Articolo metodologico

Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

DOI:

10.3791/61687

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5 novembre 2020

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1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il succo pancreatico è una preziosa fonte di biomarcatori per il cancro del pancreas umano. Descriviamo qui un metodo per la procedura di raccolta intraoperatoria. Per superare la sfida di adottare questa procedura in modelli murini, suggeriamo un campione alternativo, il liquido interstiziale tumorale, e descriviamo qui due protocolli per il suo isolamento.

Abstract

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L'adenocarcinoma pancreatico (PDAC) è la quarta causa di morte correlata al cancro e presto diventerà la seconda. Vi è un urgente bisogno di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche per aiutare la diagnosi differenziale preoperatoria e la profilazione del paziente. Il succo pancreatico è un fluido corporeo relativamente inesplorato che, a causa della sua vicinanza al sito tumorale, riflette i cambiamenti nel tessuto circostante. Qui descriviamo in dettaglio la procedura di raccolta intraoperatoria. Sfortunatamente, tradurre la raccolta di succo pancreatico in modelli murini di PDAC, per eseguire studi meccanicistici, è tecnicamente molto impegnativo. Il liquido interstiziale tumorale (TIF) è il fluido extracellulare, al di fuori del sangue e del plasma, che bagna le cellule tumorali e stromali. Analogamente al succo pancreatico, per la sua proprietà di raccogliere e concentrare le molecole che si trovano diluite nel plasma, la TIF può essere sfruttata come indicatore di alterazioni microambientali e come preziosa fonte di biomarcatori associati alla malattia. Poiché la TIF non è facilmente accessibile, sono state proposte varie tecniche per il suo isolamento. Descriviamo qui due metodi semplici e tecnicamente poco impegnativi per il suo isolamento: la centrifugazione tissutale e l'eluizione tissutale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tumori più aggressivi e presto diventerà la seconda causa di morte 1,2,3. È noto per il suo microambiente immunosoppressivo e per la sua scarsa risposta ai protocolli di immunoterapia4. Attualmente, la resezione chirurgica è ancora l'unica opzione curativa per il PDAC, ma c'è un'alta frequenza di recidive precoci e complicanze postchirurgiche. La mancanza di sintomi specifici fino a uno stadio avanzato non consente una diagnosi precoce, contribuendo alla scadenza della malattia. Inoltre, la sovrapposizione dei sintomi tra PDAC e altre patologie pancreatiche benigne può ostacolare il raggiungimento di una diagnosi tempestiva e affidabile con le attuali strategie diagnostiche. L'identificazione di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche potrebbe facilitare il processo decisionale chirurgico e migliorare la profilazione del paziente.

Risultati promettenti nella scoperta di biomarcatori sono stati raggiunti utilizzando fluidi corporei facilmente accessibili, come sangue 5,6,7, urina8, saliva 9 e succo pancreatico10,11,12. Molti studi hanno sfruttato approcci "omici" completi, come tecniche genomiche, proteomiche e metabolomiche, per identificare molecole candidate o firme che potrebbero discriminare tra PDAC e altre afflizioni pancreatiche benigne. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico, un fluido corporeo relativamente inesplorato, può essere utilizzato per identificare le firme metaboliche di pazienti con profili clinici distinti12. Il succo pancreatico è un fluido ricco di proteine, che accumula il secretoma delle cellule duttali pancreatiche e scorre verso il dotto pancreatico principale e quindi verso il principale dotto biliare comune. A causa della sua vicinanza al pancreas, potrebbe essere fortemente influenzato dalle perturbazioni microambientali indotte dalla massa tumorale (Figura 1), e quindi più informativo del sangue o delle urine o della profilazione basata sui tessuti. Diversi studi hanno esplorato il potenziale del succo pancreatico per identificare nuovi biomarcatori di malattia utilizzando vari approcci, tra cui l'analisi citologica 13, l'analisi proteomica eseguita mediante spettrometria di massa 14,15, la valutazione di marcatori genetici ed epigenetici come K-ras e mutazioni p53 16,17, alterazioni nella metilazione del DNA 18 e miRNA 19 . Tecnicamente, il succo pancreatico può essere raccolto intraoperatoriamente o con procedure minimamente invasive, come l'ecografia endoscopica, la colangio-pancreatografia retrograda o mediante raccolta endoscopica della secrezione di succo duodenale20. Non è ancora chiaro in che misura la composizione del succo pancreatico sia influenzata dalla tecnica di raccolta utilizzata. Descriviamo qui la procedura di raccolta intraoperatoria e mostriamo che il succo pancreatico può rappresentare una fonte preziosa per i biomarcatori PDAC.

figure-introduction-1
Figura 1: Rappresentazione schematica della raccolta del succo pancreatico. (A) Rappresentazione schematica raffigurante la secrezione di succo pancreatico nel dotto pancreatico e la sua raccolta durante l'intervento chirurgico. L'inserto mostra un primo piano del microambiente tumorale: il succo pancreatico raccoglie le molecole rilasciate dalle cellule tumorali e stromali nei dotti pancreatici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La raccolta di succo pancreatico in modelli murini genetici e ortotopici di PDAC sarebbe apprezzata nella prospettiva di sfruttare questo biofluido in studi meccanicistici preclinici; Tuttavia, questa procedura può essere tecnicamente molto impegnativa e non è fattibile per modelli più semplici come i tumori sottocutanei. Per questo motivo, abbiamo identificato il liquido interstiziale tumorale (TIF) come fonte alternativa al succo pancreatico, per la sua caratteristica simile di agire come indicatore delle perturbazioni circostanti. Il liquido interstiziale (IF) è il liquido extracellulare, che si trova al di fuori del sangue e dei vasi linfatici, che bagna le cellule dei tessuti21. La composizione di IF è influenzata sia dalla circolazione sanguigna all'organo che dalla secrezione locale; infatti, le cellule circostanti producono e secernono attivamente proteine nell'IF21. L'interstizio riflette i cambiamenti microambientali dei tessuti circostanti e potrebbe quindi rappresentare una preziosa fonte per la scoperta di biomarcatori in diversi contesti patologici, come i tumori. L'alta concentrazione di proteine localmente secrete in TIF può essere utilizzata per identificare molecole candidate da testare come biomarcatori prognostici o diagnostici nel plasma22,23,24. Diversi studi hanno dimostrato che TIF è un campione adatto per approcci proteomici ad alto rendimento, come le tecniche di spettrometria di massa 23,24,25, così come gli approcci ELISA multiplex 26 e il profilo dei microRNA 27.

Sono stati proposti diversi approcci per l'isolamento dell'IF nei tumori, che possono essere ampiamente classificati come metodi in vivo (ultrafiltrazione capillare 28,29,30,31 e microdialisi 32,33,34,35) ed ex vivo (centrifugazione tissutale 22,36,37,38 e eluizione tissutale 39,40,41,42). Queste tecniche sono state esaminate in dettaglio 43,44. La scelta del metodo appropriato dovrebbe tenere conto di aspetti quali le analisi e le applicazioni a valle e il volume recuperato. Recentemente abbiamo usato questo approccio come prova di principio per dimostrare la diversa attività metabolica dei tumori da due linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico murino12. Sulla base della letteratura24,38, abbiamo scelto di utilizzare il metodo di centrifugazione a bassa velocità per evitare la rottura e la diluizione delle cellule dal contenuto intracellulare. Sia la quantità di glucosio che di lattato in TIF riflettevano le diverse caratteristiche glicolitiche delle due diverse linee cellulari. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per i due metodi più comunemente usati per l'isolamento della TIF: centrifugazione tissutale ed eluizione tissutale (Figura 2).

figure-introduction-2
Figura 2: Rappresentazione schematica dei metodi di isolamento del liquido interstiziale tumorale. Illustrazione schematica delle tecniche descritte in dettaglio nel protocollo, vale a dire centrifugazione tissutale (A) ed eluizione tissutale (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocollo

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Per tutti i pazienti arruolati, il sangue periferico e il succo pancreatico sono stati raccolti al momento dell'intervento secondo protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Istituzione. Tutti i pazienti sono stati arruolati nello studio dopo aver firmato il consenso informato, compresa la raccolta di campioni biologici e dati clinici. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituzione (numero di protocollo ICH-595, approvazione rilasciata nel maggio 2009). Le procedure che coinvolgono i topi e la loro cura sono state conformi alle linee guida dell'UE e istituzionali (protocollo ID 121/2016-PR).

1. Isolamento del succo pancreatico

NOTA: Il prelievo del succo pancreatico viene eseguito nel contesto di una procedura aperta di resezione pancreatica (ad esempio, duodenectomia pancreatica, pancreatectomia totale, pancreatectomia distale) da un'equipe di chirurghi pancreatici esperti.

  1. Selezione del paziente
    1. Considerare per la procedura qualsiasi paziente programmato per una resezione pancreatica aperta.
    2. Confermare l'inclusione se la dimensione del dotto pancreatico principale è ritenuta sufficiente per consentire il recupero del succo pancreatico. Il limite minimo di diametro del dotto pancreatico principale è considerato 2 mm all'imaging TC con mezzo di contrasto.
  2. Studio pre-operatorio del dotto pancreatico all'imaging TC con mezzo di contrasto per aiutare la pianificazione del recupero del succo pancreatico
    1. Localizzare tridimensionalmente il dotto pancreatico principale all'interno della ghiandola a livello del collo pancreatico: misurare la distanza del dotto pancreatico principale dal margine pancreatico anteriore, superiore e inferiore su vetrini di sezione trasversale e rendering coronali e sagittali. Una volta in sala operatoria, utilizzare queste misurazioni per approssimare il punto corretto in cui perforare il pancreas per inannulare il dotto di Wirsung e recuperare il succo pancreatico.
  3. Preparazione del materiale
    1. Materiale sterile: aprire l'involucro sterile di un ago da 25 G e di una siringa da 3 ml e posizionarli nel campo sterile con la collaborazione dell'infermiera.
    2. Materiale non sterile: tenere a portata di mano una provetta sottovuoto K2EDTA da 3 mL in sala operatoria per lo stoccaggio del fluido.
  4. Preparazione del paziente
    1. Posizionare il paziente sul letto della sala operatoria. Indurre l'anestesia generale mista, utilizzando Remifentanil, Sevorane e Rocuronium, quindi intubare e iniziare a ventilare il paziente. Posizionare il paziente in decubito supino con il braccio destro infilato nel corpo e il braccio sinistro rapito a 90° gradi fissato su una credenza.
    2. Disinfettare la pelle dell'addome nel sito dell'incisione. Creare e mantenere un campo sterile sull'addome drappeggiando il paziente.
  5. Procedura chirurgica
    1. Eseguire un'incisione subcostale e accedere alla cavità addominale. Posizionare una retrazione addominale Rochard per l'esposizione degli organi.
    2. Esporre e mobilizzare il pancreas attraverso la manovra di Kocher, l'apertura del legamento gastrocolico, l'incisione del tessuto retroperitoneale lungo il bordo superiore e inferiore del pancreas creando un piano di dissezione tra il collo pancreatico e la vena mesenterica superiore situata posteriormente.
    3. Una volta che il pancreas è mobilizzato ed esposto, procedere al prelievo del succo pancreatico prima del sezionamento del collo pancreatico.
  6. Identificazione e localizzazione del dotto pancreatico
    1. Stimare la posizione del dotto pancreatico utilizzando la misurazione effettuata durante l'imaging e quindi palpare la superficie anteriore del pancreas per identificare la sua posizione precisa.
  7. Raccolta di succo pancreatico
    1. Tenere la testa pancreatica e il duodeno da sotto ed elevarlo con la mano sinistra, segnando la posizione del dotto pancreatico con il primo dito.
    2. Afferri con la mano destra della siringa da 3 mL con l'ago da 25 G montato.
    3. Utilizzare la mano destra per inserire l'ago nel pancreas appena distale al pollice sinistro. Decidere la profondità di penetrazione e il grado di inclinazione dell'ago in base alle misurazioni preoperatorie e alla percezione di aver penetrato la parete del condotto.
    4. Prelevare il succo con la siringa. Se non è possibile recuperare il succo, spostare l'ago nelle quattro direzioni cercando di cannulare il dotto pancreatico.
    5. Una volta recuperato il succo pancreatico, spostarlo al di fuori del campo sterile e trasferirlo nella provetta per vuoto K2EDTA da 3 ml. Conservare a 4 °C fino a quando il campione non viene trasferito in laboratorio e procedere all'ulteriore elaborazione il prima possibile.
      NOTA: Il volume di succo pancreatico che può essere recuperato con questa procedura varia notevolmente, variando approssimativamente da 0,2 ml a 3 ml nella nostra esperienza. La quantità di succo recuperato dipende fortemente dal paziente: la dimensione del dotto di Wirsung e lo stato funzionale del pancreas (funzionamento rispetto alla ghiandola atrofica). Nella nostra esperienza non esiste alcun espediente che possa essere utilizzato per aumentare la quantità di succo pancreatico recuperato.

2. Lavorazione del succo pancreatico

  1. Centrifugare il succo pancreatico a 400 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule o detriti.
    NOTA: Il succo pancreatico deve essere di colore chiaro e trasparente prima della centrifugazione. La contaminazione del sangue durante l'intervento chirurgico può talvolta verificarsi, rendendo il campione più oscuro e di colore più rosso. Considerare l'esclusione di tali campioni da ulteriori analisi.
  2. Recuperare il surnatante, l'aliquota e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.

3. Induzione di tumori sottocutanei

NOTA: Le linee cellulari murine Panc02 e DT6606 sono state ottenute rispettivamente dal Prof. Lorenzo Piemonti (Istituto per il diabete San Raffaele, Milano, Italia) e dal Prof. Francesco Novelli (Centro per la Ricerca Sperimentale e gli Studi Medici, Torino, Italia), come precedentemente descritto12.

  1. Crescita delle cellule tumorali
    1. Coltura di cellule Panc02 e DT6606 in terreno di coltura Panc02 e DT6606 in terreno di coltura Memorial Institute (RPMI) 1640 contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2mM di L-glutammina e l'1% di antibiotico penicillina-streptomicina.
    2. Scongelare le cellule congelate 1-2 settimane prima dell'iniezione del tumore, in base al tasso di crescita della linea cellulare.
    3. Coltiva cellule a 37 °C con il 5% di CO2 e il 95% di umidità in condizioni sterili.
    4. Staccare le cellule con una soluzione di tripsina/EDTA allo 0,025% per 5 minuti a 37 °C quando raggiungono l'80% di confluenza ed eliminare la tripsina mediante centrifugazione.
      NOTA: DT6606 sono cellule primarie, non immortalate, derivate dal topo LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, e non devono essere fatte passare più di 3 volte prima dell'iniezione in vivo per mantenere le loro caratteristiche originali. Si raccomanda di scongelare le cellule DT6606 7-10 giorni prima dell'iniezione.
  2. Iniezione di cellule tumorali in vivo
    1. Tripsinizzare le cellule (vedere punto 3.1.4) e lavarle una volta con soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Eliminare il PBS mediante centrifugazione e risospendere le cellule nel PBS fresco prima del conteggio.
    2. Contare le cellule e risospenderle in PBS ad una concentrazione di 0,5-1 x 107 cellule/ml in modo da avere una concentrazione finale di 0,5-1 x 106 cellule/100 μL da iniettare in ciascun topo. Preparare le cellule in eccesso. Mantenere le cellule a 4 °C o sul ghiaccio fino alla fine della procedura.
    3. Raggruppare gli animali (topi femmina C57BL/6J di 8 settimane) in gabbie diverse in base a diverse linee cellulari o trattamenti.
    4. Trattenere gli animali manualmente e anestetizzarli usando una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o secondo procedure approvate localmente.
    5. Rasare il sito di iniezione, di solito un fianco sopra una gamba, con un rasoio elettrico e pulire accuratamente il sito di iniezione con alcool.
    6. Pipettare su e giù per la sospensione cellulare con una siringa da 1 ml, rimuovendo eventuali bolle d'aria spostando il pistone su e giù. Collegare un ago da 25 G alla siringa e spingere il pistone verso l'alto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge l'apertura dell'ago.
    7. Pizzicare la pelle del fianco con una pinza a punta piatta e inserire con attenzione l'ago alla base della piega cutanea tra le pinze senza perforare la cavità peritoneale o la muscolatura. Per verificare la corretta posizione dell'ago, provare delicatamente a spostare la punta dell'ago lateralmente sotto la pelle. L'ago dovrebbe muoversi liberamente.
    8. Iniettare lentamente 100 μL di sospensione cellulare (contenente 0,5-1 x 106 cellule), serrare delicatamente il sito di iniezione per alcuni secondi e ritirare lentamente l'ago senza alcun movimento laterale.
    9. Riportare il mouse nella sua gabbia e monitorare il recupero dall'anestesia.
    10. Controllare la crescita del tumore usando una pinza per 3-4 settimane. Eutanasia gli animali quando i tumori raggiungono circa 0,5-1 cm3 usando CO2 o secondo procedure approvate localmente.

4. Isolamento del liquido interstiziale tumorale (TIF)

  1. Asportazione di tumori sottocutanei
    1. Bloccare gli arti degli animali con nastro di carta e pulire la pelle con alcool. Tagliare la pelle aperta sull'addome per separarla dal peritoneo e proseguire fino agli arti. Eliminare il tumore cresciuto sotto la pelle del fianco con l'aiuto di forbici, morsetti e infine un bisturi.
    2. Pesare il tumore e tenerlo in un tubo pulito sul ghiaccio fino a dopo l'isolamento del TIF.
  2. Isolamento della TIF mediante centrifugazione
    1. Tagliare il tumore a metà, sciacquare rapidamente le due parti in PBS e asciugarle delicatamente su carta da filtro per rimuovere l'eccesso di PBS. Eseguire questi passaggi il più velocemente possibile per evitare l'evaporazione dal tumore.
    2. Trasferire immediatamente il tumore in un filtro di cellule di nylon da 20 μm fissato in cima a un tubo conico da 50 ml.
    3. Centrifugare il tubo a 400 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Questa centrifugazione a bassa velocità preserva l'integrità cellulare evitando la contaminazione della TIF da parte del compartimento intracellulare. La perdita di contenuto intracellulare può essere testata nelle applicazioni a valle, ad esempio valutando la presenza di proteine intracellulari di housekeeping, come le proteine ribosomiali25.
    4. Recuperare la TIF dal fondo del tubo, eventualmente aliquotarla e congelarla immediatamente su ghiaccio secco e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.
      Facoltativo: In base all'analisi proteomica a valle da eseguire, diluire il campione in PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione di molecole specifiche.
      NOTA: A seconda della composizione del tumore, in alcuni casi tumori molto piccoli non producono alcun fluido.
  3. Isolamento della TIF mediante eluizione
    1. Tagliare il tumore in piccoli pezzi (≈1-3 mm3) con le forbici o un bisturi e risciacquare accuratamente con PBS freddo.
      NOTA: In questo passaggio è molto importante lavorare velocemente ed eseguire la minima manipolazione per evitare danni alle cellule.
    2. Trasferire i pezzi tumorali in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 500 μL di PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione degli analiti. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO2.
    3. Recuperare il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 ml. Centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule dal campione.
    4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare nuovamente a 2.000 x g per 8 minuti a 4 °C.
    5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare nuovamente a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali detriti. Recupera il surnatante. Immediatamente aliquote e congelare il campione TIF su ghiaccio secco e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi.

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Risultati

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Abbiamo seguito la procedura sopra descritta per ottenere succo pancreatico da pazienti con PDAC (n = 31) e altre afflizioni pancreatiche benigne (non-PDAC, n = 9), tra cui pancreatite (n = 2), tumori dell'ampolla papillare (n = 4), tumori neuroendocrini (n = 2), neoplasia mucinosa papillare intraduttale (IPMN; n = 1) 12. I campioni di succo pancreatico sono stati quindi sottoposti ad analisi metabolomica mediante risonanza magnetica nucleare (1H-NMR)12

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Discussione

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In questo studio abbiamo descritto la tecnica per raccogliere intraoperatoriamente il succo pancreatico, una biopsia fluida in gran parte inesplorata. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico può essere sfruttato come fonte di marcatori metabolici della malattia12. L'analisi metabolomica su altre biopsie liquide, come sangue 5,6,7, urina8 e saliva9,

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Si ringrazia Roberta Migliore per l'assistenza tecnica. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall'Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) nell'ambito del progetto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLBD Biosciences309659
Provetta Eppendorf da 1,5 mLGreiner BioOneGR616201
20 µ m filtro cellularein nylon pluriSelect43-50020-03
ago 25GBD Biosciences305122
3 mL K2EDTA vacutainerBD Biosciences366473
siringa 3 mLBD Biosciences309656
50 mL Falcon tuboCorning352098
ClampsMedicon06.20.12
Bisturi monousoMedicom9000-10
Siero fetale bovinoMicrotechMG10432
Pinze a punta piattaMedicon06.00.10
Penicillina-StreptomicinaLonzaECB3001D
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8537
Cocktail di inibitori della proteasiRoche
RPMI medioEurocloneECB9006L
ForbiciMedicon02.04.09
Tripsina/EDTA 1xLonzaBE17-161F
Ultraglutammina 100xLonzaBE17-605E/U1
34044100

Riferimenti

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