Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Abstract

L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è una tecnica molecolare che identifica la presenza e la distribuzione spaziale di specifici trascritti di RNA all'interno delle cellule. La fenotipizzazione neurochimica di neuroni funzionalmente identificati di solito richiede la marcatura simultanea con più anticorpi (proteina bersaglio) utilizzando l'immunoistochimica (IHC) e l'ottimizzazione dell'ibridazione in situ (RNA mirato), in tandem. Una "firma neurochimica" per caratterizzare particolari neuroni può essere raggiunta, tuttavia i fattori di complicazione includono la necessità di verificare i bersagli FISH e IHC prima di combinare i metodi e il numero limitato di RNA e proteine che possono essere presi di mira simultaneamente all'interno della stessa sezione di tessuto.

Qui descriviamo un protocollo, che utilizza sia preparazioni cerebrali di topo fresche congelate che fisse, che rileva più mRNA e proteine nella stessa sezione cerebrale utilizzando RNAscope FISH seguito da immunocolorazione a fluorescenza, rispettivamente. Utilizziamo il metodo combinato per descrivere il pattern di espressione di mRNA a bassa abbondanza (ad esempio, il recettore 1 della galanina) e mRNA ad alta abbondanza (ad esempio, il trasportatore della glicina 2), nei nuclei del tronco encefalico identificati immunoistochimicamente.

Le considerazioni chiave per l'etichettatura delle proteine a valle del test FISH vanno oltre la preparazione dei tessuti e l'ottimizzazione dell'etichettatura della sonda FISH. Ad esempio, abbiamo scoperto che la specificità del legame e dell'etichettatura degli anticorpi può essere influenzata negativamente dalla fase della proteasi all'interno del test della sonda FISH. Le proteasi catalizzano la scissione idrolitica dei legami peptidici, facilitando l'ingresso della sonda FISH nelle cellule, tuttavia possono anche digerire la proteina bersaglio dal successivo saggio IHC, producendo un legame fuori bersaglio. La posizione subcellulare della proteina bersaglio è un altro fattore che contribuisce al successo dell'IHC dopo il saggio della sonda FISH. Abbiamo osservato che la specificità dell'IHC viene mantenuta quando la proteina bersaglio è legata alla membrana, mentre l'IHC che prende di mira la proteina citoplasmatica ha richiesto un'ampia risoluzione dei problemi. Infine, abbiamo riscontrato che la manipolazione del tessuto congelato fisso montato su vetrino è più impegnativa rispetto al tessuto congelato fresco, tuttavia la qualità dell'IHC è risultata complessivamente migliore con il tessuto congelato fisso, quando combinato con l'RNAscope.

Introduction

Le proteine e gli mRNA che definiscono neurochimicamente le sottopopolazioni di neuroni sono comunemente identificati rispettivamente con una combinazione di immunoistochimica (IHC) e/o ibridazione in situ (ISH). La combinazione di ISH con tecniche IHC facilita la caratterizzazione di modelli di colocalizzazione unici per i neuroni funzionali (codifica neurochimica) massimizzando la capacità di marcatura multiplex.

I metodi ISH fluorescenti (FISH), incluso l'RNAscope, hanno una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai precedenti metodi di rilevamento dell'RNA come l'ISH radioattivo e l'ISH cromogenico non radioattivo. La FISH....

Protocol

Un riepilogo delle fasi di pre-trattamento dei tessuti è riportato nella Figura 1. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con l'Animal Care and Ethics Committee dell'Università del New South Wales in conformità con le linee guida per l'uso e la cura degli animali a fini scientifici (Australian National Health and Medical Research Council).

1. Preparazione del campione di tessuto cerebrale fresco congelato

1. Perfusione transcardica
   1. Preparare tampone fosfato eparinizzato (2500 U/L) 0,1 M (PB), pH 7,5. Prepara l'impasto di etanolo con ghiaccio secco mescolando ghiaccio secco con etanol....

Results

Qui, delineiamo un metodo per combinare FISH multiplex con IHC fluorescente per localizzare l'espressione di mRNA per GalR1 e GlyT2 utilizzando tessuti congelati freschi e fissati con paraformaldeide rispettivamente nell'NTS di topo. Una pipeline delle procedure di trattamento dei tessuti, FISH e IHC descritte nei metodi è mostrata nella Figura 1 e nella Figura 2. La Tabella 1 fornisce un riepilogo delle combinazioni di sonde e anticorpi FISH ut.......

Discussion

Nelle neuroscienze, FISH e IHC sono abitualmente utilizzati per studiare l'organizzazione spaziale e il significato funzionale dell'mRNA o delle proteine all'interno delle sottopopolazioni neuronali. Il protocollo descritto in questo studio migliora la capacità di rilevamento simultaneo di mRNA e proteine nelle sezioni cerebrali. Il nostro saggio combinato multiplex FISH-IHC ha permesso l'identificazione fenotipica di sottopopolazioni neuronali distinte nell'NTS sia in preparazioni cerebrali fresche congelate che fisse. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
C57BL/6 topo	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP topo	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate	Loctite
Glicole etilenico	Sigma-Aldrich	324558
Eparina-Sodica	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Consultare il fornitore veterinario locale o la farmacia.
Lethabarb (Pentabarbitolo di sodio) Eutanasia Iniezione	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	Consultare un veterinario per le normative farmaceutiche locali relative al Pentabarbitolo di sodio
Polvere di agarosio di grado molecolare	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldeide, prilled, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polivinilpirrolidone, massa media in peso 40.000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	Con o senza DAPI
RNAscope Kit di reagenti fluorescenti multiplex (capacità fino a 3 plex)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Include 50x tampone di lavaggio e proteasi III
RNasi via	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(idrossimetile)aminometano	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, per biologia molecolare	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Incubatore da banco	Micro incubatore scientifico Thermoline	Modello: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Ago da disegno (calibro da 23 pollici)	BD	0288U07
Penna barriera idrofobica	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Salviette per attività delicate	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Pompa	peristalticaColeparmer Masterflex	serie L/S
Fotocamera digitale Retiga 2000R	QImaging	RET-2000R-F-CLR	fotocamera a colori
SuperFrost Plus vetrini (bianco)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Microtomo vibrante (vibratomo)	Carta
Whatman, grado 1, diametro 110 mm	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Versione 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public License (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ per la prossima generazione di dati di immagini scientifiche", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    e Figi: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: una piattaforma open source per l'analisi delle immagini biologiche", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
ANTICORPI PRIMARI
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi	Millipore Sigma	AB1542	Policlonale di pecora (diluizione 1:1000), RRID:
AB_90755 Anticorpo anti-tirosina idrossilasi, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Monoclonale di topo (diluizione 1:1000), RRID:
AB_2201528 Anticorpo anti-trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAchT)	Sigma-Aldrich	ABN100	Policlonale di capra (diluizione 1:1000), RRID: AB_2630394
GFP Antibody	Novus Biologicals	NB600-308	Policlonale di coniglio (diluizione 1:1000), RRID:
AB_10003058 Phox2b Antibody (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Monoclonale di topo (diluizione 1:1000), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Asino anti-Coniglio (diluizione 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey anti-Sheep (diluizione 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Jackson	ImmunoResearch	705-175-147	Donkey anti-Goat (diluizione 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey anti-Mouse (diluizione 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Donkey anti-Sheep (diluizione 1:400), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probebe	ACDBio	448821-C1	targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probes	ACDBio	409741-C3	bersaglia bp 925 - 2153 (Rif. banca genetica: NM_148931.3)
Sonda oligonucleotidica Phox2b	ACDBio	407861-C2	bersaglia bp 1617 - 2790 (Rif. banca genetica: NM_008888.3)