Screening CRISPR/Cas9 in vivo per valutare contemporaneamente la funzione genica nella pelle del topo e nella cavità orale

Summary

Qui descriviamo una metodologia di screening CRISPR/Cas9 in vivo rapida e diretta utilizzando iniezioni lentivirali embrionali guidate da ultrasuoni in utero per valutare contemporaneamente le funzioni di diversi geni nella pelle e nella cavità orale dei topi immunocompetenti.

Abstract

I modelli di topo geneticamente modificati (GEMM) sono stati fondamentali per valutare la funzione genica, modellare le malattie umane e servire come modello preclinico per valutare le vie terapeutiche. Tuttavia, la loro natura ad alta intensità di tempo, manodopera e costi limita la loro utilità per l'analisi sistematica della funzione genica. I recenti progressi nelle tecnologie di editing del genoma superano tali limitazioni e consentono la rapida generazione di specifiche perturbazioni geniche direttamente all'interno di specifici organi del topo in modo multiplexato e rapido. Qui, descriviamo un metodo basato su CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) per generare migliaia di cloni gene knock-out all'interno dell'epitelio della pelle e della cavità orale dei topi e fornire un protocollo che dettaglia i passaggi necessari per eseguire uno schermo CRISPR in vivo diretto per i geni   soppressori del tumore. Questo approccio può essere applicato ad altri organi o ad altre tecnologie CRISPR/Cas9 come l'attivazione CRISPR o l'inattivazione CRISPR per studiare la funzione biologica dei geni durante l'omeostasi tissutale o in vari contesti di malattia.

Introduction

Una delle sfide per la ricerca sul cancro nell'era post-genomica è estrarre la grande quantità di dati genomici per le mutazioni geniche causali e identificare i nodi nella rete genica che possono essere mirati terapeuticamente. Mentre le analisi bioinformatiche hanno contribuito immensamente a raggiungere questi obiettivi, stabilire modelli efficienti in vitro e in vivo è un prerequisito per decifrare la complessità dei sistemi biologici e degli stati delle malattie e per consentire lo sviluppo di farmaci. Mentre i modelli convenzionali di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studi di genetica del cancro in vivo, la loro natura ad alta intensità di c....

Protocol

Questo protocollo è stato approvato ed eseguito in conformità con la IACUC dell'Università di Toronto.

1. Progettazione e clonazione di librerie CRISPR in pool

1. Seleziona 4-5 sgRNA mirati ai geni del mouse di interesse da risorse come il progettista di sgRNA del Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) o il server CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Selezionare un numero uguale di sgRNA non mirati, ad esempio Sanjana e altri^9, per generare una libreria di gRNA di controlli non mirati di dimensioni uguali.
2. Durante la costruzione delle librerie d....

Results

La figura 1A mostra la progettazione degli oligonucleotidi per il multiplexing di diverse librerie CRISPR personalizzate in modo conveniente in un singolo chip oligo da 12k o 92k. Una volta selezionati gli sgRNA (codificati a colori blu), gli oligonucleotidi sono progettati con siti di restrizione (BsmBI di colore arancione) e coppie di primer PCR specifiche della libreria (codificate a colori verdi). Diverse librerie possono essere progettate utilizzando una combinazione unica di coppie di .......

Discussion

L'editing del genoma CRISPR/Cas9 è stato ampiamente utilizzato in studi in vitro e in vivo per studiare le funzioni geniche e i processi cellulari. La maggior parte degli studi in vivo utilizza cellule modificate dal gene CRISPR/Cas9 innestate in un modello animale (allografto o xenograft). Sebbene questo sia un potente strumento per studiare la genetica del cancro e le funzioni cellulari, manca ancora del microambiente dei tessuti nativi e potrebbe provocare ferite e / o risposte immunitarie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro da 0,45 micron	Sigma	S2HVU02RE
chip oligo da 12k o 92k	Customarray Inc. (Genscript)
Piastre per colture cellulari da 15 cm	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Fosfatasi alcalina	NEB	M0290L
Amplicillina	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Sutura intestinale cromica	Covidien
Sequenziamento profondo (Next-Seq o Hi-Seq)	Kit
	Zymo Research	D4008
Kit per l'estrazione del DNA di sangue e tessuti DNAesy	Qiagen	69506
Celle elettrocompetenti Endura	Lucigen	60242-1
Capillari in vetro	Drummond	3-000-203-G/X
HEK293T celle	ATCC	CRL-3216
Centrifuga ad alta velocità Beckman	Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument	P97
Olio minerale	Sigma	M5904
Kit plasmidi Mini-prep	Frogga Bio	PDH300
Sistema di anestesia dell'ossigeno del topo	Visual Sonics
Nanoject II micromanipolatore	Drummond
NEBuffer 3.1 ( Tampone per BsmBI)	NEB	R0580L
Affilatore per aghi	Sutter Instrument	BV-10
Kit di pulizia	Oligo Zymo research	D4060
PAGE primer per sequenziamento illumina purificato	IDT DNA
PEI (polietilenimmina)	Sigma	408727-100ML
Argilla			da modellare Permoplast
Petridish con apertura centrale	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polimerasi 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Quantificazione fluorimetrica	Invitrogen	Q33327
Tappo semicircolare in silicone	Corning
Membrana in silicone	Visual Sonics
T4 DNA ligasi	NEB	M0202L
Provette per ultracentrifuga	Beckman Coulter	344058
Ecografo Vevo2000	Visual Sonics