Determinazione delle dimensioni e analisi fenotipica delle vescicole extracellulari urinarie mediante citometria a flusso

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di vescicole extracellulari urinarie, uEV, da donatori umani sani e la loro caratterizzazione fenotipica in base alle dimensioni e all'espressione del marcatore di superficie mediante citometria a flusso.

Abstract

Le vescicole extracellulari, EV, sono un complesso eterogeneo di membrane lipidiche, secrete da qualsiasi tipo di cellula, in qualsiasi fluido come l'urina. Le vescicole extracellulari possono essere di diverse dimensioni, che vanno da 40-100 nm di diametro, come negli esosomi, a 100-1000 nm nelle microvescicole. Possono anche contenere diverse molecole che possono essere utilizzate come biomarcatori per la prognosi e la diagnosi di molte malattie. Molte tecniche sono state sviluppate per caratterizzare queste vescicole. Uno di questi è la citometria a flusso. Tuttavia, non esistono rapporti che mostrino come quantificare la concentrazione di vescicole extracellulari e differenziarle in base alle dimensioni, insieme al rilevamento dei biomarcatori. Questo lavoro si propone di descrivere una procedura per l'isolamento, la quantificazione e la fenotipizzazione di vescicole extracellulari urinarie, uEVs, utilizzando un citometro convenzionale per l'analisi senza alcuna modifica alla sua configurazione. I limiti del metodo includono la colorazione di un massimo di quattro diversi biomarcatori per campione. Il metodo è limitato anche dalla quantità di vescicole extracellulari disponibili nel campione. Nonostante queste limitazioni, con questo protocollo e la sua successiva analisi, possiamo ottenere maggiori informazioni sull'arricchimento dei marcatori delle vescicole extracellulari e sull'abbondanza di queste vescicole presenti nei campioni di urina, nelle malattie che comportano danni renali e cerebrali.

Introduzione

Nei mammiferi, il sangue viene filtrato passando attraverso i reni 250 - 300 volte; Durante questo periodo, si forma l'urina. La produzione di questo biofluido è il risultato di una serie di processi, tra cui la filtrazione glomerulare, il riassorbimento tubulare e la secrezione. I prodotti di scarto metabolici e gli elettroliti sono i componenti principali dell'urina. Inoltre, altri sottoprodotti come peptidi, proteine funzionali e vescicole extracellulari (EV) vengono escreti 1,2,3,4,5,6.

Protocollo

I campioni di urina umana sono stati ottenuti da volontari sani che avevano firmato il consenso informato del donatore. Queste procedure sono state approvate anche dal Comitato Etico per la Ricerca dell'Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Isolamento delle vescicole extracellulari urinarie

NOTA: Il protocollo di isolamento degli uEV è stato modificato rispetto al ^rif.19. La Figura 1 illustra la rappresentazione del protocollo per isolare gli uEV.

Risultati

Ci sono diversi punti di controllo attraverso il protocollo e prima della colorazione degli uEV. Pertanto, è essenziale verificare prima la quantità di proteine presenti nell'estratto di uEV. Tutti i gruppi di ricerca che lavorano con le vescicole extracellulari quantificano la proteina, come indicato nel passaggio 2.1. La Figura 2 supplementare mostra una piastra rappresentativa a 96 pozzetti contenente la frazione di uEV nei pozzetti 4E, 5E e 6E. I pozzetti 1A, 2A e 3A sono costituiti da spazi vuoti, m.......

Discussione

Al giorno d'oggi, l'uso di vescicole extracellulari come biomarcatori per diverse malattie è aumentato, soprattutto per quelle che possono essere isolate da fonti non invasive come l'urina 5,21,22,23,24. È stato dimostrato che l'isolamento delle uEV è una risorsa vitale per conoscere lo stato di un individuo sano e la diagnos.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
APC anti umano CD156c (ADAM10) anticorpo	BioLegend	352706	Add 5 µ L al 20 µ L di uEV
nell'anticorpo PBS APC anti TSPAN33 umano (BAAM)	BioLegend	395406	Add 5 µ L al 20 µ L di uEV nella centrifuga PBS
Avanti con rotore ad angolo fisso JA-25.5O	Beckamn Coulter	J-26S XPI
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
β-mercaptoethanol	SIGMA-Aldrich	M3148
Centrifuga da banco con rotore A-4-44	Eppendorf	5804
BLUEstain 2 protein ladder	GOLDBIO	P008
CD9 (C-4) anticorpo monoclonale di topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118
CD63 (MX-49.129.5) anticorpo monoclonale di topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-5275
Cell Trace Kit di proliferazione cellulare CFSE per citometria a flusso	Thermo Scientific	C34554
Sistema Chemidoc XRS+	BIORAD	5837
FITC anti anticorpo CD9 umano	BioLegend	312104	Add 5 µ L al 20 µ L di uEV
nell'anticorpo CD37 anti-umano PBS FITC	BioLegend	356304	Add 5 µ L al 20 µ L di uEV in PBS
Particelle gialle fluorescenti	Spherotech	FP-0252-2
Particelle gialle fluorescenti	Spherotech	FP-0552-2
Particelle gialle fluorescenti	Spherotech	FP-1552-2
FlowJo Software	Becton, Dickinson and Company
Goat anti-mouse immunoglobuline/HRP	Dako	P0447
Cocktail di inibitori della proteasi Thermo	Scientific	78429
Membrana PVDF Immun-Blot 0,22µ m	BIORAD	1620177
Megamix-Plus FSC BEADS	COSMO BIO CO. LTD	7802
NuPAGE LDS tampone per campioni 4X	Thermo Scientific	NP0007
Ultracentrifuga Optima con rotore 90Ti ad angolo fisso 355530	Beckamn Coulter	XPN100
Page Soluzione blu per la colorazione delle proteine	Thermo Scientific	24620
PE anticorpo CD53 umano	BioLegend	325406	Add 5 &; L al 20 µ L di uEV in PBS
Pierce BCA Kit per il dosaggio delle proteine	Thermo Scientific	23227
Percusore Pierce RIPA	Thermo Scientific	89900
Provette per centrifuga in policarbonato a parete spessa	Beckamn Coulter	355630
Perle di validazione Spherotech 8-Peak (FL1-FL3)	BD Perle di validazione Accuri	653144
Spherotech 6-Peak (FL4)	BD Accuri	653145
Saccarosio	SIGMA-Aldrich	59378
Trietanolammina	SIGMA-Aldrich	90279