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Articolo metodologico

Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)

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DOI:

10.3791/61720

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27 ottobre 2020

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1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

In questo articolo

Sommario

A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.

Abstract

L'AMP ciclico è un secondo messaggero che è coinvolto in una vasta gamma di attività cellulari e fisiologiche. Diversi studi suggeriscono che i segnali cAMP sono compartimentati e che la compartimentazione contribuisce alla specificità della segnalazione all'interno della via di segnalazione cAMP. Lo sviluppo di biosensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET) ha favorito la capacità di misurare e visualizzare i segnali cAMP nelle cellule. Tuttavia, queste misurazioni sono spesso limitate a due dimensioni spaziali, il che può comportare un'interpretazione errata dei dati. Ad oggi, ci sono state solo misurazioni molto limitate dei segnali cAMP in tre dimensioni spaziali (x, y e z), a causa delle limitazioni tecniche nell'utilizzo dei sensori FRET che mostrano intrinsecamente un basso rapporto segnale/rumore (SNR). Inoltre, i tradizionali approcci di imaging basati su filtri sono spesso inefficaci per la misurazione accurata dei segnali cAMP nelle regioni subcellulari localizzate a causa di una serie di fattori, tra cui la diafonia spettrale, la potenza limitata del segnale e l'autofluorescenza. Per superare queste limitazioni e consentire l'utilizzo di biosensori basati su FRET con più fluorofori, abbiamo sviluppato approcci di imaging e analisi FRET iperspettrali che forniscono specificità spettrale per il calcolo delle efficienze FRET e la capacità di separare spettralmente i segnali FRET dall'autofluorescenza confondente e / o segnali da etichette fluorescenti aggiuntive. Qui, presentiamo la metodologia per l'implementazione dell'imaging FRET iperspettrale e la necessità di costruire una libreria spettrale appropriata che non sia né sottocampionata né sovracampionata per eseguire l'unmixing spettrale. Mentre presentiamo questa metodologia per la misurazione delle distribuzioni tridimensionali di cAMP nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC), questa metodologia potrebbe essere utilizzata per studiare le distribuzioni spaziali di cAMP in una gamma di tipi di cellule.

Introduzione

L'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è un secondo messaggero coinvolto nei principali processi cellulari e fisiologici tra cui la divisione cellulare, l'afflusso di calcio, la trascrizione genica e la trasduzione del segnale. Un numero crescente di prove suggerisce l'esistenza di compartimenti cAMP nella cellula attraverso i quali si raggiunge la specificità di segnalazione1,2,3,4,5,6,7. Fino a poco tempo fa, la compartimentazione cAMP era dedotta sulla base di distinti effetti fisiologici o cellulari indotti da diversi agonisti del recettore accoppiato G8,9,10,11. Più recentemente, le sonde di imaging a fluorescenza basate su FRET hanno fornito nuovi approcci per la misurazione diretta e l'osservazione dei segnali cAMP in una cella12,13,14.

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un fenomeno fisico in cui il trasferimento di energia avviene tra molecole donatrici e accettori in modo non radiativo quando le molecole sono in prossimità15,16. Con lo sviluppo di indicatori fluorescenti basati su FRET, questo fenomeno fisico è stato utilizzato in applicazioni biologiche per studiare le interazioni proteina-proteina17, co-localizzazione proteica18, Ca+2 segnalazione19, espressionegenica 20, divisione cellulare21 e segnalazione nucleotidica ciclica. Gli indicatori cAMP basati su FRET sono tipicamente costituiti da un dominio di legame cAMP, un fluoroforo donatore e un fluoroforo accettore22. Ad esempio, il sensore H188 cAMP12,22 utilizzato in questa metodologia è costituito da un dominio di legame cAMP ottenuto da Epac, inserito tra fluorofori Turchese (donatore) e Venere (accettore). In condizioni basali (non legate), Turchese e Venere sono in un orientamento tale che FRET si verifica tra i fluorofori. Al momento del legame di cAMP al dominio di legame, si verifica un cambiamento conformazionale tale che Turchese e Venere si allontanano con conseguente diminuzione di FRET.

Gli approcci di imaging basati su FRET offrono uno strumento promettente per indagare e visualizzare i segnali cAMP all'interno di una cellula. Tuttavia, le attuali tecniche di imaging microscopico basate su FRET hanno spesso solo parzialmente successo nel raggiungere una potenza del segnale sufficiente per misurare FRET con chiarezza spaziale subcellulare. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la limitata potenza del segnale di molti reporter FRET, l'alto livello di precisione richiesto per quantificare con precisione i cambiamenti nell'efficienza FRET e la presenza di fattori confondenti, come l'autofluorescenza cellulare23,24. Il risultato è spesso un'immagine FRET che è afflitta da SNR debole, rendendo molto difficile la visualizzazione dei cambiamenti subcellulari in FRET. Inoltre, lo studio dei segnali cAMP localizzati spazialmente è stato eseguito quasi esclusivamente in due sole dimensioni spaziali e la distribuzione assiale cAMP è stata raramenteconsiderata 25. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che un basso SNR ha impedito la capacità di misurare e visualizzare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali. Per superare i limiti dell'utilizzo di sensori FRET con basso SNR, abbiamo implementato approcci di imaging e analisi iperspettrali per misurare FRET in singole celle25,26,27.

Gli approcci di imaging iperspettrale sono stati sviluppati dalla NASA per differenziare gli oggetti terrestri presenti nelle immaginisatellitari28,29. Da allora queste tecniche sono state tradotte nel campo di microscopia a fluorescenza30, con diversi sistemi di microscopio confocale commerciali che offrono rivelatori spettrali. Nell'imaging a fluorescenza tradizionale (non spettrale), il campione viene eccitato utilizzando un filtro passa-banda o una linea laser e l'emissione viene raccolta utilizzando un secondo filtro passa-banda, spesso selezionato per corrispondere alla lunghezza d'onda di emissione di picco del fluoroforo (s). Al contrario, gli approcci di imaging iperspettrale cercano di campionare un profilo spettrale completo dell'emissione di fluorescenza26,31,32 o dell'eccitazione33,34 a specifici intervalli di lunghezza d'onda. Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che gli approcci di imaging e analisi iperspettrali possono offrire una migliore quantificazione dei segnali FRET nelle cellule rispetto alle tradizionali tecniche di imaging FRET basate su filtro26. Qui presentiamo una metodologia per l'esecuzione di imaging e analisi FRET iperspettrali 4-dimensionali (x, y, z e λ) per misurare e visualizzare le distribuzioni cAMP in tre dimensioni spaziali. Questi approcci hanno permesso la visualizzazione di gradienti spaziali cAMP indotti da agonisti in singole cellule25. È interessante notare che, a seconda dell'agonista, i gradienti cAMP possono essere evidenti nelle cellule. La metodologia qui presentata utilizza l'unmixing spettrale di fondo non uniforme e l'autofluorescenza cellulare per migliorare l'accuratezza delle misurazioni FRET. Mentre questa metodologia è dimostrata nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC) utilizzando un biosensore cAMP FRET, la metodologia potrebbe essere facilmente modificata per l'uso con reporter FRET alternativi o linee cellulari alternative.

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Protocollo

Questo protocollo segue le procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della University of South Alabama.

1. Preparazione di cellule, campioni e reagenti per l'imaging

  1. Isolare le cellule endoteliali microvascolari polmonari di ratto (PMVEC) come descritto in precedenza35.
    NOTA: Le cellule sono state isolate e coltivate dal Cell Culture Core presso la University of South Alabama, Mobile, AL su piatti di coltura cellulare da 100 mm.
  2. Semina PMVEC isolati su coperture di vetro rotonde da 25 mm e lasciale crescere nell'incubatrice a 37 °C fino a quando le cellule raggiungono almeno l'80% di confluenza (almeno 24 ore).
    NOTA: Le cellule e il tipo di cellula possono variare da studio a studio e quindi le procedure di coltura cellulare specifiche delle cellule devono essere seguite per seminare e far crescere le cellule. Il protocollo di semina e coltura cellulare utilizzato in questi studi è disponibile come informazione supplementare nel file denominato "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  3. Trasfettate le PMVEC con un biosensore FRET e incubate per 48 ore a 37 °C.
    NOTA: il protocollo per trasfezionare le PMVEC è descritto anche nel file di informazioni supplementari denominato "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  4. Il giorno dell'imaging, riscaldare il tampone di Tyrode a 37 °C a bagnomaria.
    NOTA: il tampone di Tyrode è costituito da 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucosio, 1 mM MgCl2 e 1 mM CaCl2
  5. Montare un coperchio contenente celle trasfettate in una camera cellulare e fissare la parte superiore con una guarnizione di montaggio per evitare perdite.
  6. Pulire il fondo della coverslip utilizzando una delicata pulizia per pulire eventuali supporti in eccesso o cellule aderenti.
  7. Aggiungere 800 μL di tampone di lavoro e 4 μL di etichetta nucleare da 5 mM alla camera cellulare e oscillare delicatamente per 5 – 10 secondi.
    NOTA: Quando si aggiungono soluzioni tampone o reagenti a coverslip montati nella camera cellulare, assicurarsi di aggiungere la soluzione delicatamente e sul lato della camera cellulare in modo da non rimuovere le cellule aderenti. L'aggiunta di 4 μL di etichetta nucleare da 5 mM a 800 μL di tampone produce una concentrazione finale di 25 μM di etichetta nucleare. Per le cellule vagamente aderenti come le cellule HEK293, mescolare prima l'etichetta nucleare e il tampone in una fiala e quindi aggiungere ai coverslip montati nella camera cellulare. Ciò impedirà di sollevare le cellule dal coverslip.
  8. Coprire la camera cellulare con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  9. Preparazione del reagente: aggiungere 1 μL di forskolina da 50 mM a 199 μL di tampone. Ciò produrrà una concentrazione finale di forskolina di 50 μM quando aggiunta a cellule preparate con 800 μL di tampone. 1 μL di DMSO in 199 μL di tampone dovrebbero anche essere preparati per essere utilizzati come controllo del veicolo.
    NOTA: In questi studi, forskolin è usato come attivatore dell'adenilil ciclasi per stimolare la produzione di cAMP. Se lo si desidera, questa metodologia può essere facilmente modificata per consentire il trattamento con reagenti alternativi per stimolare o inibire l'adenilil ciclasi, le fosfodiesterasi, ecc.

2. Acquisizione di immagini

  1. Utilizzare un microscopio confocale dotato di un rilevatore spettrale.
    NOTA: Tutte le fasi di acquisizione delle immagini qui descritte sono state sviluppate utilizzando un sistema di microscopi Nikon A1R disponibile in commercio. Questi passaggi potrebbero dover essere regolati se si utilizza un microscopio spettrale alternativo. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano accese almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento in modo da raggiungere condizioni operative stabili.
  2. Selezionare l'obiettivo di immersione in acqua 60x e aggiungere una goccia d'acqua all'obiettivo.
    NOTA: per l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione, si consiglia di utilizzare un obiettivo ad alta apertura numerica. Si prega di fare riferimento all'elenco dei materiali per informazioni sull'obiettivo utilizzato in questi studi.
  3. Posizionare la camera cellulare caricata (dal punto 1.7) sullo stadio del microscopio.
  4. Selezionare il set di filtri DFT (DAPI/FITC/TRITC) regolando la manopola del filtro sul lato destro del microscopio.
  5. Azionare il microscopio in modalità widefield a fluorescenza utilizzando gli oculari per selezionare un campo visivo contenente le cellule che esprimono il sensore cAMP FRET.
    NOTA: Assicurarsi che l'intensità media del segnale FRET alla lunghezza d'onda di picco dell'emissione del donatore o dell'accettore nella cella selezionata sia di almeno 100 unità di intensità (U.A.) o almeno 4 volte il segnale di base di una regione senza cellule che esprimono. Ciò può essere confermato utilizzando il visualizzatore di profili di spettro disponibile nel software NIS Elements. Quando si cerca una cellula con un buon segnale, è consigliabile scartare le cellule eccessivamente luminose (potrebbero essere compromesse).
  6. Apri il software NIS, passa alla modalità confocale, sblocca il pulsante di interblocco laser e fai clic su Live.
  7. Utilizzare la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le celle guardando l'anteprima sullo schermo.
  8. Configurare le impostazioni del dispositivo, dell'acquisizione e dello z-stack nel software, come descritto di seguito.
  9. Impostazioni di acquisizione:
    NOTA: le impostazioni di acquisizione della fotocamera e del dispositivo possono essere applicate utilizzando un'immagine acquisita in precedenza. Apri l'immagine, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Riutilizza impostazioni fotocamera.
    1. Aprire il menu delle impostazioni A1, selezionare le caselle corrispondenti alle linee laser a 405 nm e 561 nm, selezionare SD per il rilevatore spettrale, selezionare 10 per la risoluzione e 31 per i canali.
      NOTA: il menu delle impostazioni A1 viene visualizzato come una piccola icona a forma di ingranaggio nell'angolo in alto a sinistra della finestra Impostazioni A1 Plus. Il laser a 405 nm viene utilizzato per l'eccitazione del donatore e il laser a 561 nm viene utilizzato per l'eccitazione dell'etichetta nucleare.
    2. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda (410 – 730 nm) selezionando i valori di lunghezza d'onda iniziale e finale.
    3. Fare clic sull'icona di binning/skip nel menu delle impostazioni di A1 e selezionare la casella numerato 15, quindi fare clic su OK nel menu delle impostazioni A1.
      NOTA: questo per rimuovere il canale di lunghezza d'onda che corrisponde al laser di eccitazione a 561 nm (questo è in genere il canale di lunghezza d'onda15th). È importante non utilizzare questa banda di lunghezza d'onda per evitare un segnale artificialmente basso, che può creare un artefatto spettrale. Il segnale è più basso in questa banda a causa del dito meccanico che copre l'elemento del rilevatore per proteggerlo dai danni del laser.
    4. Impostare le intensità del laser su 8% e 2% per i laser da 405 nm e 561 nm, rispettivamente, Si Hv (guadagno del rivelatore) a 149 e un raggio stenopeico di 2,4 unità disco arioso (AU).
      NOTA: potrebbe essere necessario regolare le intensità del laser in base all'età dello strumento e alle condizioni dei laser. Se si regolano le intensità del laser tra diversi campioni o gruppi sperimentali, è importante mantenere lo stesso rapporto di intensità laser (ad esempio, 8:2). Inoltre, è importante selezionare un'intensità laser che non sia così luminosa da creare un rapido fotoscilazione. Il guadagno del rilevatore deve essere regolato per massimizzare l'intensità del segnale riducendo al minimo il rumore del rilevatore. Per questi studi, è stato utilizzato un guadagno di 149. È stata selezionata una dimensione stenopeica di 2,4 UA come equilibrio tra l'acquisizione di immagini con un rapporto segnale/rumore (SNR) sufficiente e il mantenimento del sezionamento ottico (confocalità). Un aumento delle dimensioni del foro stenopeico aumenta l'SNR ma diminuisce la confocalità.
    5. Impostare la velocità di scansione su 0,25 fotogrammi spettrali al secondo, selezionare l'icona corrispondente a unidirezionale per la direzione di scansione, immettere 4 per il conteggio e impostare 1024 x 1024 per le dimensioni della scansione.
      NOTA: i segnali FRET sono deboli e spesso è necessaria una velocità di scansione lenta. Utilizzando una velocità di scansione di 0,25, l'acquisizione di uno z-stack spettrale viene completata in ~ 3 minuti. La velocità di scansione può essere aumentata o diminuita a seconda dei fluorofori utilizzati. Ad esempio, per fluorofori più luminosi come eGFP, è possibile utilizzare una velocità di scansione più elevata (2 fotogrammi / secondo). Il numero inserito sotto conteggio corrisponde a un valore medio di fotogramma di 4, che aiuta a ridurre il rumore durante l'acquisizione dell'immagine. Per campioni molto stabili e dove il tempo non è un vincolo, è possibile utilizzare valori medi più elevati (fino a 16) per ottenere immagini con SNR migliorato.
  10. Definire i parametri di acquisizione z-stack:
    NOTA: i valori immessi nei passaggi 2.10 potrebbero dover essere regolati per adattarsi ai cambiamenti nel legame o nella concentrazione dell'etichetta fluorescente, nel tipo di etichetta, nel numero di etichette utilizzate, nella linea cellulare e in altri cambiamenti nella preparazione del campione che possono influire sulla densità di etichettatura cellulare e/o sull'autofluorescenza cellulare. Quando si regolano i parametri di acquisizione, è necessario prestare attenzione per ottenere un SNR sufficiente riducendo al minimo il fotosableching. Inoltre, quando si configura un test FRET spettrale, è necessario prestare attenzione per garantire che i parametri funzionino bene in tutti i gruppi di trattamento. Si consiglia di eseguire una prova di ciascun gruppo di trattamento con le impostazioni dei parametri proposte per garantire che l'SNR sia sufficiente e che il fotosableaching sia ridotto al minimo.
    1. Aprire la finestra di acquisizione ND facendo clic su Visualizza → controllo acquisizione → acquisizione ND.
    2. Immettere il percorso/destinazione e un nome file per salvare il file ND nella finestra popup.
    3. Selezionare la casella corrispondente alla serie z.
    4. Fare clic su live nella finestra Impostazioni A1 Plus. Si aprirà una finestra di visualizzazione dal vivo.
    5. Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte superiore della cella e fare clic su Superiore nella finestra di acquisizione ND per impostare la posizione corrente come parte superiore.
      NOTA: si consiglia di mettere a fuoco leggermente sopra la parte superiore della cella per assicurarsi che tutta la cella sia campionata nella serie z.
    6. Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte inferiore della cella e fare clic su Inferiore nella finestra di acquisizione ND per impostare la posizione corrente come inferiore.
      NOTA: mettere a fuoco leggermente al di sotto della parte inferiore della cella per assicurarsi che tutta la cella venga campionata.
    7. Immettere 1 μm per la dimensione del passo, selezionare in alto in basso per la direzione z-scan e fare clic su Esegui nella finestra acquisizione ND per acquisire uno z-stack.
      NOTA: la dimensione del passo determina il numero di fette z che verranno acquisite in base alle posizioni superiore e inferiore (ovvero la distanza percorsa). È stata selezionata una dimensione del passo di 1 μm come compromesso tra velocità di imaging, campionamento dell'asse z e fotosaguviazione. Utilizzando il diametro del foro stenopeico confocale di 2,4 UA e l'obiettivo di immersione in acqua 60x ha portato a uno spessore della sezione ottica di 1,73 μm. Quindi, una dimensione del passo di 1 μm è leggermente inferiore ai criteri di campionamento di Nyquist, ma questo è un compromesso che è stato fatto per ridurre il tempo necessario per acquisire uno z-stack. Per campioni molto stabili, per i quali la velocità non è critica, è possibile utilizzare un passo dell'asse Z più piccolo e possibilmente un diametro del foro stenopeico confocale più piccolo per aumentare la risoluzione dell'asse z. Bottom-top dovrebbe produrre risultati simili e può essere utilizzato per valutare eventuali effetti del fotosciviazione che possono verificarsi durante la scansione z.
  11. Configurare il Perfect Focus System (PFS), se disponibile:
    NOTA: PFS consente al sistema di compensare le fluttuazioni della profondità focale durante l'acquisizione dell'immagine. I seguenti passaggi possono essere utilizzati per configurare PFS e questi passaggi possono variare leggermente a seconda della versione della Nikon A1R e della versione di NIS Elements utilizzata.
    1. Evidenziare la modalità simmetrica definita dall'icona dell'intervallo nella finestra di acquisizione ND.
    2. Accendere il pulsante PFS sulla faccia anteriore del microscopio (assicurarsi che la manopola dello specchio dicroico situata nella sezione sotto lo stadio del campione sia "in").
    3. Ridefinite la parte superiore (ruotare in senso antiorario) e inferiore (ruotare in senso orario) utilizzando la manopola sulla faccia anteriore del controller offset PFS.
    4. Definite una posizione z/profondità z relativa facendo clic su 'relativo' nella finestra di acquisizione ND.
    5. Fare clic sulla memoria sulla faccia anteriore del microscopio in modo che il software memorizzi la profondità z relativa.
  12. Al termine dell'acquisizione z-stack, aggiungere delicatamente il reagente desiderato (forskolin o controllo del veicolo) utilizzando una pipetta e attendere 10 minuti.
    NOTA: Aggiungere il reagente molto delicatamente in modo da non disturbare le cellule o spostare la posizione della camera cellulare all'interno dello stadio XY del microscopio; è utile verificare in una successiva vista dal vivo o immagine che il campo visivo non si sia spostato durante l'aggiunta del reagente. Il tempo di attesa di 10 minuti è per il trattamento forskolin per avere effetto. Se viene utilizzato un trattamento alternativo, potrebbe essere necessario regolare il tempo di attesa.
  13. Dopo 10 minuti, modificare il nome del file e fare clic su Esegui nella finestra di acquisizione ND.
  14. Ripetere i passaggi 2.11 – 2.13 come descritto sopra per almeno 5 coverslips in modo da ottenere risultati sufficienti per l'analisi statistica (n = 5 per ciascun gruppo di trattamento - forskolin e controllo del veicolo).
  15. Preparare campioni e campioni grezzi per costruire la libreria spettrale e acquisire immagini spettrali utilizzando impostazioni di acquisizione simili a quanto descritto nei passaggi 2.9 e 2.10.

3. Analisi delle immagini

NOTA: Queste immagini saranno utilizzate per costruire una libreria spettrale contenente gli spettri puri di tutti i singoli membri finali presenti nello studio. I membri finali nella libreria spettrale potrebbero variare da studio a studio se vengono utilizzati fluorofori diversi. Una procedura dettagliata per costruire la libreria spettrale è fornita in un file di informazioni supplementari denominato "Supplemental File_Spectral Library". Qui, descriviamo l'esportazione dei dati in file .tiff, l'unmixing spettrale lineare, le misurazioni dell'efficienza FRET, la ricostruzione tridimensionale e la stima dei livelli cAMP. L'analisi delle immagini può essere eseguita utilizzando diverse piattaforme di analisi e programmazione delle immagini come ImageJ, Python, MATLAB o CellProfiler. In questi studi sono stati utilizzati script MATLAB.

  1. Esporta i dati dell'immagine:
    1. Creare nuove cartelle con lo stesso nome file corrispondente alle immagini spettrali z-stack acquisite nei passaggi 2.13 e 2.14.
      NOTA: i seguenti passaggi descritti per esportare i dati sono specifici per NIS Elements AR versione 4.30.01. Questi passaggi possono variare leggermente a seconda della versione del software.
    2. Fare clic su File, che aprirà una finestra di file. Sfogliate e selezionate il file di immagine spettrale acquisito nel passaggio 2.12 e fate clic su Apri.
    3. Una volta caricato il file, fare clic su File→ Importa/Esporta→ Esporta documento ND.
    4. Nella finestra popup: sfoglia e seleziona la cartella creata nel passaggio 3.1.1, seleziona Formato immagine con tag (TIF) per Tipo di file, quindi seleziona Immagine mono per ciascun canale e Mantieni profondità di bit.
      NOTA: il prefisso File verrà pregenerato; modificare questo valore per comodità. L'ordine dell'indice cambierà a seconda dei canali selezionati e dovrebbe visualizzare "z, c" per l'indicizzazione in base alla posizione z-slice prima e al numero di banda di lunghezza d'onda secondo. Assicurarsi che le caselle corrispondenti a Applica LUT o Inserisci sovrapposizioni o Usa nomi punto siano deselezionate.
    5. Fare clic su Esporta per esportare i file tiff in una cartella di destinazione come singoli file tiff.
    6. Ripetere i passaggi 3.1.2 – 3.1.5 per esportare i file di immagine spettrale acquisiti nel passaggio 2.13.
  2. Unmixing spettrale lineare:
    1. Aprire il software di programmazione.
      NOTA: lo script di programmazione sviluppato su misura per unmix di immagini spettrali grezze è fornito sul sito Web BioImaging e BioSystems della University of South Alabama, nella scheda Risorse (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Apri il file etichettato "Linear Unmixing.m" e fai clic sul pulsante Esegui nella barra degli strumenti dell'editor.
    3. Sfoglia e seleziona la cartella contenente la sequenza di file *.tif esportata generata dal software NIS Elements.
    4. Fare clic su OK per continuare, che aprirà una nuova finestra chiamata Lunghezza d'onda e Z-Slice.
    5. Copiare il nome del primo file (senza z-slice e numero di canale) nella cartella selezionata nel passaggio 3.2.4 e incollarlo nel primo passaggio della finestra di dialogo denominata "Immettere il nome dell'immagine".
    6. Inserisci il numero di canali nel secondo passaggio etichettato "Inserisci il numero di bande di lunghezza d'onda", il numero di z-slice nel terzo passaggio etichettato "Inserisci il numero di Z-slices" e fai clic su OK.
      NOTA: il numero di bande di lunghezze d'onda può cambiare se vengono apportate modifiche alle impostazioni di acquisizione, ad esempio la regolazione dell'intervallo di lunghezze d'onda o della dimensione del gradino della lunghezza d'onda. Il numero di fette Z può anche cambiare a seconda dell'altezza della cella.
    7. Sfoglia e seleziona il file di lunghezza d'onda chiamato "Wavelength.mat" nella finestra popup etichettata "Seleziona il file di informazioni sulla lunghezza d'onda" e fai clic su Apri.
    8. Sfoglia e seleziona il file "Library.mat" nella nuova finestra popup denominata "Seleziona il file della libreria spettrale", fai clic su Apri e attendi fino al termine della disasmi delle sezioni.
      NOTA: il file Library.mat è un file contenente spettri puri per ogni fluoroforo del membro finale insieme all'autofluorescenza cellulare e alle firme spettrali di sfondo. In questo caso, i fluorofori dei membri finali includono Turchese, Venere e DRAQ5. Le firme spettrali di sfondo includono l'autofluorescenza cellulare o della matrice, la fluorescenza coverslip e la diffrazione coverslip. Il file Wavelength.mat è un file contenente le informazioni sul canale di lunghezza d'onda utilizzato per acquisire l'immagine spettrale. Un file di libreria di esempio e un file di lunghezza d'onda sono disponibili sul sito web bioimaging and Biosystems (vedere la nota al punto 3.2.1). Per ulteriori informazioni su come generare file di libreria spettrale e di lunghezza d'onda, fare riferimento al file di informazioni supplementari denominato "Libreria File_Spectral supplementare". Le immagini non mixate corrispondenti a ciascuna z-slice verranno salvate nella cartella denominata "Unmixed" creata durante il processo di unmixing all'interno della cartella selezionata nel passaggio 3.2.3.
  3. Calcolo dell'efficienza FRET:
    1. Aprire lo script di programmazione denominato "multiFRRCF.m" e fare clic su Esegui.
      NOTA: questo file di programmazione è disponibile sul sito Web della University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (vedere la nota al passaggio 3.2.1).
    2. Inserisci il numero di prove sperimentali da analizzare nella finestra di dialogo popup chiamata "quante cartelle rilice" e fai clic su OK.
      NOTA: i dati immagine di ogni esperimento devono essere salvati in una cartella di immagini non mixata separata. Questo passaggio consente semplicemente al codice di analisi di eseguire il loop su molte cartelle come passaggio per risparmiare tempo.
    3. Sfogliare e selezionare le cartelle non mixate e fare clic su OK.
      NOTA: il numero di volte in cui si apre la finestra pop-up "Cerca cartella" dipende dal numero immesso nella finestra di dialogo "Quante cartelle recuperare" nel passaggio precedente. Sfoglia e seleziona le cartelle una dopo l'altra.
    4. Nella nuova finestra popup, inserisci le seguenti informazioni nelle rispettive caselle: il fattore di ridimensionamento è 12,4, la soglia è 5,6, X, Y e Z La frequenza sono rispettivamente 5, 5 e 1 e l'algoritmo di smoothing è gaussiano.
      NOTA: il fattore di scala è un valore in pixel/μm e verrà utilizzato per ridimensionare il campionamento in direzione Z a quello della direzione XY. Il fattore di scala è ottenuto dalla dimensione dei pixel dell'immagine, che di solito viene fornita come metadati nell'immagine per la maggior parte dei sistemi di microscopio confocale. Ad esempio, se l'immagine viene acquisita con una spaziatura di 0,08 μm/pixel, il fattore di scala deve essere di 12,5 pixel/μm. Il valore di soglia verrà utilizzato per sogliere le immagini e generare una maschera binaria della cella. Abbiamo creato un elenco di valori ottimali in base all'intensità del donatore+ accettore dell'immagine. Utilizzare 4.5 come valore di soglia se l'immagine ha un'intensità donatore+accettore luminosa e uno sfondo basso, un valore compreso tra 5,6 e 6,5 per le immagini con intensità donatore+accettore moderata e/o sfondo superiore e un valore di 7,5 e superiore per le immagini con un'intensità donatore+accettore inferiore allo sfondo. Il valore di frequenza corrisponde all'intervallo, in numero di pixel, in cui viene eseguita la slicing nei passaggi successivi. Ad esempio, se la profondità Z della cella è di 17 μm con una dimensione del passo di 1 μm e viene utilizzato un fattore di scala di 12,5 pixel/μm nella direzione XY, la profondità del set di dati di immagini tridimensionali verrà ricampionata a 212 pixel (direzione Z). In base al valore di frequenza Z immesso (ad esempio, 1 pixel), il set di dati dell'immagine tridimensionale verrà ri-affettato a partire dalla parte superiore del set di dati dell'immagine e quindi spostato con incrementi di 1 pixel verso il basso. Ciò si traduce in 212 immagini resliced. Se venisse inserito un intervallo di valori di frequenza più grande per la frequenza Z, verrebbero generate meno immagini resliced. Le immagini resliced vengono salvate nei passaggi successivi.
    5. Fare clic su Esegui e attendere fino a quando non vengono eseguite tutte le misurazioni FRET e il reslicing.
      NOTA: all'interno della directory padre viene creata una cartella separata in cui vengono salvate le immagini di efficienza FRET in scala di grigi licing e le immagini di efficienza FRET colorate (applicata una mappa a colori). Ad esempio, tutte le immagini FRET in scala di grigi e colormap rilicenze nella direzione X (piano YZ) vengono salvate in una cartella denominata "Resliced_XFRET".
    6. Ripetere l'analisi con impostazioni simili per tutti gli esperimenti – prima e dopo i trattamenti con forskolin e i controlli del veicolo.
      NOTA: i passaggi indicati nella sezione 3.3 descrivono i valori da immettere per lo script di programmazione di analisi FRET personalizzato per generare dati di immagine FRET tridimensionali. Tuttavia, questo script esegue diverse operazioni durante l'esecuzione, tra cui: caricamento dei dati dell'immagine, creazione di pile di immagini, smoothing, calcoli di efficienza FRET, creazione e applicazione di una maschera di bordo cellulare, ricostruzione dell'immagine tridimensionale, reslicing di immagini tridimensionali a intervalli specificati (frequenze), applicazione di una mappa colore per visualizzare le modifiche FRET e salvataggio dei dati dell'immagine resliced nella stessa directory. Ulteriori dettagli sono stati inclusi come commenti nello script del programma.

4. Mappatura dell'efficienza FRET ai livelli cAMP

  1. Apri il file di programmazione denominato "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" e fai clic su Esegui nella finestra principale.
    NOTA: il file è disponibile sul sito web bioImaging e BioSystems (vedere la nota al punto 3.2.1). Questo file legge le immagini di efficienza FRET in scala di grigi e le converte in livelli cAMP in base a una curva caratteristica. Questa curva caratteristica utilizza una relazione cAMP-TO-FRET documentata in letteratura15,36 che è descritta dall'equazione di Hill (la terza equazione mostrata di seguito). Tuttavia, Kd della sonda in celle intatte è difficile da stimare e abbiamo ipotizzato che sia 1 μM nei nostri calcoli. Quindi, i risultati sono mostrati in funzione di Kd. (cioè , [cAMP] = x * Kd). Le equazioni utilizzate per misurare l'efficienza FRET e mappare FRET ai livelli cAMP sono mostrate di seguito:
    figure-protocol-1
    Dove E è l'efficienza FRET, e unapparente e dapparente sono le intensità dei pixel non mixate delle immagini dell'accettore e del donatore, rispettivamente.
    Qa e Qd sono rese quantistiche di accettore e donatore. Si noti che Qa e Qd si annullano quando l'equazione per kλ è incorporata nell'equazione di efficienza FRET, kλ è un fattore di correzione:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3 e figure-protocol-4 sono coefficienti di estinzione del donatore e dell'accettore alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore, i (405nm).
    figure-protocol-5
    E è l'efficienza FRET e KD = costante di dissociazione = 1 μM.
  2. Navigare e selezionare la prima immagine FRET in scala di grigi (salvata nel passaggio 3.3.5) e fare clic su OK.
  3. Aprire le immagini FRET/cAMP per ispezionare la distribuzione dei segnali cAMP in tre dimensioni.

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Risultati

Questo protocollo descrive l'uso di approcci iperspettrali di imaging e analisi FRET per misurare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali nelle cellule viventi. Ci sono diversi passaggi chiave coinvolti nella generazione di questi risultati, per i quali è necessaria un'attenta attenzione durante l'analisi e la quantificazione dei dati. Questi passaggi chiave includono la costruzione di una libreria spettrale appropriata, lo smixing spettrale di sfondo, la soglia per identificare i bordi delle celle e i calcoli dell'e...

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Discussione

Lo sviluppo di biosensori FRET ha permesso la misurazione e la visualizzazione di segnali nucleotidici ciclici in singole cellule, e c'è una grande promessa per la visualizzazione degli eventi di segnalazione subcellulare13,22,37,38. Tuttavia, l'uso di biosensori FRET presenta diverse limitazioni, tra cui le basse caratteristiche segnale-rumore di molti reporter FRET fluorescenti basati su prot...

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Dichiarazioni

I dottori Leavesley e Rich rivelano l'interesse finanziario in una start-up, SpectraCyte, LLC, che è stata costituita per commercializzare tecnologie di imaging spettrale. Tuttavia, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state condotte utilizzando prodotti disponibili in commercio non associati a SpectraCyte, LLC.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute e van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Paesi Bassi) per averci fornito il biosensore H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) per l'aiuto tecnico nel ridurre il tempo impiegato per eseguire i nostri script di programmazione sviluppati su misura.

Gli autori desiderano riconoscere le fonti di finanziamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attofluor Cell ChamberInvitrogenA7816Attofluor contiene camere di celle in acciaio e un O-ring in gomma. La camera cellulare trattiene il vetrino coprioggetto e l'O-ring fornisce un meccanismo di blocco per trattenere il tampone nella camera cellulare senza perdite
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Solvente utilizzato per preparare la soluzione madre forskolina.
DRAQ5 Soluzione per sonda fluoroscenteThermo Scientific62252Etichetta nucleare
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Contiene nutrienti e fattori di crescita per la crescita e la divisione delle cellule nelle piastre di coltura.
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF6178Integratore per il fattore di crescita che viene aggiunto al terreno di coltura, DMEM
ForskolinSigmaF3917Attivatore dell'adenilia ciclasi.
H188 Biosensore FRET AMP ciclicoNetherland Cancer Institute, Dr. K. JalinkGiftPlasmide che codifica per turchese (fluoroforo donatore), Venere (fluoroforo accettore) e dominio di legame ottenuto da Epac.
Immagine Jimage.netDownload gratuitoUn'altra piattaforma di elaborazione delle immagini utilizzata per estrarre le informazioni spettrali e l'elaborazione delle immagini.
Integrating SphereOcean OpticsFOIS-1Utilizzato per misurare l'intensità di illuminazione della linea laser a diverse intensità laser (?).
Laminin Proteina di Topo,Naturale Invitrogen23017-015I vetrini coprioggetti sono rivestiti con laminina e questo aiuta l'attaccamento, la crescita e la motilità della cellula.
Kit di trasfezione Lipofectamine 3000InvitrogenL3000-015Reagente di trasfezione utilizzato per trasfettare le cellule con il biosensore FRET H188
MATLABMathworksR2019aoperazioni di elaborazione delle immagini (unmixing lineare e calcoli di efficienza FRET) vengono eseguite scrivendo programmi personalizzati nell'ambiente di programmazione MATLAB
Microscopio confocale Nikon A1RNikon InstrumentsNikon A1RL'acquisizione spettrale delle immagini viene eseguita utilizzando il microscopio confocale.
Nikon Elements SoftwareNikon InstrumentsDonglesoftware utilizzato per esportare e gestire i file di immagine nd2 (file di immagine multidimensionali) acquisiti utilizzando Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration LampOcean OpticsLS-1-CAL-INTUna lampada con uno spettro noto per l'uso come PBS
standard pH 7.4 (1X)Gibco10010-023coomonly utilizzato tampone suring coltura cellulare
Cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC)In house - Nucleo di coltura cellulare, Università dell'Alabama meridionaleIsolato da microvascolarizzazione polmonare di rattoLe PMVEC formano il rivestimento interno di un vaso sanguigno.
Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)Gibco15140-122vengono aggiunti a culture medum per prevenire la contaminazione delle cellule.
Micro vetrini con sigillo d'oro pre-pulitiClay Adams3010Vetrini per microscopio utilizzati per la fissazione cellulare
Terreno di montaggio antisbiadimento ProLong DiamondInvitrogenP36961Se i campioni vengono fissati con un montante antisbiadimento, quest'ultimo protegge i coloranti fluoroscenti e i cromofori dallo sbiadimento.
SpettrometroOcean OpticsQE65000Utilizzato per misurare la risposta spettrale della sorgente luminosa (?)
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200-056Digerisce il legame proteina-proteina tra la cellula e la matrice cellulare e aiuta a dissociare e sollevare le cellule durante la placcatura cellulare.
tampone Tyrodes viene utilizzato per realizzare soluzioni funzionanti e per mantenere le cellule in soluzione acquosa durante l'acquisizione dell'immagine.
Piastra per colture cellulari a 6 pozzettiCorning3506vengono inseriti in una piastra di coltura a 6 pozzetti (un coverlisps/pozzetto). Le cellule insieme al terreno vengono aggiunte in ogni pozzetto.
Vetrini coprimicroscopio rotondi da 25 mm FisherScientific12545102Le cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetti rotondi
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27immersione in acqua e obiettivo comunemente usato per le cellule
Le Gli antibiotici Il I vetrini coprioggetti rivestiti di laminina

Riferimenti

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