Selezione assistita di biomarcatori mediante LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size) nei dati del microbioma

Summary

LEfSe (LDA Effect Size) è uno strumento per l'estrazione di biomarcatori ad alta dimensione per identificare caratteristiche genomiche (come geni, percorsi e tassonomie) che caratterizzano in modo significativo due o più gruppi nei dati del microbioma.

Abstract

C'è una crescente attenzione verso i genomi biologici chiusi nell'ambiente e nella salute. Per esplorare e rivelare le differenze tra i diversi campioni o ambienti, è fondamentale scoprire biomarcatori con differenze statistiche tra i gruppi. L'applicazione dell'analisi lineare discriminante Effect Size (LEfSe) può aiutare a trovare buoni biomarcatori. Sulla base dei dati del genoma originale, vengono effettuati il controllo di qualità e la quantificazione di diverse sequenze basate su taxa o geni. In primo luogo, il test di rango di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per distinguere tra differenze specifiche tra gruppi statistici e biologici. Quindi, è stato eseguito il test di rango di Wilcoxon tra i due gruppi ottenuti nella fase precedente per valutare se le differenze erano coerenti. Infine, è stata condotta un'analisi discriminante lineare (LDA) per valutare l'influenza dei biomarcatori su gruppi significativamente diversi in base ai punteggi LDA. Per riassumere, LEfSe ha fornito la comodità per identificare i biomarcatori genomici che caratterizzano le differenze statistiche tra i gruppi biologici.

Introduction

I biomarcatori sono caratteristiche biologiche che possono essere misurate e possono indicare alcuni fenomeni come infezioni, malattie o ambiente. Tra questi, i biomarcatori funzionali possono essere funzioni biologiche specifiche di singole specie o comuni ad alcune specie, come geni, proteine, metaboliti e percorsi. Inoltre, i biomarcatori tassonomici indicano una specie insolita, un gruppo di organismi (regno, phylum, classe, ordine, famiglia, genere, specie), l'Amplicon Sequence Varient (ASV)¹ o l'Operational Taxonomic Unit (OTU)². Per trovare i biomarcatori in modo più rapido e accurato, è necessario uno strumento per analizzare i dati biologici. Le differenze tra le classi possono essere spiegate da LEfSe abbinato a test standard per la significatività statistica e test aggiuntivi che codificano la coerenza biologica e la rilevanza dell'effetto³. LEfSe è disponibile come modulo galattico, formula conda, immagine docker e incluso in bioBakery (VM e cloud)⁴. Generalmente, l'analisi della diversità microbica utilizza spesso un test non parametrico per la distribuzione incerta di una comunità campione. Il test rank sum è un metodo di test non parametrico, che utilizza il rango dei campioni per sostituire il valore dei campioni. In base alla differenza dei gruppi di campioni, può essere diviso in due campioni con il test di somma di rango di Wilcoxon e in più campioni con il test di Kruskal-Wallis ^5,6. In particolare, quando ci sono differenze significative tra più gruppi di campioni, è necessario eseguire un test di rango di confronto a coppie di più campioni. LDA (che sta per Linear Discriminant Analysis) inventato da Ronald Fisher nel 1936, è un tipo di apprendimento supervisionato, noto anche come Fisher's Linear Discriminant⁷. È un algoritmo classico e popolare nell'attuale campo del data mining di machine learning.

Qui, il test LEfSe è stato ottimizzato dai server Conda e Galaxy. Tre gruppi di sequenze di geni rRNA 16S vengono analizzati per dimostrare le differenze significative tra i diversi gruppi con punteggi LDA di comunità microbiche e risultati di visualizzazione.

Protocol

NOTA: Il protocollo è stato originato e modificato dalla ricerca di Segata et ^al.3. Il metodo è fornito in https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse.

1. Preparazione del file di input per l'analisi

1. Preparare il file di input (Tabella 1) di LEfSe, che potrebbe essere facilmente generato da molti flussi di lavoro⁸ o protocolli precedenti⁹ con i file originali (file di esempio e file di annotazione delle specie corrispondenti).

2. Analisi nativa LEfSe (limitata al server Linux)

1. Installazione di LEfSe
   NOTA: si consiglia di installare la pipeline LEfSe con Conda¹⁰.
   1. Eseguire i comandi seguenti per escludere la possibilità di conflitti di dipendenze. Creare un ambiente conda per LEfSe (questo passaggio è consigliato ma non obbligatorio). -n sta per il nome dell'ambiente.
      $ conda create -n LEfSe-env
   2. Per attivare l'ambiente LEfSe creato, eseguire:
      $ source attiva LEfSe-env
   3. Per installare LEfSe con il canale bioBakery dove -c sta per nome canale, eseguire:
      $ conda install -c biobakery lefse
2. Formattare i dati per LEfSe
   1. Eseguire il comando seguente per formattare il file originale nel formato interno per LEfSe. Table.txt è il file di input e Table-reformat.in è il file di output. -c viene utilizzato per impostare la funzionalità, che viene utilizzata come classe (predefinito 1) e -o viene utilizzato per impostare il valore di normalizzazione (default -1.0 che significa nessuna normalizzazione).
      $ format_input.py Tabella.txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
3. Calcolo della dimensione dell'effetto di analisi discriminante lineare (LDA)
   1. Eseguire il comando seguente. Lo scopo di questo passaggio è eseguire LDA del risultato precedente e generare il file dei risultati per la visualizzazione. Table-reformat.in viene generato utilizzando il passaggio precedente e viene utilizzato come file di input in questo passaggio. Table-reformat.res è il file di risultato.
      $ run_lefse.py Table-reformat.in Tabella-reformat.res
4. Visualizzazione per grafici
   1. Traccia i risultati LEfSe. Per tracciare la dimensione dell'effetto dei biomarcatori in un file pdf,. Table-reformat.res viene generato utilizzando il passaggio precedente e LDA.pdf è il file di plottaggio. –format viene utilizzato per impostare il formato del file di output.
      $ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --formato pdf
   2. Traccia il cladogramma. Per disegnare l'albero delle specie e visualizzare i biomarcatori in un cladogramma. cladogram.pdf è il file di output.
      $ plot_cladogram.py Cladogramma Table-reformat.res.pdf --formato pdf
   3. Traccia una feature (opzionale) Tracciare le differenze di un singolo biomarcatore tra diversi gruppi. -f viene utilizzato per impostare le caratteristiche della trama. Se ne è stato impostato uno, deve essere dato il –feature_name.
      $ plot_features.py -f one --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --formato pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf
   4. Tracciate le feature differenziali (facoltative) per disegnare tutte le feature, ma c'è troppo da fare con cautela. --archive viene utilizzato per scegliere se comprimere i risultati. ./ indica il percorso dei risultati.
      $ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./

3. Analisi online LEfSe (galassia)

1. Vai al server galaxy huttenhower¹¹: http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
2. Carica i file. Premere il pulsante freccia SU nel riquadro di sinistra e caricare il file. Fare clic su Scegli file locale per selezionare il file di input e selezionare il formato tabulare, quindi fare clic sul pulsante Start .
   NOTA: fare riferimento alla pagina Web (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse), utilizzare lo script (taxonomy_summary. R) per generare il file di input di LEfSe, e il formato (ogni colonna con un nome di gruppo, ogni riga con un diverso livello di annotazione separata da "|") è richiesto come mostrato nella Tabella 1. Una panoramica schematica del processo di caricamento è illustrata nella Figura 1.
3. Formattare i dati per LEfSe. Clicca sul | LEfSe Formattare il collegamento Dati per LEfSe nel riquadro di sinistra e selezionare le righe specifiche per la classe nel file e fare clic sul pulsante Esegui . Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 2.
4. Calcola la dimensione dell'effetto LDA. Clicca sulla | LEfSe LDA Effect Size (LEfSe) nel riquadro di sinistra e selezionare i valori dei parametri in base ai requisiti di analisi. Fare clic su Esegui. Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 3.
5. Traccia i risultati LEfSe. Clicca sulla | LEfSe Traccia il collegamento Risultati LEfSe nel riquadro di sinistra e fai clic sul pulsante Esegui . Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 4.
6. Traccia il cladogramma. Fare clic su Plot Cladogram nel riquadro di sinistra e fare clic sul pulsante Esegui dopo aver selezionato i valori dei parametri. Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 5.
7. Tracciate una feature facendo clic su Stampa una feature nel riquadro sinistro e facendo clic sul pulsante Esegui dopo aver selezionato i valori dei parametri. Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 6.
8. Tracciate le feature differenziali facendo clic su Traccia feature differenziali (Plot Differential Features ) nel riquadro sinistro e facendo clic sul pulsante Esegui (Execute ) dopo aver selezionato i valori dei parametri. Una panoramica schematica del processo operativo e dei parametri utilizzati è illustrata nella Figura 7.
   NOTA: queste figure generate possono essere visualizzate e scaricate rispetto all'output risultante nel riquadro di destra.

Results

I punteggi LDA delle comunità microbiche con differenze significative in ciascun gruppo analizzando le sequenze del gene rRNA 16S di tre campioni sono mostrati nella Figura 8. Il colore dell'istogramma rappresenta diversi gruppi, mentre la lunghezza rappresenta il punteggio LDA, che è l'influenza della specie con differenze significative tra i diversi gruppi. L'istogramma mostra le specie con differenze significative il cui punteggio LDA è maggiore del valore preimpostato. Il valore predefin...

Discussion

Qui viene descritto il protocollo per l'identificazione e la caratterizzazione dei biomarcatori all'interno di diversi gruppi. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri tipi di campioni, come le OTU di microrganismi. Il metodo statistico di LEfSe può trovare i microrganismi caratteristici in ciascun gruppo (il default è LDA >2), cioè i microrganismi che sono più abbondanti in questo gruppo rispetto agli altri¹². LEfSe è disponibile sia in versione nativa che web Linux in cui gli ut...

Materials

List of materials used in this article

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Nessun materiale utilizzato