Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità e i disturbi metabolici come diabete, malattie cardiache e cancro sono tutti associati a un drammatico rimodellamento dei tessuti adiposi. Le cellule progenitrici adipose residenti nei tessuti (APC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi dei tessuti adiposi e possono contribuire alla patologia tissutale. L'uso crescente di tecnologie di analisi a singola cellula , tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la proteomica a singola cellula, sta trasformando il campo delle cellule staminali / progenitrici consentendo una risoluzione senza precedenti dei cambiamenti di espressione delle singole cellule nel contesto dei cambiamenti a livello di popolazione o tessuto. In questo articolo, forniamo protocolli dettagliati per sezionare il tessuto adiposo epididimale del topo, isolare le singole cellule derivate dai tessuti adiposi ed eseguire lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per arricchire per uno Sca1+/ CD31-/CD45-/Ter119- APC praticabile. Questi protocolli consentiranno agli investigatori di preparare APC di alta qualità adatti per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA a cella singola.
Introduzione
Il tessuto adiposo gioca un ruolo chiave nel metabolismo energetico. L'energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi e il tessuto adiposo è in grado di espansione o retrazione significativa a seconda dello stato nutrizionale e della domanda energetica. L'espansione del tessuto adiposo può derivare da un aumento delle dimensioni degli adipocite (ipertrofia) e/o da un aumento del numero di adipocite (iperplasia); quest'ultimo processo strettamente regolato dalla proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici adipose1,2. Durante l'obesità, il tessuto adiposo si espande eccessivamente e la disfunzione tissutale - tra cui ipossia, infiammazione e resistenza all'insulina -si sviluppa spesso 3,4. Queste complicanze sono fattori di rischio per molte malattie croniche tra cui ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari, ictus e cancro5. Pertanto, limitare l'espansione incontrollata dei tessuti adiposi e mitigare le patologie tissutali adipose sono le principali priorità di ricerca biomedica. Durante l'espansione del tessuto adiposo, le cellule staminali derivate dai tessuti adiposi residenti (ASC) proliferano e si differenziano in sequenza in preadipociti (cellule progenitrici impegnate) e quindi in adipociti maturi6. Recenti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) mostrano che queste popolazioni di cellule progenitrici adipose (APC) (ASC e preadipociti) mostrano una sostanziale eterogeneità molecolare e funzionale7,8,9,10,11,12. Ad esempio, gli ASC mostrano una ridotta capacità di differenziazione adipogenica, ma presentano anche maggiori capacità di proliferazione ed espansione, rispetto ai preadipociti7. Ulteriori differenze molecolari sono riportate all'interno delle popolazioni ASC e preadipocite, anche se la rilevanza funzionale di queste differenze rimane poco chiara7. Insieme, questi dati evidenziano la complessità del pool di cellule progenitrici adipose e sottolineano la necessità di sviluppare e standardizzare strumenti per comprendere e manipolare meglio queste popolazioni di cellule critiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici ad alta vitalità Sca1+ adipose dalle pastiglie di grasso epididimomale del topo adatte per analisi sensibili a valle, tra cui studi a cella singola (sequenziamento scRNA) e coltura cellulare. L'isolamento e la dissociazione dei cuscinetti di grasso epididimali è statoeseguito come descritto in precedenza 7,13 con lievi modifiche che migliorano la vitalità delle APC isolate. In breve, le cellule dissociate dai cuscinetti adiposi epididimali sono macchiate di anticorpi contro Sca1, un marcatore sia per gli ASC che per i preadipociti6,7e altri marcatori di lignaggio (Lin): Ter119 (cellule erythroid), CD31 (cellule endoteliali) e CD45 (leucociti). Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- le celle vengono quindi ordinate in base all'ordinamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS). È importante sottolineare che questo protocollo è stato convalidato da un riuscito isolamento e analisi di cellule progenitrici sca1+/lin- adipose praticabili riportate in un recente studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula che ha identificato sottopopolazioni funzionalmente eterogenee all'interno di ASC e preadipociti7.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare la soluzione di collagenasi al 2% (w/v) sciogliendo la collagenasi II 2 g nella soluzione salina bilanciata di Hanks da 100 mL (HBSS). Aliquota 200 μL ciascuno per ogni utilizzo.
- Preparare il mezzo di neutralizzazione mescolando 84 mL F-12 medium, 15 mL di siero di cavallo e 1 mL penicillina/streptomicina.
- Preparare il tampone di citometria a flusso sciogliendo 500 mg di albumina di siero bovino (BSA) e 400 μL di 0,5 M EDTA in 100 mL della salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco.
2. Dissezione del cuscinetto adiposo epididimale e della dissociazione tissutale
- Eutanasia umana (isoflurane/lussazione cervicale) di un topo maschio. In questo protocollo è stato utilizzato un mouse FVB di quattro mesi.
- Applicare/spruzzare il 70% di etanolo sull'addome ed esporre la cavità addominale inferiore utilizzando forbici e forcep pulite.
- Individuare il cuscinetto grasso epididimico (prossimale/attaccato ai teste). Tenere la giunzione tra teste e cuscinetto grasso epididimale con forcette smussate e tirare delicatamente per liberare il cuscinetto grasso epididimale.
- Rimuovere i teste tagliando con forbici e incubare il cuscinetto di grasso epididimale in 5 ml di HBSS integrato con 3% di BSA in un tubo conico da 50 ml a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Centrifuga a 150 x g per 7 min a 4 °C.
- Prendere il cuscinetto di grasso epididimale galleggiante dal tubo conico da 50 ml e tritare finemente il tessuto usando forbici pulite.
- Aggiungere 200 μL di collagenasi soluzione al 2% in 3,8 ml di HBSS in un tubo di coltura da 13 ml. Aggiungere il tessuto tritato e incubare in un'incubatrice rotante a 5 giri/min per 1 h a 37 °C. Invece di un incubatore rotante, l'incubatore di coltura cellulare a 37 °C può essere usato alternativamente con agitazioni occasionali.
- Trasferire l'intero contenuto in un tubo conico da 50 ml e aggiungere 10 ml di mezzo di neutralizzazione. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 2-3 volte.
- Preparare un altro tubo conico da 50 ml dotato di un filtro a celle da 70 μm. Filtrare il tessuto digerito nel nuovo tubo utilizzando il filtro cellulare.
- Trasferire il flusso fino a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 350 x g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere con cura i pellet di cellule supernatanti e resuspend con 5 mL di DPBS. Centrifuga a 350 x g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 50 μL di tampone di citometria di flusso. Mescolare bene tubazione delicatamente e mantenere le cellule sul ghiaccio. A causa del volume del pellet cellulare e della piccola quantità di supernatante residuo, il volume totale di cellule nel buffer di citometria del flusso sarà maggiore di 50 μL (circa 100 μL).
3. Etichettatura degli anticorpi e smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS)
- Dopo aver mescolato bene le cellule con una tubazione delicata, trasferire 54 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,7 ml. Aggiungere 6 μL di reagente bloccante FcR e mescolare bene tubazione delicatamente. Incubare a 4 °C per 10 min. Salvare le cellule rimanenti dopo aver preso 54 μL e tenerle nel ghiaccio da utilizzare come controllo non macchiato nel passaggio 3.5 e nel passaggio 3.6.
- Durante l'incubazione nella fase 3.1, preparare un cocktail di anticorpi combinando 11 μL ciascuno di anticorpi anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anti-CD45-FITC in un tubo di microcentrifugo. Mescolare bene con una pipettazione delicata e mantenere il ghiaccio protetto dalla luce.
- Dopo l'incubazione con reagente bloccante FcR per 10 min, aggiungere 40 μL del cocktail anticorpale e mescolare bene con pipettaggio delicato. Incubare a 4 °C per 10 min.
- Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso integrato con 1 μg/mL di DAPI nelle celle macchiate. Mescolare bene con tubazioni delicate e celle filtranti utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro a celle. Tieni le cellule sul ghiaccio.
- Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso alle cellule rimanenti nel passaggio 3.1 e mescolare bene con una pipettazione delicata. Filtrare le celle utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro cellulare. Tenere queste cellule sul ghiaccio e utilizzarle come controllo non macchiato nel passaggio seguente.
- Porta le celle macchiate e il controllo non macchiato allo strumento di analisi o ordinamento FACS.
- Identificare e isolare la popolazione APC+/FITC-/DAPI- con strategie di gating mostrate nella figura 1. Queste celle rappresentano cellule Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. I detriti e gli aggregati cellulari sono esauriti utilizzando grafici a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC). Quindi, DAPI- la popolazione è gated, seguita da gating di APC+/ FITC- popolazione. I controlli non macchiati devono essere utilizzati per aiutare a impostare i parametri di gating.
- Raccogliere le cellule in 500 μL di tampone di citometria di flusso in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Andando avanti, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili per ridurre al minimo una contaminazione. Circa 50.000 - 100.000 cellule vengono raccolte da un topo.
- Contare le cellule usando un emocitometro per valutare la vitalità cellulare. Poiché gli aggregati cellulari possono interferire con ulteriori analisi a valle, viene valutata anche la presenza di aggregati cellulari per garantire una presenza minima (<5% del numero di cellule vitali) di questi aggregati.
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Risultati
In questo esperimento sono stati utilizzati topi FVB maschi di quattro mesi. Dopo l'esclusione di detriti e doppietti utilizzando appezzamenti FSC/SSC, le cellule vitali (DAPI- popolazione) sono state gated, seguite dalla selezione di APC+/FITC- popolazione (Figura 1). I gate DAPI, APC e FITC sono stati disegnati in base al controllo non macchiato. Le strategie di gating sono mostrate nella figura 1.
D...
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Discussione
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sta rapidamente guadagnando trazione come un potente strumento per studiare contemporaneamente diverse popolazioni cellulari a livello di singola cellula. A causa degli elevati costi associati alla preparazione del campione e all'elevato sequenziamento della produttività, è imperativo ottimizzare gli input cellulari (alta vitalità e purezza) per aumentare la probabilità di successo sperimentale. Alcuni protocolli di preparazione cellulare si basano sulla rimozione ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo la Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility per l'assistenza allo smistamento FACS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Provetta per coltura da 13 mL | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| Provetta conica da 15 mL | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| Provetta da 5 mL con filtro cellulare tappo a scatto | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Provetta conica da 50 mL | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µ filtro cellulare m | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anticorpo anti-CD31-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anticorpo anti-CD45-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anticorpo anti-Sca1-APC | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anticorpo anti-Ter119-FITC | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenasi di tipo II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 media | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| Reagente bloccante FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Siero di cavallo | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillina-streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Soluzione di ioduro di propidio | Miltenyi Biotec | Codice 130-093-233 |
Riferimenti
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