Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Summary

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.

Abstract

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri offre soluzioni efficienti per studiare processi complessi su più scale biologicamente rilevanti. Le configurazioni basate su camera campione, che sono specificamente progettate per preservare l'integrità tridimensionale del campione e di solito presentano la rotazione del campione, sono la scelta migliore nella biologia dello sviluppo. Ad esempio, sono stati utilizzati per documentare l'intera morfogenesi embrionale della mosca della frutta Drosophila melanogaster e dello scarabeo di farina rossa Tribolium castaneum. Tuttavia, molti protocolli di imaging dal vivo disponibili forniscono solo framework sperimentali per singoli embrioni. Soprattutto per gli studi comparativi, tali approcci sono scomodi, poiché i campioni di immagine sequenziale sono influenzati dalla varianza ambientale. Inoltre, questo limita il numero di campioni che possono essere saggiati entro un dato tempo. Forniamo un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo che aumenta la velocità effettiva nelle configurazioni basate su camera campione e quindi garantisce condizioni ambientali simili per tutti i campioni. In primo luogo, forniamo una linea guida di calibrazione per i microscopi a fluorescenza a fogli leggeri. In secondo luogo, proponiamo un metodo di montaggio per più embrioni compatibile con la rotazione del campione. In terzo luogo, forniamo set di dati tridimensionali esemplari di imaging vivo di Drosophila, per i quali giustappongiamo tre linee transgeniche con nuclei etichettati fluorescentmente, così come di Tribolium, per i quali confrontiamo le prestazioni di tre sottolinee transgeniche che trasportano la stessa transgenica, ma in diverse posizioni genomiche. Il nostro protocollo è specificamente progettato per studi comparativi in quanto affronta in modo pro-attivo la varianza ambientale, che è sempre presente nell'imaging dal vivo sequenziale. Ciò è particolarmente importante per le analisi quantitative e la caratterizzazione dei fenotipi aberrazione, che derivano ad esempio da esperimenti ad eliminazione diretta. Inoltre, aumenta la produttività complessiva, che è molto conveniente quando l'accesso ai microscopi a fluorescenza a fogli leggeri è limitato. Infine, il metodo di montaggio proposto può essere adattato ad altre specie di insetti e ad altri organismi modello, ad esempio il pesce zebra, senza praticamente alcuno sforzo di ottimizzazione.

Introduction

La microscopia a fluorescenza è una delle tecniche di imaging più essenziali nelle scienze della vita, specialmente nella biologia cellulare e dello sviluppo. Nei microscopi a fluorescenza confocale¹, che sono all'avanguardia per l'imaging tridimensionale a fluorescenza dalla metà degli anni '90, la stessa lente viene utilizzata per l'eccitazione del fluorofore e il rilevamento della luce di emissione. Il raggio laser di illuminazione eccita tutti i fluorofori lungo l'asse di illuminazione/rilevamento e il rispettivo segnale fuori fuoco viene discriminato prima del rilevamento da parte di un foro stenopeico. Quindi, per ogni immagine bidimensio....

Protocol

1. Lavori preparatori

1. Scegli una combinazione obiettivo di illuminazione/obiettivo di rilevamento/fotocamera per l'LSFM che si adatta alla domanda scientifica e imposta il microscopio. La dimensione del campo visivo è il quoziente della dimensione del chip della fotocamera e l'ingrandimento dell'obiettivo di rilevamento. L'obiettivo di illuminazione deve essere scelto in modo che l'intero campo visivo sia coperto da una scheda luminosa approssimativamente planare³⁴. Nella tabella 1 sono elencate tre combinazioni consigliate.
2. Per preparare aliquote di agarosio e piatti di recupero, aggiungere 2 g di agarosio ....

Results

Il nostro protocollo descrive un quadro sperimentale per l'imaging dal vivo a fluorescenza comparativa negli LSFM basati su camera campione. Ad esempio, la struttura può essere utilizzata per giustapporsi (i) embrioni di due o più specie, (ii) embrioni di linee in cui uno o più geni sono eliminati più controlli di tipo selvaggio, (iii) embrioni multipli della stessa linea transgenica, (iv) embrioni da diverse linee transgeniche, o (v) embrioni da sottolinee che trasportano la stessa transgenica , ma in diverse località g.......

Discussion

Una delle aree di applicazione esclusive degli LSFM è la biologia dello sviluppo. In questa disciplina, è importante guardare gli esemplari viventi, altrimenti i processi morfogenetici non possono essere descritti in modo dinamico. Un quadro sperimentale per l'imaging live simultaneo negli LSFM a camera campione, come descritto qui, è conveniente per due motivi principali.

La varianza ambientale, che è inevitabile nell'imaging dal vivo sequenziale, può essere affrontata pro-attivamente. Nell'i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastra a 6 pozzetti	Orange Scientific	4430500	piastra
24 pozzetti	Orange Scientific	4430300	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
35 mm Ø Piastra di Petri	Fisher Scientific	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Drosophila.
90 mm Ø piastra Petri	Fisher Scientific	L9004575
100 µ filtro cellulare con dimensioni di maglia m	BD Biosciences	352360
250 µ setaccio a maglie m	VWR International	200.025.222-038	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
300 &; setaccio a maglie m	VWR International	200.025.222-040	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
710 µ setaccio a maglie m	VWR International	200.025.222-050	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
800 &; m dimensione delle maglie setaccio	VWR International	200.025.222-051	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
405 farina di grano fino	Demeter e.V.	SP061006	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium
commercialmente disponibile Terreno di coltura	Genesee Scientific	66-115	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Drosophila / Su misura Drosophila possono essere utilizzate anche
microsfere fluorescenti, 1.0 &; m Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
lievito secco inattivo	Genesee Scientific	62-108
agarosio a basso punto di fusione	Carl Roth	6351.2
fiale strette	Genesee Scientific	32-109	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Drosophila
small	pennello VWR International	149-2121
ipoclorito di sodio (NaOCl), ~12% attivo Cl	Carl Roth	9062.3	Attenzione: l'ipoclorito di sodio è corrosivo
farina integrale	Demeter e.V.	SP061036	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Tribolium / Regno Unito:
fiale larghe	Genesee Scientific	32-110	Solo per l'imaging dal vivo che coinvolge Drosophila