridurre la pressione di infusione a 10 mmHg per facilitare la formazione di bleb.
    2. Inserire l'iniettore attraverso la porta dello strumento e farlo avanzare verso la superficie retinica. Estrudere la punta della cannula e premerla delicatamente sulla superficie retinica. Chiedere all'assistente di esercitare una leggera spinta rapida sullo stantuffo della siringa per avviare il distacco di retina che riduce la pressione di iniezione per consentire un lento aumento del distacco di retina fino al raggiungimento della dimensione desiderata (vengono utilizzati circa 100-200 μL di BSS).
  13. Se la retinotomia creata si trova in una posizione adeguata, che evita di tagliare la retina tra il sito di impianto e la testa del nervo ottico per impedire il sezionamento dello strato di fibre nervose derivato dal sito di impianto e per evitare i principali vasi sanguigni retinici (questo è determinato anche dal disegno dello studio, nel nostro caso è stata scelta la retina centrale), quindi, ingrandirlo leggermente utilizzando la cannula da 41 G dell'iniettore, con l'obiettivo di facilitare l'introduzione delle forbici retiniche.
  14. Rimuovere l'iniettore dall'occhio e rimuovere la porta scleral a ore 10. Ingrandire la sclerotomia in questo sito usando un coltello a fessura dritto da 2,85 mm / cheratomo orientato verso il nervo ottico per evitare di toccare la lente. Mantenere la pressione di infusione a 10-15 mmHg.
  15. Estendere la retinotomia utilizzando forbici verticali vitreoretiniche a 80° con impugnatura a spremuta, evitando di tagliare i vasi retinici per prevenire l'emorragia retinica e assicurarsi di tagliare la retina sul bordo del bleb lontano dalla testa del nervo ottico per evitare di tagliare le fibre nervose che portano dalla retina nell'area del trapianto al nervo ottico. La retinotomia dovrebbe essere di larghezza sufficiente per ricevere gli organoidi.
  16. Inserire il capillare di vetro precaricato contenente gli organoidi (vedere punto 2.10) attraverso la sclerotomia allargata e farlo avanzare verso il sito di retinotomia sotto visualizzazione diretta.
    1. Utilizzare la punta del capillare di vetro per aprire leggermente la retinotomia per accedere all'apertura nel bleb sottoretinico.
    2. Chiedere all'assistente di premere lentamente lo stantuffo dell'iniettore, mentre si guarda attraverso il microscopio, iniettando gli organoidi nel bleb sottoretinico. La BSS dovrebbe precedere gli organoidi e lavare la retinotomia aperta.
    3. Spingere delicatamente gli organoidi all'interno del bleb con la punta del capillare di vetro se si trovano sul bordo della retinotomia.
  17. Tenere il capillare di vetro alla retinotomia per alcuni secondi per cercare di chiudere la retinotomia e impedire agli organoidi di fuoriuscire nel vitreo.
  18. Rimuovere molto lentamente il capillare di vetro dall'occhio evitando qualsiasi rilascio improvviso di liquido dall'occhio per evitare movimenti fluidi all'interno dell'occhio che potrebbero espellere gli organoidi dal bleb sottoretinico.
  19. Aumentare lentamente la pressione di infusione a 20-30 mmHg per aiutare a prevenire l'emorragia intraoculare avendo cura che il liquido di infusione non si lavi direttamente sul bleb. Questo viene eseguito premendo i pulsanti freccia verso l'alto presenti sul pannello frontale della macchina per vitrectomia.
  20. Chiudere la sclerotomia usando la sutura pre-posizionata in uno schema crociato (6-0 o 7-0 poliglactina). Aggiungere ulteriori semplici punti di sutura interrotti secondo necessità per sigillare la sclerotomia.
  21. Chiedere all'assistente di rimuovere la porta di infusione e lasciare che il chirurgo leghi rapidamente la sutura pre-posizionata per sigillare la sclerotomia e prevenire la perdita di pressione intraoculare.
  22. Chiudere l'incisione congiuntivale (peritomia) usando la poliglactina 6-0 o 7-0 in un semplice schema continuo.
  23. Immagine del fondo oculare (ad esempio, utilizzando una videocamera RetCam II, Clarity o simili) e registrare la posizione immediata degli organoidi all'interno dello spazio sottoretinico.
  24. Ri-preparare la superficie oculare dopo l'imaging utilizzando una soluzione di iodio povidone allo 0,2% con l'aiuto di applicatori di punta di cotone e batuffoli di cotone. Rimuovere le tre suture di soggiorno e lo speculum del coperchio.
  25. Chiudere la cantotomia laterale con sutura poliglactina 6-0. Posizionare una singola sutura sepolta seguita da una figura di 8 suture cutanee per riformare il canto laterale e quindi utilizzare semplici suture cutanee interrotte per chiudere il resto della ferita.
  26. Al termine della procedura chirurgica, somministrare un'iniezione subcongiuntivale di una combinazione di steroidi e antibiotici (2 mg di metilprednisolone acetato, 0,1 mg di desametasone e 1 mg di gentamicina). Posizionare un lubrificante oftalmico (lacrime artificiali) sulla cornea.
  27. Recuperare l'animale dall'anestesia e monitorare attentamente durante il recupero eventuali segni di dolore che richiederebbero un trattamento aggiuntivo, come blefarospasmo marcato, grave riluttanza a essere manipolato, letargia o diminuzione dell'appetito e aumento della frequenza respiratoria e cardiaca. Fornire l'analgesia post-operatoria secondo necessità e monitorare attentamente eventuali disagi.
    NOTA: Solo il personale adeguatamente addestrato dovrebbe essere incaricato di anestetizzare e monitorare i pazienti felini prima, durante e dopo l'intervento chirurgico. Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per le cure post-operatorie.

4. Procedure post-impianto, trattamento post-operatorio e valutazione

  1. Continuare a trattare con farmaci immunosoppressori orali (1 mg/kg di prednisolone e 2 mg/kg di ciclosporina per via orale due volte al giorno) per aiutare a controllare l'infiammazione e il rigetto degli organoidi. Fornire una copertura antibiotica sistemica (ad es. doxiciclina orale 5 mg/kg due volte al giorno – questo antibiotico è stato scelto a causa del rischio di infezione da micoplasma opportunista in animali immunodepressi).
  2. Eseguire regolari esami oftalmici per monitorare l'infiammazione o lo sviluppo di eventi avversi. Monitorare il bleb retinico per l'appiattimento, che si verifica nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico nonostante la grande retinotomia necessaria per l'iniezione di organoidi nello spazio sottoretinico. Registrare le immagini del fondo oculare ad ogni esame per registrare la posizione e l'aspetto degli organoidi trapiantati.
  3. Visualizzare gli animali in anestesia generale mediante oftalmoscopia laser a scansione confocale (cSLO) e dominio spettrale – tomografia a coerenza ottica (SD-OCT)5,31 durante il periodo di monitoraggio e prima della conclusione dell'esperimento.
  4. Eutanasia umana degli animali alla fine dell'esperimento utilizzando un metodo approvato dall'AVMA, ad esempio la somministrazione endovenosa di 85 mg/kg di pentobarbital. Dopo la sedazione, posizionare un catetere endovenoso per la somministrazione del pentobarbital per ridurre al minimo lo stress. Confermare la morte per cessazione del battito cardiaco e fare un'incisione nel torace per creare un pneumotorace.
  5. Rimuovere gli occhi con un approccio transcongiuntivale standard e fissare come richiesto. Per l'immunoistochimica (IHC), immergere immediatamente gli occhi in una soluzione di paraformaldeide al 4% dopo che 0,3 ml della soluzione fissativa sono stati iniettati nel segmento posteriore attraverso 3 fessure fatte attraverso pars plana con una lama Parker 11 (~ 3-4 mm dal limbus).
  6. Sezionare le conchiglie oculari dopo 3,5 ore di fissazione a 4 °C. Rimuovere il vitreo residuo avendo cura di preservare intatta la retina e gli organoidi. Rimettere in fissativo per altri 30 minuti a 4 °C, quindi sciacquare le conchiglie oculari 3 volte ciascuna per 10 minuti in PBS. Trasferire il bulbo oculare al 15% di saccarosio per 2 ore, quindi al 30% di saccarosio per altre 2 ore.
  7. Risciacquare il bulbo oculare due volte con PBS e incorporarlo nel mezzo OCT (composto con temperatura di taglio ottimale) e congelare flash, quindi conservare a -80 °C fino al sezionamento per istologia e immunochimica.
  8. Selezionare gli anticorpi per IHC in base al protocollo e agli obiettivi dello studio.

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Risultati

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Questa procedura consente l'impianto riuscito e riproducibile di organoidi retinici derivati da hPSC nello spazio sottoretinico di un modello animale di grandi dimensioni (dimostrato qui utilizzando 2 esempi: gatti wild-type con fotorecettori sani (PR) e gatti CrxRdy / + con PR e retina degenerativi). Utilizzando i passaggi indicati nella Figura 1 , preparare e caricare gli organoidi retinici derivati da hPSC nella cannula di vetro borosilicato del dispositivo di...

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Discussione

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L'impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi retinici) nello spazio sottoretinico è un approccio sperimentale promettente per ripristinare la vista per le malattie degenerative retiniche in stadio avanzato causate dalla morte delle cellule PR (cecità profonda o terminale). L'approccio presentato si basa su una terapia sperimentale precedentemente sviluppata e testata con successo basata sull'innesto sottoretinico di un pezzo di tessuto retinico fetale umano23,24,25

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Dichiarazioni

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Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. sono dipendenti di Lineage Cell Therapeutics, Inc. Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NEI Fast-track SBIR R44-EY027654-01A1 e dalla sovvenzione SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones è un co-PI). Gli autori desiderano ringraziare la signora Janice Querubin (MSU RATTS) per il suo aiuto con l'anestesia e la cura generale per gli animali inclusi in questo studio, nonché l'aiuto con l'impostazione chirurgica e la preparazione / sterilizzazione degli strumenti. Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Paige Winkler per l'aiuto nel ricevere gli organoidi e metterli nei media il giorno prima dell'impianto e per l'aiuto il giorno dell'impianto. Gli autori sono anche grati al signor Randy Garchar (LCTX) per la spedizione diligente di organoidi retinici, assemblando lo spedizioniere e scaricando i record di temperatura e stress G dopo ogni spedizione. Questo lavoro è stato eseguito mentre l'autore Igor Nasonkin era impiegato da Biotime (ora Lineage).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m pore siringa filtro con membrana PESCameoNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
iniettore sottoretinico 23G con cannula estensibile da 41 GDORC1270.EXT
250 & micro; L hamilton siringa luer lock a tenuta di gasHamiltonNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
6-0 Sutura di setaEthicon707G
6-0/7-0 sutura poliglactinaEthiconJ570G
Acepromazina maleato 500mg/5mL (Aceproject)Henry Schein Animal HealthNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Buprenorfina 0,3 mg/mLPar FarmaceuticoNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
cSLO + SD-OCTHeidelberg EngineeringSpectralis HRA+ OCT
CiclosporinaNovartisNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Desametasone 2mg/mL (Azium)VetoneNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Doxiclina 25mg/5mLCiplaNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Soluzione Fatal Plus (soluzione di pentobarbital)VortechNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Gentamicina 20mg/2mLHospiraNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Capillare in vetro (Borosilicato standard a canna singola a parete sottile (Schott Duran) Tubi in vetroWorld Precision InstrumentsTW150-4
Metilprednisolone attetato 40 mg/mLPfizerNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
MicroscopioZeissNA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)Sakura4583
Olympic Vac-Pac Size 23NatusNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Soluzione di paraformaldeide al 16%EMS15719
Fenilefrina cloridrato 10% Soluzione oftalmicaAkornNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Prednisolone 15mg/5mLAkornNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)ZoetisNApuò essere trovato tramite vari fornitori
RetCam II video fundus cameraClarity Medical SystemsNApuò essere trovato tramite vari fornitori
Triamcinolone 400mg/10mL (Kenalog-40)Bristol -Myers Squibb CompanyNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Tropicamide 1% soluzione oftalmicaAkornNApuò essere trovato attraverso vari fornitori
Vitrectomia 23G portaAlconAccurus sistemi
Macchina per vitrectomiaSistemi AlconAccurus
Forbici vitreo-retiniche verticali a 80 gradi con manico a pressioneFrimenFT170206T

Riferimenti

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