Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.
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Articolo metodologico
Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.
Introduzione
La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.
La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellula....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Preparare soluzioni
- Preparare la soluzione di taglio del saccarosio per l'affezione, come descritto nella tabella 1.
NOTA: Dopo aver preparato 1 L di soluzione di saccarosio, congelare una piccola quantità (circa 100-200 mL) in un vassoio di ghiaccio. Questi cubetti di ghiaccio di saccarosio congelati saranno miscelati in un liquame ghiacciato (vedere fase 4.3). - Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la registrazione come de....
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Risultati
Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher d.......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazioni.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'autore desidera ringraziare Steve Siegelbaum per il supporto. I finanziamenti sono forniti da 5R01NS106983-02 e 1 F31 NS113466-01.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stampante 3D | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Supporto per incubazione di fette di cervello acuto | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Progettato da ChiaMing Lee, disponibile all'indirizzo |
| https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 Adenosina 5′-trifosfato sale di magnesio | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl pellet macinato | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| acido ascorbico | Alfa Aesar | 36237 | |
| becher (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| becher (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| frullatore | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Forbici Bonn, | Dickinson | 14184-09 | |
| con filamento (D.E. 1,5 mm, D.I. 0,86 mm, lunghezza 10 cm) | preferibili i capillari Sutter | Instruments | BF150-86-10HP |
| soluzione di cloruro di calcio (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| fotocamera | Olympus | OLY-150 | |
| gas carbogeno compresso (95% ossigeno / 5% anidride carbonica) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| ossigeno compresso | Airgas | OX 200 | |
| stimolatore isolato a tensione costante | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| vetrini coprioggetti (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| adesivo cianoacrilato | Krazy Glue | KG925 | Utilizzare idealmente la forma a pennello per il |
| software di acquisizione dati | Axograph | N/A Qualsiasi | software equivalente (ad es. pClamp) funzionerebbe. |
| Workstation tower Dell Precision T1500 Desktop | Dell | N/A | Il numero di catalogo dipende dal computer specifico: qualsiasi computer funziona purché sia in grado di eseguire il software di acquisizione elettrofisiologica. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| timer digitale | VWR | 62344-641 | timer tracciabile a 4 canali |
| tamponi assorbenti usa e getta | VWR | 56616-018 | |
| forbici per dissettore | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| lame di rasoio a doppio taglio | Personna | BP9020 | |
| doppio automatico regolatore di temperatura | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| camera di registrazione ottimizzata a doppia superficie o a flusso laminare | N/A | N/A | La camera presentata in questo protocollo è realizzata su misura. Un equivalente commerciale sarebbe l'RC-27L della Warner Instruments. |
| rack per attrezzature | Automate Scientific | FR-EQ70" | Un rack non è strettamente necessario ma utile per organizzare l'elettrofisiologia |
| Glicole etilenico-bis(2-amminoetietere)- N,N,N',N'-acido teetraacetico (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| carta da filtro | Whatman | 1004 070 | |
| scala fine | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Estrattore per micropipette fiammante/marrone | Sutter Instruments | P-97 | |
| piastra di Petri in vetro (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucosio | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosina 5′-trifosfato sale sodico idrato | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| secchielli per ghiaccio | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurano | Servizi di anestesia generale | Tec 3 | |
| nastro da laboratorio | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| carta per lenti | Fisher Scientific | 11-996 | |
| sorgente luminosa | Olympus | TH4-100 | |
| soluzione di cloruro di magnesio (1 M) | Qualità biologica | 351-033-721EA | |
| magnetico ancorette | Fisher Scientific | 14-513-56 | Il numero di catalogo dipenderà dalle dimensioni dell'ancoretta di ancorazione. |
| micromanipolatore | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipolatore (manuale) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscopio | Olympus | BX51WI | |
| microspatola | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Amplificatore di microelettrodi Dispositivi | molecolari | MULTICLAMP 700B | Il MultiClamp 700B deve includere headstage, portapipette e una cella modello. |
| N-(2-idrossietil)piperazina-N′-(acido 2-etansolfonico), (HEPES) | Ago Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| (20 gauge, 1,5 di lunghezza) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| filamento di nylon | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | misura 0,004. Questo gatto. # proviene da Amazon.com |
| rete di nylon | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| pompa perstaltica | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Fosfocreatina di(tris) sale | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| portapipette | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| filo di platino | World Precision | PT0203 | |
| filamento di acido polilattico (PLA) | Ultimaker | RAL 9010 | |
| cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| gluconato di potassio | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| idrossido di potassio | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| lamette da barba | VWR | 55411-050 | |
| morsetto a rullo | Mondo Precision Instruments | scala 14041 | |
| Mettler Toledo | PM2000 | ||
| manico per bisturi | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| arpa a fette | Warner | SHD-26GH/2 | |
| bicarbonato di sodio | Fisher Chemical | S233-500 | |
| cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| fosfato di sodio monobasico anidro | Fisher Chemical | S369-500 | |
| piruvato di sodio | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatola | VWR | 82027-520 | |
| spatola/cucchiaio, grande | VWR | 470149-442 | |
| lame di bisturi sterili | Feather | 72044-10 | |
| agitatore / piastra riscaldante | Corning | 6795-220 | |
| valvole di arresto, 1 via | World Precision Instruments | 14054 | |
| valvole di arresto, 3 vie | World Precision Instruments | 14036 | |
| saccarosio | Acros Organics | ||
| supporto per morsetti girevoli Fisher | Scientific | 14-679Q | |
| forbici chirurgiche, affilate/smussate | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| siringa (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| siringa (60 mL con punta Luer-Lok) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| pinza a tre punte | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| pinza per tessuti, grande | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| , piccola | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| pipette di trasferimento | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubo | Tygon | E-3603 | ID 1/16 di pollice, OD 3/16 di pollice |
| tubo | Tygon | R-3603 | ID 1/8 di pollice, OD 1/4 di pollice |
| grasso per vuoto | Dow Corning | 14-635-5D | |
| microtomo a lama vibrante | Leica | VT 1200S | |
| Tavolo antivibrante con gabbia di Faraday | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| matraccio tarato (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| bagno d'acqua calda | VWR | 1209 |
Riferimenti
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
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Ristampe e permessi
