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Articolo metodologico

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

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DOI:

10.3791/61704

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28 agosto 2020

1Department of Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Abstract

L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.

Introduzione

La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.

La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellulare1,2,3,4,5. I metodi delle fette cerebrali sono stati sfruttati per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e di circuito alla base di queste oscillazioni della rete neuronale. ha dimostrato che i complessi a catena d'onda affilati (SWR) possono emergere spontaneamente in fette dell'ippocampo ventrale6,7. Studi successivi di più ricercatori hanno gradualmente chiarito molti aspetti degli SWR, tra cui il ruolo dei neuromodulatori nella regolazione dello stato di rete dell'ippocampo8,9,10 e i meccanismi sinaptici che guidano la riattivazione in vitro di insiemi neuronali precedentemente attivi durante il comportamento in vivo11. Gli esperimenti sulle fette cerebrali hanno anche fornito informazioni sull'oscillazione dell'intervallo gamma (30-100 Hz), un distinto stato della rete ippocampale che si ritiene supporti la codifica dellamemoria e richiami 12,13. Infine, riconoscendo il ruolo centrale dell'ippocampo e delle strutture associate nella fisiopatologia dell'epilessia del lobo temporale14,15, i ricercatori hanno utilizzato preparati a fette ippocampali per indagare la generazione e la propagazione dell'attività epileptiforme. carter et al. Successivamente, Karlócai et al.

Gli investigatori hanno sviluppato numerosi approcci a fette ippocampali che differiscono in modi chiave: (1) la regione dell'ippocampo contenuta nella fetta (dorsale, intermedia o ventrale); 2) la presenza o l'assenza di tessuti extraippocampali come la corteccia entorinale; (3) l'orientamento utilizzato per tagliare le fette (coronale, sagittale, orizzontale o obliquo); e (4) le condizioni in cui il tessuto viene mantenuto dopo l'affezione (immerso completamente in ACSF o tenuto all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umidificata ricca di carbogeni).

La scelta dell'approccio di affezione all'uso dovrebbe essere determinata dall'obiettivo sperimentale. Ad esempio, fette trasversali o coronali dell'ippocampo dorsale mantenute in condizioni sommerse sono state utilizzate in modo molto efficace per lo studio dei circuiti intraippocampali e della plasticità sinaptica18,19,20. Tuttavia, tali preparati non generano spontaneamente oscillazioni di rete così prontamente come fette dall'ippocampo ventrale21,22,23. Sebbene uno stato di attività persistente di CFA possa essere indotto dalla stimolazione tetanica in fette trasversali dall'ippocampo dorsale e ventrale24, gli SWR spontanei sono più facilmente osservati nelle fetteventrali 7,25.

Una distinzione fisiologica e anatomica intrinseca tra l'ippocampo dorsale e ventrale è supportata da studi eseguiti sia in vivo che in vitro26. Le registrazioni nei ratti rivelarono ritmi di theta fortemente coerenti in tutto l'ippocampo dorsale e intermedio, ma scarsa coerenza tra la regione ventrale e il resto dell'ippocampo27. Gli SWR in vivo si propagano prontamente tra l'ippocampo dorsale e intermedio, mentre gli SWR che hanno origine nell'ippocampo ventrale rimangono spessolocali 28. Le proiezioni associativa provenienti dai neuroni piramidali CA3 che risiedono nell'ippocampo dorsale e intermedio proiettano lunghe distanze lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo. Le proiezioni CA3 provenienti dalle regioni ventrali rimangono relativamente locali e quindi hanno meno probabilità di essere recise durante il processo diaffezione 29,30. Le fette ventrali possono quindi preservare meglio la rete ricorrente necessaria per generare sincronia della popolazione. La propensione delle fette ventrali a generare attività spontanee di rete in vitro può anche riflettere una maggiore eccitabilità intrinseca dei neuroni piramidali o un'inibizione GABAergica più debole nell'ippocampo ventrale rispetto alle regioni più dorsali31. Infatti, le fette ippocampali ventrali sono più suscettibili all'attività epileptiforme32,33. Così, molti studi di spontaneafisiologica 8,9,11,24 opatologica 16,34,35,36 oscillazioni di rete hanno tradizionalmente utilizzato un approccio di affettare orizzontale, a volte con un leggero angolo nella direzione fronto-occipitale, che produce fette di tessuto parallele al piano trasversale dell'ippocampo ventrale.

La connettività di rete è inevitabilmente influenzata dalla procedura di affettare il numero di celle nella sezione che verrà recisa. L'angolo e lo spessore della fetta e del tessuto trattenuti nella preparazione devono essere considerati per ottimizzare la connettività nei circuiti di interesse. Molti studi hanno utilizzato fette orizzontali combinate di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) per esplorare le interazioni tra le due strutture nel contesto di oscillazioni fisiologiche o patologiche della rete. ha eseguito due registrazioni dal sottocampo CA1 dell'ippocampo e dallo strato V della corteccia entorinale mediale per dimostrare la propagazione dell'attività SWR attraverso la fettaHEC 37. Molti studi sull'attività epileptiforme hanno utilizzato la preparazione della fetta HEC per indagare come le scariche epileptiformi si propagano attraverso la rete corticoippocampale16,35,36,38. È importante notare che la conservazione dell'anello corticoippocampale intatto non è un prerequisito per gli SWR spontanei, le scariche epileptiformi o le oscillazioni gamma; le oscillazioni di rete possono essere generate in fette trasversali dell'ippocampo dorsale o ventrale senza tessuti paraippocampaliattaccati 21,22,23, 25,39,40,41. Un fattore più importante per la generazione spontanea di oscillazioni di rete nelle fette ippocampali può essere lo spessore di ogni fetta, poiché una fetta più spessa (400-550 μm) conserverà una maggiore connettività nella rete ricorrente CA2/ CA321,22,25.

Sebbene siano state utilizzate fette orizzontali angolate di HEC (tagliate con un angolo di circa 12° nella direzione fronto-occipitale) per studiare la connettività funzionale dell'anello corticoippocampale11,16,34,35,42,tali preparati angolati non sono necessari per l'attività spontanea della rete43,44,45. Tuttavia, l'uso di un piano di affettare angolato consente allo sperimentatore di creare selettivamente fette che preservano al meglio le lamelle orientate trasversalmente dell'ippocampo ventrale o intermedio, a seconda che si applica un angolo verso il basso o verso l'alto (Figura 1). Questo approccio è concettualmente simile a quello usato da Papatheodoropoulos et al., 2002, che ha sezionato ogni ippocampo libero e poi ha usato un elicottero tissutale per creare fette trasversali lungo l'intero asse dorsale-ventrale21. Alla luce delle suddette distinzioni funzionali tra l'ippocampo ventrale e dorsale-intermedio, gli investigatori dovrebbero considerare l'origine anatomica delle fette quando progettano esperimenti o interpretano i risultati. L'uso di una rampa di agar durante la procedura di affettare è un modo semplice per produrre preferenzialmente fette dall'ippocampo intermedio o ventrale.

Le fette ippocampali possono essere mantenute in una camera sommersa (con il tessuto completamente immerso in ACSF), o in una camera in stile interfaccia (ad esempio, camera Oslo o Haas, con fette coperte solo da una sottile pellicola di mezzi fluenti). La manutenzione dell'interfaccia migliora l'ossigenazione del tessuto, che promuove la sopravvivenza neuronale e consente alti livelli sostenuti di attività internauronale. Tradizionalmente, le condizioni di registrazione sommerse utilizzano una portata ACSF più lenta che non fornisce un'adeguata ossigenazione dei tessuti per l'espressione stabile delle oscillazioni a livello di rete. Nelle fette ippocampali sommerse le oscillazioni gamma indotte da carbacholo si osservano transitoriamentesolo 46,47, mentre possono essere mantenute stabilmente nelle camere di registrazionedell'interfaccia 10,48,49. Come tale, molti studi di attività spontanea complessa in vitro si sono affidati a camere di registrazione dell'interfaccia per indagarei complessi di increspature a onde acuti6,7,8,9,10,25,37, oscillazioni gamma10,13e attività epileptiforme16,38,45,47.

In una camera di registrazione in stile sommerso, un obiettivo di microscopio ad immersione può essere utilizzato per visualizzare singole cellule e indirizzare selettivamente cellule dall'aspetto sano per le registrazioni. La preparazione sommersa consente anche un controllo fine sull'ambiente cellulare, poiché l'immersione facilita la rapida diffusione di farmaci o altri composti nel tessuto. Pertanto, una metodologia modificata in cui le oscillazioni di rete stabili vengono mantenute in condizioni sommerse rappresenta un potente approccio sperimentale. Questo approccio è esemplificato dal lavoro di Hájos et al., in cui le fette ippocampali si riprendono in una camera di tenuta semplificata in stile interfaccia per diverse ore prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa modificata con un'elevata portata di ACSF (~ 6 mL / min) per migliorare l'apportodi ossigeno al tessuto 12,48,49. In queste condizioni, alti livelli di attività internauron e oscillazioni spontanee stabili della rete possono essere mantenuti in una camera di registrazione sommersa. Questo approccio modificato consente agli investigatori di eseguire registrazioni di patch clamp a celle intere guidate visivamente e caratterizzare il contributo dei tipi di cellule morfologicamente identificati alle oscillazioni gamma indotte da carbacholo12. Gli SWR possono anche verificarsi spontaneamente in fette ippocampali sommerse con una portata veloce di ACSF11,48,49. ha dimostrato che le fette ippocampali che si sono riprese in una camera di interfaccia prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano in modo affidabile SWR spontanei, mentre le fette che si riprendevano immerse in un becher prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano risposte di campo evocate più piccole, livelli inferiori di correnti sinaptiche spontanee e solo molto raramente mostravano SWRspontanei 43. ha utilizzato questa metodologia migliorata per dimostrare il ruolo delle cellule del cesto che esprimono parvalbumina nella generazione di SWR spontanei44.

Il seguente protocollo presenta un metodo di affettare attraverso il quale i neuroni spontaneamente attivi nelle fette ippocampali orizzontali possono essere recuperati in condizioni di interfaccia e successivamente mantenuti in una camera di registrazione sommersa adatta a manipolazioni farmacologiche o optogenetiche e registrazioni visivamente guidate.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University (AC-AAAU9451).

1. Preparare soluzioni

  1. Preparare la soluzione di taglio del saccarosio per l'affezione, come descritto nella tabella 1.
    NOTA: Dopo aver preparato 1 L di soluzione di saccarosio, congelare una piccola quantità (circa 100-200 mL) in un vassoio di ghiaccio. Questi cubetti di ghiaccio di saccarosio congelati saranno miscelati in un liquame ghiacciato (vedere fase 4.3).
  2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la registrazione come descritto nella tabella 2.
  3. Preparare 1 M di NaCl per le pipette di stimolazione sciogliendo 0,05844 g di NaCl in 1 mL di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità.
    NOTA: La soluzione di taglio del saccarosio e l'ACSF devono essere preparati freschi per ogni esperimento.

2. Preparare la rampa di agar

  1. Preparare il 4% di agar (ad esempio, 2 g di agar in 50 mL di acqua) sciogliendo la polvere di agar in acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Scaldare la miscela in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire (circa 30-60 s). Versare l'agar fuso in uno stampo e lasciare raffreddare e solidificare a 4 °C in frigorifero a una pendenza di circa 12°.
    NOTA: Per uno stampo, è possibile utilizzare qualsiasi contenitore di vetro o plastica impostato ad angolo, con abbastanza agar fuso versato per formare una rampa di 4 cm di lunghezza e circa 0,8 cm di altezza.

3. Palcoe l'area di affezione

  1. Riempire un becher da 400 mL contenente una camera di recupero a fette con circa 250 mL di ACSF; posizionare in un bagno d'acqua riscaldato a 32 °C e iniziare a gorgogliare con carbogeno (95% gas ossigeno/ 5% gas di anidride carbonica).
    NOTA: Riempire il becher di recupero con un fluido sufficiente per posizionare la rete di nylon della camera di tenuta sulla superficie stessa della soluzione, in modo che le fette siano tenute all'interfaccia della miscela di soluzione calda e dell'aria(Figura 1). Posizionare piccoli pezzi di carta per lenti sulla rete di nylon. Le fette giaceranno sopra la carta dell'obiettivo, che può essere successivamente utilizzata per trasferire le fette singolarmente nella camera di registrazione (vedere il passaggio 6.6).
  2. Mettere un pallone con la soluzione di saccarosio in un secchio di ghiaccio per raffreddare e iniziare a gorgogliare con carbogeno.
    NOTA: Il becher di recupero e la soluzione di saccarosio devono essere riscaldati e refrigerati, rispettivamente, con gorgogliamento di carbogeno per almeno 30 minuti prima che il topo venga posto nella camera dell'isoflurane.
  3. Estrarre il vassoio dei cubetti di ghiaccio di soluzione di saccarosio prefabbroti e congelati dal congelatore e posizionare sulla panchina per scongelare parzialmente.
  4. Posizionare metà di una lama di rasoio pulita a doppio taglio nel microtomo e calibrare se necessario. Mettere da parte l'altra metà della lama del rasoio per l'uso durante la dissezione.
  5. Eseguire una linea di carbogeno e una sonda di temperatura nella camera di affezione e circondare di ghiaccio per raffreddare la camera.
  6. Preparare una panca o un tavolo pulito coperto da due cuscinetti assorbenti usa e getta. Disporre tutti gli strumenti di dissezione e tre pezzi di nastro da laboratorio sul pad sinistro, dove verrà eseguita la perfusione trascardica.
    NOTA: Gli strumenti di dissezione includono piccole forbici Bonn, forbici dissector, spatola / cucchiaio di grandi dimensioni, microspapla, bisturi con nuova lama, spatola, forbici chirurgiche affilate / smussate, grandi forcelle tissutali e piccoli fasci di tessuto (vedi Tabella dei materiali).
  7. Sull'altro cuscinetto assorbente a destra dell'area di perfusione, posizionare un pezzo circolare di carta da filtro nel coperchio di una piastra di Petri in vetro di 100 mm di diametro. Posizionare il fondo della piastra di Petri accanto al coperchio e posizionare una linea di carbogeno in entrambi i pezzi del piatto.
  8. Utilizzare una lama di rasoio o bisturi per tagliare una piccola rampa di agar (circa 4 cm lungo la superficie angolata, 0,8 cm di altezza, 2 cm di larghezza). Tagliare un pezzo della rampa dall'estremità alta e invertire per creare un blocco di supporto di agar. Utilizzare l'adesivo cianoacrilato per apporre la rampa dell'agar e il blocco di supporto sulla piattaforma di affettamento e mettere da parte.
    NOTA: Il blocco di supporto dell'agar aiuta a stabilizzare il cervello durante l'affettare e fornisce una superficie su cui sezionare i tessuti non necessari da ogni fetta (Figura 1).

4. Perfusione transcardica

  1. Sospendere una siringa di capacità di 60 ml come serbatoio per la soluzione di taglio del saccarosio a circa 18 pollici sopra il banco (ad esempio, utilizzando un morsetto girevole su tre assi su un palo verticale). Attaccare i tubi sul fondo del serbatoio, far scorrere il tubo attraverso un morsetto a rulli e collegare l'altra estremità del tubo a un ago pulito da 20 G.
  2. Riempire il serbatoio da 60 mL con circa 30 mL di soluzione di saccarosio refrigerato e dirigere una linea di carbogeno nel serbatoio del saccarosio per far bollire continuamente il perfusato.
    NOTA: Assicurarsi che il saccarosio flui attraverso il tubo e l'ago senza bolle intrappolate. La portata dovrebbe essere abbastanza veloce da avere un flusso costante e continuo di saccarosio gocciolante dall'ago.
  3. Utilizzando un frullatore, schiacciare e frullare il saccarosio congelato in un liquame ghiacciato e utilizzare la grande spatola / cucchiaio per distribuire il liquame.
    1. Posizionare una piccola quantità di liquame di saccarosio intorno ai bordi del coperchio della piastra di Petri di vetro. Aggiungere una piccola quantità di liquame di saccarosio sul fondo della piastra di Petri.
    2. Aggiungere circa 20-30 mL di liquame di saccarosio al serbatoio del fluido perfusione, mescolandolo bene con i 30 mL di saccarosio liquido refrigerato fino a quando il serbatoio non contiene una miscela di saccarosio molto freddo, prevalentemente liquido, con qualche soluzione congelata residuata.
  4. Posizionare il mouse in una camera collegata a un vaporizzatore di isoflurane. Con l'ossigeno che scorre a circa 2 L/min, ruotare il quadrante del vaporizzatore per fornire isoflurane a una concentrazione del 5% e avviare un timer.
    NOTA: Mantenere questo timer in corso per tutto il corso dell'affettare per valutare la velocità con cui vengono ottenute le fette. La procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile, in modo che l'affezione sia completa e che il tessuto si stia riprendendo nella camera di interfaccia entro 15-20 minuti dall'ingresso dell'animale nella camera isoflurana. Guarda il mouse per assicurarti che si ottiene uno stato di anestesia profonda. Dopo un minimo di 5 minuti, il mouse deve essere profondamente anestetizzato e non risponde ai dita dei piedi.
  5. Immediatamente prima di rimuovere il topo dalla camera dell'isoflurane, riempire il coperchio della piastra di Petri con soluzione di saccarosio refrigerato a una profondità di circa 3-5 mm e riempire il fondo della piastra di Petri con soluzione di saccarosio refrigerato a una profondità di circa 1,0 cm.
  6. Trasferire rapidamente il mouse sul pad assorbente sinistro e utilizzare i 3 pezzi di nastro per fissare gli arti anteriori e la coda. Eseguire un dito posteriore per assicurarsi che il mouse non risponde prima che vengano eseguite eventuali incisioni. Usando le grandi forcelle tissutali e le forbici chirurgiche, tende la pelle e fai un'incisione longitudinale dal fondo dello sterno alla parte superiore del torace. Usando le forcep tirare su sullo sterno e utilizzare le forbici per tagliare attraverso il diaframma.
    NOTA: Il posizionamento iniziale del mouse e le prime incisioni per severare il diaframma devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per garantire che il mouse non riprenda conoscenza. Per garantire un'adeguata profondità di anestesia durante tutta la procedura, un cono del naso può essere posizionato sul mouse per fornire isoflurane durante la perfusione.
  7. Utilizzare le forbici per tagliare la gabbia toracica su ciascun lato, tagliando in un grande movimento verso il punto in cui l'avaro incontra il corpo. Con le forcep, oscillare la parte anteriore della gabbia toracica via e verso la testa, quindi rimuoverla completamente con un taglio orizzontale usando le grandi forbici. Tenere il cuore in posizione utilizzando le pini grandi e inserire l'ago da perfusione da 20 G nel ventricolo sinistro. Una volta posizionato correttamente l'ago, il lato sinistro del cuore dovrebbe rapidamente impallidire poiché la soluzione di saccarosio refrigerato riempie il ventricolo.
  8. Utilizzare le piccole forbici sezionarie per tagliare nell'atrio destro e consentire al sangue di fluire fuori dal sistema circolatorio. Se le incisioni vengono eseguite correttamente, ci dovrebbero essere danni minimi al cuore e dovrebbe continuare a pompare durante la perfusione.
    NOTA: I pezzi arrotolati di carta velina possono essere utilizzati per eliminare sangue e soluzione di saccarosio dal cuore e mantenere la visibilità dell'ago perfusione durante la procedura.
  9. Assicurarsi che l'ago perfusione rimanga in posizione e non cada dal ventricolo sinistro. Con una corretta portata e posizionamento, il fegato inizierà a impallidire a un colore chiaro tan / beige con 20-30 s.
  10. Dopo 30-45 s, usa le grandi forbici per decapitare il topo. Tenendo la testa nella mano sinistra, spingere o sbucciare la pelle dal cranio. In un animale ben perfuso, il cranio dovrebbe essere molto pallido e il cervello dovrebbe apparire di un colore rosa molto chiaro (avvicinandosi al bianco) attraverso il cranio senza vasi sanguigni chiaramente visibili.

5. Estrarre il cervello e tagliare le fette

  1. Usando le piccole forbici Bonn, fai due tagli laterale attraverso il cranio verso la linea mediana nella parte anteriore del cranio, vicino agli occhi. Fai due tagli aggiuntivi su entrambi i lati della base del cranio.
  2. Trasferire la testa sul fondo della piastra di Petri di vetro dove dovrebbe essere per lo più immersa in una soluzione di saccarosio refrigerato. Usa le piccole forbici Bonn per ridurre la linea mediana lungo la lunghezza del cranio, tirando su con le forbici per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale sottostante. Usando le piccole fase tissutali, afferra saldamente ogni lato del cranio e oscillalo su e lontano dal cervello, come aprire un libro.
  3. Usa le dita della mano sinistra per tenere aperte le alette del cranio e inserire la microspapla sotto il cervello vicino ai bulbi olfattivi. Capovolgere il cervello dal cranio nel saccarosio e usare la microspatola per severare il tronco encefalico. Lavare il cervello per rimuovere sangue residuo, pelliccia o altri tessuti.
  4. Utilizzare la grande spatola / cucchiaio per trasferire il cervello sul coperchio della piastra di Petri di vetro. Con l'altra metà della lama del rasoio a doppio taglio precedentemente messa da parte, fare due tagli coronali per rimuovere prima il cervelletto e poi la porzione più anteriore del cervello, compresi i bulbi olfattivi (Figura 1).
  5. Applicare l'adesivo cianoacrilato sulla rampa dell'agar. Posizionare molto brevemente il cervello su un pezzo di carta da filtro asciutta utilizzando le grandi forcelle tissutali e quindi trasferirlo immediatamente sulla rampa dell'agar, posizionando la superficie ventrale del cervello sull'adesivo.
    NOTA: Per le fette dell'ippocampo intermedio, il cervello dovrebbe essere orientato con il anteriore rivolto verso l'alto la pendenza della rampa e il posteriore più vicino alla lama. Per fette dell'ippocampo ventrale, orientare il cervello con l'estremità anteriore puntata lungo la pendenza della rampa, con l'estremità posteriore nella parte superiore della rampa, più lontano dalla lama. In entrambi i casi, il cervello deve essere posizionato nella parte superiore della rampa, in modo che la superficie coronally-cut del cervello contatti il blocco di supporto dell'agar (Figura 1).
  6. Posizionare la piattaforma di affettamento con l'agar e il cervello nella camera di affezione del microtomo e immergersi completamente con la soluzione di saccarosio refrigerato. Utilizzare la grande spatola/cucchiaio per trasferire alcuni liquami di saccarosio alla camera, mescolando per sciogliere qualsiasi saccarosio congelato e far scendere rapidamente la temperatura della miscela a ~1-2 °C.
    NOTA: Guarda l'indicatore di temperatura durante l'affezione. Se la soluzione di saccarosio si riscalda sopra i 3 °C, aggiungere più liquami e mescolare per riportare la temperatura verso il basso.
  7. Tagliare le fette con uno spessore di 450 μm con la velocità del microtomo impostata su 0,07 mm/s. Man mano che ogni fetta viene liberata, utilizzare le piccole forze tissutali e un bisturi affilato per separare prima i due emisferi, quindi per tagliare il tessuto fino a quando la fetta non è costituita principalmente dalle regioni ippocampo e paraippocampale (Figura 1).
  8. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le fette singolarmente nella camera di recupero dell'interfaccia, assicurando che siano posizionate all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria con solo un menisco sottile di ACSF che copre le fette. Chiudere saldamente il coperchio della camera e lasciare che le fette si riprendano a 32 °C per 30 minuti.
  9. Dopo il recupero iniziale a 32 °C, portare la camera di recupero dell'interfaccia fuori dal bagno d'acqua e posizionare su un agitatore impostato a una velocità lenta in modo che la barra di agitazione magnetica promuova la circolazione dell'ACSF all'interno della camera. Lasciare raffreddare gradualmente a temperatura ambiente mentre le fette si riprendono per altri 90 minuti. Assicurarsi che la camera di recupero sia continuamente bollata con carbogeno e non permettere che grandi bolle vengano intrappolate sotto le fette.

6. Eseguire registrazioni del potenziale sul campo locale (LFP) dell'attività spontanea

  1. Prepararsi per le registrazioni LFP accendendo tutte le apparecchiature necessarie, tra cui il computer che esegue il software di acquisizione, il monitor collegato al computer, gli stimolatori, il micromanipolatore, il regolatore di temperatura, la sorgente luminosa del microscopio, la fotocamera collegata al microscopio, l'amplificatore al microelettrode, il digitalizzatore e la pompa peristaltica. Se si utilizza un sistema di vuoto centrale, aprire la valvola a parete per preparare la linea del vuoto che rimuoverà ACSF dalla camera di registrazione.
  2. Riempire il serbatoio riscaldato con ACSF, quindi posizionare un'estremità del tubo nel becher da 400 mL contenente l'ACSF gorgogliante. Accendere la pompa peristaltica per dirigere L'ACSF dal becher da 400 mL al serbatoio riscaldato e dal serbatoio in poi alla camera di registrazione. Toccare o pizzicare il tubo per rilasciare eventuali bolle intrappolate.
  3. Regolare la pompa peristaltica per assicurarsi che la portata ACSF attraverso la camera di registrazione sia veloce (~ 8-10 mL/min). Utilizzare una sonda di temperatura per assicurarsi che l'ACSF sia a 32 °C al centro della camera di registrazione.
    NOTA: Se L'ACSF viene consegnato alla camera di registrazione utilizzando una pompa peristaltica, un'elevata portata può comportare una fluttuazione significativa della portata. Le portate costanti possono essere ottenute utilizzando un semplice smorzatore di pulsazione costituito da una serie di siringhe vuote integrate nei tubi (Figura 2).
  4. Preparare la stimolazione e la registrazione delle pipette dai capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di filamento riscaldato. Il protocollo estrattore deve essere configurato per produrre pipette con una resistenza di 2-3 MOhm per la stimolazione o potenziali elettrodi di registrazione del campo locale.
  5. Riempire le pipette di stimolazione con pipette 1 M NaCl e LFP con ACSF.
  6. Bloccare brevemente il tubo e spegnere la pompa per sospendere il flusso di ACSF. Trasferire una fetta nella camera di registrazione utilizzando forcep fini per afferrare un angolo della carta dell'obiettivo su cui si appoggia la fetta- la fetta si attacca alla carta dell'obiettivo. Posizionare la carta dell'obiettivo e affettare nella camera di registrazione con la fetta rivolta verso il basso, quindi "sbucciare" la carta dell'obiettivo lasciando la fetta immersa nella camera di registrazione. Fissare la fetta con un'arpa.
    NOTA: Le arpe possono essere acquistate prefatti o realizzati in laboratorio utilizzando un pezzo di acciaio inossidabile a forma di U o filamento di platino e nylon fine.
  7. Posizionare una pipetta di stimolazione riempita di NaCl nel micromanipolatore manuale e avanzare lentamente la punta della pipetta nella superficie della fetta (ad esempio, nello strato di radiorato dello strato) con un angolo di circa 30-45°. Una volta che la punta della pipetta entra nel tessuto, avanzare lentamente la pipetta in avanti e astenersi da grandi movimenti nella direzione laterale o verticale che potrebbero danneggiare inutilmente gli assoni all'interno della fetta. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare cellule vicino alla superficie danneggiate durante l'affettare.
  8. Posizionare una pipetta LFP riempita con ACSF nel supporto della pipetta attaccato al micromanipolatore motorizzato. Applicare una pressione positiva molto leggera utilizzando la pressione della bocca o una siringa da 1 ml collegata tramite una valvola di arresto e una breve lunghezza di tubi sul supporto della pipetta.
    NOTA: Posizionare le pipette LFP all'interno della fetta per registrare i segnali di interesse: in caso di increspature d'onda affilate, una pipetta LFP deve essere posizionata nello strato pyramidale (SP) e una seconda pipetta nel radiatum dello strato (SR). Questa configurazione consente registrazioni simultanee dell'onda acuta negativa nella SR e dell'oscillazione a increspatura ad alta frequenza nell'SP (Figura 3).
  9. L'uso del micromanipolatore avanza lentamente la punta della pipetta LFP nella regione di interesse (ad esempio, lo strato cellulare piramidale CA1) con un angolo di circa 30-45°. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare cellule vicino alla superficie danneggiate durante l'affettare. Durante l'avanzamento della pipetta LFP, fornire continuamente un piccolo impulso di prova di tensione utilizzando il software di acquisizione e guardare per un improvviso aumento della resistenza agli elettrodi. Ciò può indicare che la pipetta è stata ostruito o premuto contro una cella.
  10. Una volta posizionata la pipetta LFP nella regione di interesse, rilasciare con cura la pressione positiva aprendo la valvola sul tubo attaccato al supporto della pipetta.
  11. Per registrare l'LFP in una seconda posizione contemporaneamente, ripetere i passaggi 6.8–6.10 con una seconda pipetta e micromanipolatore.
  12. Utilizzare l'amplificatore a microelettrodi nella configurazione del morsetto di corrente per registrare l'attività spontanea nel potenziale di campo locale dopo aver utilizzato la funzione di bilanciamento del ponte nel software di acquisizione per correggere la resistenza in serie della pipetta. Gli SWR spontanei appariranno come deviazioni positive nel potenziale extracellulare dello strato SP (Figura 3).
  13. Per registrare i potenziali di campo evocati, utilizzare gli stimolatori collegati al digitalizzatore per fornire un breve impulso di tensione quadrata (200 us) attraverso la pipetta di stimolazione riempita di NaCl. Regolare il quadrante della tensione di stimolazione per evocare una gamma di ampiezze di risposta.

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Risultati

Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher d...

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Discussione

Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazioni...

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Dichiarazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

L'autore desidera ringraziare Steve Siegelbaum per il supporto. I finanziamenti sono forniti da 5R01NS106983-02 e 1 F31 NS113466-01.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stampante 3DLulzbotLulzBot TAZ 6
Supporto per incubazione di fette di cervello acutoNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Progettato da ChiaMing Lee, disponibile all'indirizzo
https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 Adenosina 5′-trifosfato sale di magnesioSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl pellet macinatoWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
acido ascorbicoAlfa Aesar36237
becher (250 mL)Kimax14000-250
becher (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
frullatoreOsterBRLY07-B00-NP0
Forbici Bonn,Dickinson14184-09
con filamento (D.E. 1,5 mm, D.I. 0,86 mm, lunghezza 10 cm)preferibili i capillari SutterInstrumentsBF150-86-10HP
soluzione di cloruro di calcio (1 M)G-BiosciencesR040
fotocameraOlympusOLY-150
gas carbogeno compresso (95% ossigeno / 5% anidride carbonica)AirgasX02OX95C2003102
ossigeno compressoAirgasOX 200
stimolatore isolato a tensione costanteDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
vetrini coprioggetti (22x50 mm)VWR16004-314
adesivo cianoacrilatoKrazy GlueKG925Utilizzare idealmente la forma a pennello per il
software di acquisizione datiAxographN/A Qualsiasisoftware equivalente (ad es. pClamp) funzionerebbe.
Workstation tower Dell Precision T1500 DesktopDellN/AIl numero di catalogo dipende dal computer specifico: qualsiasi computer funziona purché sia in grado di eseguire il software di acquisizione elettrofisiologica.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
timer digitaleVWR62344-641timer tracciabile a 4 canali
tamponi assorbenti usa e gettaVWR56616-018
forbici per dissettoreFine Science Tools14082-09
lame di rasoio a doppio taglioPersonnaBP9020
doppio automatico regolatore di temperaturaWarner Instrument CorporationTC-344B
camera di registrazione ottimizzata a doppia superficie o a flusso laminareN/AN/ALa camera presentata in questo protocollo è realizzata su misura. Un equivalente commerciale sarebbe l'RC-27L della Warner Instruments.
rack per attrezzatureAutomate ScientificFR-EQ70"Un rack non è strettamente necessario ma utile per organizzare l'elettrofisiologia
Glicole etilenico-bis(2-amminoetietere)- N,N,N',N'-acido teetraacetico (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
carta da filtroWhatman1004 070
scala fineMettler ToledoXS204DR
Estrattore per micropipette fiammante/marroneSutter InstrumentsP-97
piastra di Petri in vetro (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucosioFisher ScientificD16-1
Guanosina 5′-trifosfato sale sodico idratoSigma AldrichG8877-250MG
secchielli per ghiaccioSigma AldrichBAM168072002-1EA
isofluranoServizi di anestesia generaleTec 3
nastro da laboratorioFisher Scientific15-901-10R
carta per lentiFisher Scientific11-996
sorgente luminosaOlympusTH4-100
soluzione di cloruro di magnesio (1 M)Qualità biologica351-033-721EA
magnetico ancoretteFisher Scientific14-513-56Il numero di catalogo dipenderà dalle dimensioni dell'ancoretta di ancorazione.
micromanipolatoreLuigs & NeumannSM-5
micromanipolatore (manuale)ScientificaLBM-2000-00
microscopioOlympusBX51WI
microspatolaFine Science Tools10089-11
monitorDell2007FPb
MultiClamp 700B Amplificatore di microelettrodi DispositivimolecolariMULTICLAMP 700BIl MultiClamp 700B deve includere headstage, portapipette e una cella modello.
N-(2-idrossietil)piperazina-N′-(acido 2-etansolfonico), (HEPES)Ago Sigma AldrichH3375-25G
(20 gauge, 1,5 di lunghezza)Becton, Dickinson305176
filamento di nylonYLI Wonder Invisible Thread212-15-004misura 0,004. Questo gatto. # proviene da Amazon.com
rete di nylonWarner Instruments Corporation64-0198
pompa perstalticaHarvard Apparatus70-2027
Fosfocreatina di(tris) saleSigma AldrichP1937-1G
portapipetteMolecular Devices1-HL-U
filo di platinoWorld PrecisionPT0203
filamento di acido polilattico (PLA)UltimakerRAL 9010
cloruro di potassioSigma AldrichP3911-500G
gluconato di potassioSigma Aldrich1550001-200MG
idrossido di potassioSigma Aldrich60377-1KG
lamette da barbaVWR55411-050
morsetto a rulloMondo Precision Instrumentsscala 14041
Mettler ToledoPM2000
manico per bisturiFine Science Tools10004-13
arpa a fetteWarnerSHD-26GH/2
bicarbonato di sodioFisher ChemicalS233-500
cloruro di sodioSigma AldrichS9888-1KG
fosfato di sodio monobasico anidroFisher ChemicalS369-500
piruvato di sodioFisher ChemicalBP356-100
spatolaVWR82027-520
spatola/cucchiaio, grandeVWR470149-442
lame di bisturi steriliFeather72044-10
agitatore / piastra riscaldanteCorning6795-220
valvole di arresto, 1 viaWorld Precision Instruments14054
valvole di arresto, 3 vieWorld Precision Instruments14036
saccarosioAcros Organics
supporto per morsetti girevoli FisherScientific14-679Q
forbici chirurgiche, affilate/smussateFine Science Tools14001-12
siringa (1 mL)Becton, Dickinson309659
siringa (60 mL con punta Luer-Lok)Becton, Dickinson309653
pinza a tre punteFisher Scientific05-769-8Q
pinza per tessuti, grandeFine Science Tools11021-15
, piccolaFine Science Tools11023-10
pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-7M
tuboTygonE-3603ID 1/16 di pollice, OD 3/16 di pollice
tuboTygonR-3603ID 1/8 di pollice, OD 1/4 di pollice
grasso per vuotoDow Corning14-635-5D
microtomo a lama vibranteLeicaVT 1200S
Tavolo antivibrante con gabbia di FaradayMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
matraccio tarato (1 L)KimaxKIM-28014-1000
(2 L)PYREX65640-2000
bagno d'acqua caldaVWR1209
 
becton piccolo, capillari in vetro borosilicato Sono lucidati a fuoco. di precisione vaporizzatore di AC177142500 pinza per tessuti Pallone volumetrico

Riferimenti

  1. Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
  2. Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
  3. Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
  4. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
  5. Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073(2015).
  6. Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
  7. Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
  8. ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
  9. ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
  10. Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
  11. Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
  12. Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
  13. Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
  14. Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
  15. Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
  16. Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
  17. Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
  18. Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
  19. Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
  20. Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
  21. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
  22. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
  23. Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
  24. Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
  25. Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
  26. Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
  27. Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
  28. Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
  29. Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
  30. Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
  31. Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
  32. Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
  33. Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
  34. Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
  35. Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
  36. Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
  37. Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
  38. Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
  39. Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
  40. Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
  41. Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
  42. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
  43. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925(2009).
  44. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
  45. McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
  46. McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
  47. Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
  48. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
  49. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
  50. Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
  51. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
  52. Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
  53. Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).

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