Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

Sommario

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per produrre fette dell'ippocampo dorsale per l'esame elettrofisiologico. Questa procedura impiega la perfusione con ACSF raffreddato prima della preparazione della fetta con un angolo di taglio vicino alla coronale che consente la conservazione dei neuroni principali sani.

Abstract

Le registrazioni di patch-clamp su cellule intere da fette di cervello di roditori acuti sono un pilastro della moderna ricerca neurofisiologica, consentendo una misurazione precisa delle proprietà cellulari e sinaptiche. Ciononostante, oltre all'elettrofisiologia a fette, vi è una sempre maggiore necessità di eseguire analisi correlate tra diverse modalità sperimentali, ad esempio: immunoistochimica, biologia molecolare, imaging in vivo o registrazione elettrofisiologica; per rispondere a domande sempre più complesse sulla funzione cerebrale. Tuttavia, trarre conclusioni significative da questi vari approcci sperimentali non è semplice, poiché anche all'interno di strutture cerebrali relativamente ben descritte, esiste un alto grado di variazione sub-regionale della funzione cellulare. In nessun altro luogo questo è meglio esemplificato che nel CA1 dell'ippocampo, che ha proprietà dorso-ventrali ben definite, basate su proprietà cellulari e molecolari. Tuttavia, molti studi pubblicati esaminano i modelli di espressione proteica o l'attività in vivo correlata comportamentale nell'estensione dorsale dell'ippocampo; e spiegare i risultati meccanicisticamente con l'elettrofisiologia cellulare dalla regione ventro-mediale. Ciò è ulteriormente confuso dal fatto che molti esperimenti elettrofisiologici di taglio acuto vengono eseguiti in animali giovani, mentre altre modalità sperimentali vengono eseguite in animali più maturi. Per affrontare questi problemi, questo metodo incorpora la perfusione transcardica di roditori maturi (>60 giorni) con liquido cerebrospinale artificiale, seguita dalla preparazione di fette coronali modificate, compreso il polo settale dell'ippocampo dorsale, per registrare dalle cellule piramidali CA1. Questo processo porta alla generazione di fette acute sane dell'ippocampo dorsale, consentendo l'interrogazione elettrofisiologica cellulare basata su fette abbinata ad altre misure.

Introduzione

L'ippocampo è probabilmente la struttura più studiata nel cervello dei mammiferi, a causa delle sue dimensioni relativamente grandi e della struttura laminare prominente. L'ippocampo è stato implicato in una serie di processi comportamentali: navigazione spaziale, memoria contestuale e formazione di episodi. Ciò è, in parte, dovuto alla relativa facilità di accesso alle porzioni dorsali dell'ippocampo nei roditori per l'analisi in vivo . Infatti, le principali celle di uscita sono in genere a meno di 2 mm dalla superficie del pial.

Nei roditori, l'ippocampo è una struttura relativamente grande, formata da un'invaginazione del telencefalo che si estende dal setto dorsale alla neocorteccia ventrale. È composto da 2 regioni principali: il giro dentato e il cornu ammonis (CA); quest'ultimo è diviso in 3 sottoregioni ben descritte (CA1-3) che si estendono nel giro ilato dentato (precedentemente noto come CA4), in base alla connettività, all'anatomia cellulare e alle proprietà genetiche¹. Questa struttura è mantenuta lungo l'estensione dorso-ventrale dell'ippocampo, anche se con importanti variazioni nelle proprietà sinaptiche ^2,3,4, nell'anatomia⁵, nella diversità genetica ^6,7,8 e nella funzione comportamentale ^9,10. Delle regioni CA, il sottocampo CA1 è composto in gran parte da cellule piramidali CA1 glutammatergiche (CA1 PC), per le quali sono stati definiti 3 sottotipi¹¹, e interneuroni inibitori che costituiscono ~10% dei neuroni, ma sono altamente diversificati con oltre 30 sottotipi definiti 12,13,14. Oltre alle differenze specifiche regionali, è stato dimostrato che l'invecchiamento normale ha effetti drammatici sulla trasmissione sinaptica ^15,16,17, sull'anatomia¹⁸ e sul profilo genetico¹⁹. L'attuale metodo gold standard per valutare la complessità delle proprietà cellulari e sinaptiche in modo controllato è attraverso l'uso di registrazioni di patch-clamp su cellule intere da fette cerebrali acute²⁰.

La comprensione della funzione dell'ippocampo si basa in gran parte sulla manipolazione dorsale a causa della facilità con cui vi si accede chirurgicamente o anatomicamente per compiti comportamentali, impianto di elettrodi o finestre di imaging o espressione di plasmidi virali. In molti studi, inoltre, queste procedure vengono eseguite con roditori tardivamente giovani o adulti per prevenire la variabilità della struttura cerebrale durante lo sviluppo. Nonostante ciò, molti approcci per esaminare l'elettrofisiologia cellulare e subcellulare vengono eseguiti in roditori giovani precoci e medi, per lo più dalla porzione ventro-mediale dell'ippocampo nel suo piano trasversale 21,22,23,24,25. Quando è stata valutata l'intera estensione dorso-ventrale, si utilizza un trincia-tessuto per mantenere l'estensione trasversale ^4,26, oppure l'esperimento è stato eseguito su giovani ratti²⁷ o topi²⁸. Inoltre, è noto che il raffreddamento del tessuto prima della dissezione del cervello preserva la struttura ippocampale nei ratti²⁹ e i neuroni neocorticali nei topi^30,31. Tuttavia, c'è una scarsità di dettagli riguardo alla produzione di fette di cervello dall'asse trasversale dorsale dell'ippocampo, come generato da fette coronali modificate, nei ratti maturi.

Questo protocollo descrive un approccio mediante il quale è possibile ottenere registrazioni di patch-clamp su cellule intere da singoli neuroni o coppie in fette coronali modificate di ippocampo dorsale da ratti anziani, seguite da un'identificazione morfologica post-hoc. Fette di cervello sane sono ottenute in seguito alla perfusione transcardica del liquido cerebrospinale artificiale raffreddato (ACSF), facilitando la misurazione delle proprietà elettrofisiologiche dai PC CA1 e dagli interneuroni locali.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati generati e mantenuti secondo le linee guida del Ministero dell'Interno e delle Istituzioni (HO# P135148E). Tutti i ratti sono stati mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua.

1. Perfusione transcardica di ACSF refrigerato

1. Prima di tutti gli esperimenti, mettere ~200 mL di saccarosio-ACSF (Tabella 1) nel congelatore a -20 °C (fino a semi-congelamento, per affettare) e altri ~100-200 mL di saccarosio-ACSF filtrato su ghiaccio (per perfusione), gorgogliando con carbogeno (95% O₂/5% CO₂).
2. Raccogli un ratto adulto dalla sua gabbia domestica e mettilo per ~30 minuti in una gabbia di contenimento nella sala operatoria per acclimatarsi ai livelli di rumore e luce.
3. Preparare gli strumenti di dissezione (Figura 1A), l'area di perfusione e l'anestetico iniettabile (circa 1 mL di 200 mg/mL di pentobarbital sodio per una concentrazione finale di 100 mg/kg).
4. Preparare un'adeguata camera di anestesia inserendo all'interno un piccolo tampone di carta velina o cotone idrofilo. Introdurre 1-2 mL di anestetico isoflurano volatile nel materiale assorbente nella camera.
5. Metti il ratto in una camera di anestesia per sedarlo. Monitorare la respirazione fino a quando la frequenza respiratoria non scende a ~1 respiro superficiale al secondo.
6. A questo punto, iniziare a far bollire il saccarosio-ACSF semicongelato con carbogeno su ghiaccio da utilizzare durante l'affettatura.
7. Pesa il topo e annota il suo peso.
8. Anestetizzare terminalmente il ratto iniettando il pentobarbital di sodio preparato nella cavità intraperitoneale. La dose di pentobarbital sodico deve essere di 100 mg/kg, calcolata in base al peso precedentemente assunto e alla concentrazione di stock del farmaco. Posizionare il ratto in una camera di detenzione e attendere 0,5-5 minuti per l'inizio dell'anestesia terminale.
9. Confermare la cessazione dei riflessi: testare sia i riflessi del battito di ciglia corneale (toccare la pupilla) che quello del pizzicamento della zampa posteriore (sollevare la gamba e pizzicare la zampa posteriore) utilizzando una sonda smussata (cioè una pinza arrotondata). Una volta cessati i riflessi, inchiodare il ratto al pannello chirurgico di polistirene o sughero usando aghi ipodermici.
10. Aprire la cavità toracica e posizionare la cannula alla base del ventricolo sinistro del cuore. Forare l'atrio destro e iniziare immediatamente la perfusione con il saccarosio-ACSF ghiacciato (0-1 °C) (utilizzando una pompa peristaltica a 50 mL/minuto).
11. Una volta avvenuto il completo scambio di liquidi e il raffreddamento del corpo (<5 minuti), rimuovere la cannula e gli spilli, quindi decapitare utilizzando una ghigliottina.
12. Rimuovere con cautela e rapidità il cranio utilizzando le forbici per ossa e gli strumenti per ossa Rongeur (Figura 1A, 1B).
    1. Inizia facendo 2 tagli bilaterali attraverso il forame magno usando le forbici ossee e rimuovi il cranio dalla sutura lambda con i Rongeurs. Taglia con cura lungo la sutura della linea mediana con le forbici ossee fino a dietro gli occhi.
    2. Esegui 2 tagli bilaterali attraverso il cranio, perpendicolarmente alla linea mediana. Usando i Rongeurs, apri il teschio lungo la linea mediana. Prestare particolare attenzione a rimuovere la pia madre usando forbici sottili o un ago uncinato.
13. Estrarre il cervello dal cranio usando una spatola smussata, recidendo i nervi cranici e ottici con una compressione da un lato all'altro. Mettere il cervello in saccarosio-ACSF carbogenato, semicongelato (0-1 °C) per 1-2 minuti prima di affettare.

2. Preparazione di fette di cervello dall'ippocampo dorsale

1. Togliere il cervello perfuso dal saccarosio-ACSF semi-congelato (0-1 °C) e metterlo in una capsula di Petri di vetro rivestita con carta da filtro. Posiziona il cervello sulla sua superficie ventrale.
2. Usando un bisturi (lama n. 22), rimuovere la parte posteriore del cervello a ~10° dalla verticale per creare una superficie piana per incollare il cervello al tavolino (Figura 1C).
3. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilica sul palco del vibratomo. Stendere la colla per creare un film sottile più grande di circa il 50% rispetto all'area della sezione trasversale della superficie tagliata del cervello.
4. Solleva il cervello dal piatto di vetro su una spatola, con il lato tagliato verso il basso, usando un pennello per guidare il tessuto. Tamponare il cervello con un pezzo di tessuto per rimuovere l'eccesso di ACSF e far scorrere il cervello, la superficie tagliata verso il basso, al centro della colla. Usando una pipetta Pasteur, aggiungi 1-2 ml di saccarosio-ACSF ghiacciato sul cervello per rimuovere la colla dal blocco cerebrale.
5. Posizionare il cervello nella camera di affettatura e inondare con saccarosio semicongelato ACSF. Usa un cucchiaio o una spatola per tenere il ghiaccio in eccesso lontano dal blocco cerebrale, quindi carbognato (Figura 1D).
6. Spostare la lama del vibratomo in posizione: ~1 mm dalla superficie dorsale del cervello e verticalmente ~1 mm anteriormente alla bregma. Assicurarsi che la lama sia completamente immersa e rimuovere le bolle con un pennello.
7. Inizia a tagliare il cervello. Per tagliare fino all'ippocampo dorsale, utilizzare una velocità di 0,1-0,2 mm/s, con un movimento orizzontale della lama di 1-1,5 mm e una frequenza oscillatoria reciproca di ~90 Hz. Quando si affetta l'ippocampo dorsale, ridurre la velocità a 0,05-0,1 mm/s.
8. Raccogli fette di ippocampo dorsale (nominalmente 3-4 fette intere o 6-8 fette emiscate) per cervello. Se sono necessarie fette longitudinali di ippocampo ventro-mediale, continuare ad affettare. Una volta che l'ippocampo dorsale è stato tagliato, non è necessario tagliare il tessuto extra oltre approssimativamente la posizione del 3^{° ventricolo} . Fermare il vibratomo, separare la fetta con un ago ipodermico piegato e raccoglierla alla base della camera di affettamento.
   NOTA: Le fette possono avere uno spessore di 250-500 μm, a seconda dei requisiti sperimentali. Per le registrazioni dall'ippocampo dorsale, in genere utilizzare fette spesse 400 μm per preservare la maggior parte della rete locale, consentendo al contempo le condizioni di microscopia adeguate.
9. Taglia le fette in modo che contengano solo l'ippocampo e la corteccia sovrastante sotto un microscopio da dissezione. Trasferire le fette nella camera preriscaldata a 35 °C con la superficie anteriore rivolta verso l'alto.
10. Determinare la camera di stoccaggio in base all'esperimento da eseguire. Per ottenere registrazioni di alta qualità con patch-clamp a cellula intera o sul campo extracellulare vicino alla superficie della fetta in camere di registrazione sommerse, conservare in camere sommerse. In alternativa, conservare in una camera di interfaccia liquido/gas per le registrazioni dell'attività oscillatoria della rete o per le registrazioni del campo extracellulare dell'interfaccia.
11. In condizioni di conservazione sommersa, lasciare che le fette si riprendano a 35 ºC per 30 minuti dal momento in cui l'ultima fetta è entrata nella camera di conservazione. Ciò consente la riattivazione dei processi metabolici e la risigillatura dei neuriti tagliati. Dopo 30 minuti, trasferire la camera di conservazione a temperatura ambiente.

3. Registrazione dei neuroni dell'ippocampo dorsale

1. Fabbricare pipette di patch di registrazione da vetro capillare. Questo protocollo utilizza vetro borosilicato di 1,5 mm di diametro esterno e 0,86 mm di diametro interno con filamento, che produce una resistenza della punta di 3-5 MΩ quando riempito con soluzione intracellulare (Tabella 1). Conservare le soluzioni intracellulari refrigerate su ghiaccio per evitare la degradazione dei componenti energetici e filtrate prima dell'uso (filtro per siringa, dimensione dei pori: 0,2 μm).
2. Registrazione dell'ACSF del carbogenato e preriscaldamento a bagnomaria (35-40 ºC). Erogare l'ACSF carbogenato e preriscaldato alla camera di registrazione tramite un tubo di perfusione assistito da una pompa peristaltica. Iniziare la perfusione alcuni minuti prima di trasferire una fetta nella camera.
3. Fermare la perfusione e trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione con la superficie anteriore rivolta verso l'alto. Tieni la fetta in posizione con un anello di platino con singole fibre di seta attaccate per formare una forma ad "arpa". Posizionare le fette in modo che lo strato piramidale di CA1 scorra perpendicolarmente all'asse della prima pipetta di registrazione.
4. Riavviare il flusso di ACSF di registrazione carbogenato e preriscaldato (35-40 ºC) (Tabella 1) a una velocità ottimale di 6-8 mL∙^min-1.
   NOTA: Portate elevate (6-8 mL∙^min-1) sono ottimali per mantenere l'attività di rete nelle sezioni³². Portate più basse (ad esempio, 2-3 mL∙^min-1) possono essere utilizzate per mantenere la stabilità della fetta per esperimenti di imaging o dove non è richiesta un'attività di rete biologicamente rilevante.
5. Valuta la qualità delle fette utilizzando ottiche a contrasto di inferenza differenziale a infrarossi (IR-DIC) con ingrandimento dell'obiettivo 40x (visualizzato con una telecamera CCD). Si presume una buona qualità della fetta se si può vedere un gran numero di PC CA1 di forma ovoidale, moderatamente contrastati nella piramide str. a profondità di 20-30 μm al di sotto di una superficie liscia e leggermente increspata (Figura 2A). Le sezioni di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastate, rimpicciolite o gonfie, con una superficie irregolare.
6. Riempire le pipette per cerotti con una soluzione intracellulare (ad es. basata su un [Cl^-] intracellulare di 24 mM) per consentire il confronto con altri dati pubblicati.
7. Eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere come descritto in precedenza²². Escludere le cellule dall'analisi se il potenziale di membrana (V_M) al breakthrough è più depolarizzato di -50 mV, la resistenza in serie è >30 MΩ; oppure la resistenza in serie cambia del >20% nel corso della registrazione. In queste condizioni di registrazione, la resistenza in serie è tipicamente compresa tra 8 e 25 MΩ ed è stabile fino a 1 ora.
8. Per esaminare l'eccitabilità intrinseca del CA1 dall'ippocampo dorsale, testare le proprietà fisiologiche intrinseche con registrazioni di cellule intere con i seguenti protocolli in configurazione current-clamp:
   1. Dal potenziale di membrana a riposo senza corrente di polarizzazione applicata, applicare piccoli passi di corrente (-10 pA, 500 ms) ripetuti 30 volte.
   2. Da -70 mV con corrente di polarizzazione applicata, applicare passi di corrente da iper a depolarizzanti della durata di 500 ms (da -100 a +400 pA, passi di 25 pa) con 3 ripetizioni di una famiglia di tracce.
   3. Applicare un'onda sinusoidale di 100 pA di ampiezza picco-picco, con frequenza variabile da 0,1 a 20 Hz. Ripetere 3 volte.
   4. Applicare stimoli 5x 2 nA, 2 ms per guidare i potenziali d'azione a 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 sweep per frequenza.
   5. Da un voltage-clamp a -70 mV, applicare 5 minuti di correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee (EPSC) per la registrazione.
9. Per richiudere le cellule per l'analisi istologica dopo la registrazione riuscita, produrre cerotti outside-out ritraendo lentamente la pipetta del cerotto. Quando si osserva un aumento della resistenza in serie dai livelli sperimentali a >1 GΩ misurato da un impulso di prova a -5 mV, aumentare il potenziale di mantenimento a -40 mV e ritrarre completamente la pipetta.
10. Eseguire registrazioni aggiuntive nella stessa fetta per soddisfare la potenza statistica richiesta dal disegno sperimentale.
11. Rimuovere le fette di cervello contenenti i neuroni registrati dalla camera di registrazione, posizionarle in una piastra a 24 pozzetti, sostituire l'ACSF con paraformaldeide al 4% (in tampone fosfato 0,1 M) e lasciare riposare per una notte.
12. Il giorno successivo, sostituire il PFA con un tampone fosfato 0,1 M e conservare fino al trattamento istologico. Visualizzare le cellule con streptavidina coniugata fluorescente come descritto in precedenza²².

Risultati

Il protocollo sopra descritto consente la preparazione di fette vitali dal polo settale dell'ippocampo dorsale nei ratti maturi. Un fattore chiave in questo protocollo è la perfusione di saccarosio-ACSF refrigerato, prima della preparazione della fetta, che si traduce in PC CA1 sani prossimali alla superficie della fetta. La qualità della fetta prodotta viene valutata visivamente in ottica IR-DIC e le cellule sane identificate come dotate di grandi corpi cellulari di forma ovoidale si trovano in tutta l'estensione dello ...

Discussione

Qui, viene descritto un protocollo per produrre fette di cervello di alta qualità dall'estensione dorsale del CA1 dell'ippocampo, consentendo registrazioni da più neuroni vitali all'interno di questa regione. L'approccio combinatorio della registrazione di intere cellule da fette quasi coronali seguita dalla visualizzazione neuronale è fondamentale per la conferma della vitalità e dell'identità cellulare.

Questo protocollo produce in modo affidabile sezioni va...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Software di acquisizione	Molecular Devices	pClamp 10
Ratti adulti	Vari	n/a	Qualsiasi ceppo di ratto adulto (60 giorni e oltre)
Amplificatore	Molecular Devices	Axopatch 700B
Software di analisi	Freeware	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
Forbici ossee	FST	16152-12	Stile Littauer
Apparecchio Harvard in	vetro capillare	30-0060	Pipette in vetro borosilicato con filamento diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 0,86 mm.
Carbogen	BOC	Vari	95% O2/5% CO2
CCD camera	Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
Chemicals/Reagents	Sigma Aldrich	Various	Tutti i reagenti di laboratorio acquistati da Sigma Aldrich.
Cianoacrilato (ad es. RS Pro 3)	Componenti RS	918-6872	Evitare formulazioni di cianoacrilato a base di gel
Digitalizzatore Dispositivi	molecolari	Digidata 1550B
Perni/aghi di dissezione	Vari	Vari	Aghi da 16 gauge (sopra)
Sistema di elettrofisiologia	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Forbici per iride fini	FST	14568-12	Con punte in carburo di tungsteno
Piastra di Petri in vetro	Fisher Scientific	12911408
Aghi ipodermici	BD Healthcare	Vari	calibro 16, 18 e 22
Isofluorano 100% P/P (i.e.IsoFlo)	Zoetis	50019100
Forbici tipo Mayo	FST	14110-17	Punte smussate
Micromanipolatori	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Paintbrush	Art store	n/a	Un pennello a setole fini, acquistato da un negozio d'arte locale.
Pipetta Pasteur	Fisher Scientific	11546963	Una pipetta Pasteur in vetro, ma tagliata in modo che l'estremità smussata venga utilizzata per trasferire la pipetta.
Pompa peristaltica	Watson Marlow	12466260	Pompa peristaltica a canale singolo
Estrattore di pipette	Sutter Instruments	P-97	Altri modelli e metodi di produzione di pipette funzionerebbero altrettanto bene.
Siringhe di plastica (1, 2, 5 mL)	BD Healthcare	Vari
strumenti per ossa Rongeur	FST	16021-14
Camera di tenuta per fette	Fatto in casa
Peso fetta/arpa	Apparecchio Harvard	SHD-22L/15	Le alternative sarebbero adatte.
Pentobarbital di sodio (cioè Pentoject)	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL; altre formulazioni di pentobarbital sarebbero adatte
Spatola	Bochem	3213	Disponibile da Fisher Scientific
Filtri per siringhe	Fisher Scientific 10482012		Filtri per siringhe di marca Corning, 0,22 e micro; m diametro dei pori.
Vibtratome	Leica	1491200S001	modello VT1200S con
bagnomaria	Fisher Scientific 15167015		bagnomaria da 5 litri, ad esempio: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro

Vibrocheck