Articolo metodologico
A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.
L'AMP ciclico è un secondo messaggero che è coinvolto in una vasta gamma di attività cellulari e fisiologiche. Diversi studi suggeriscono che i segnali cAMP sono compartimentati e che la compartimentazione contribuisce alla specificità della segnalazione all'interno della via di segnalazione cAMP. Lo sviluppo di biosensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET) ha favorito la capacità di misurare e visualizzare i segnali cAMP nelle cellule. Tuttavia, queste misurazioni sono spesso limitate a due dimensioni spaziali, il che può comportare un'interpretazione errata dei dati. Ad oggi, ci sono state solo misurazioni molto limitate dei segnali cAMP in tre dimensioni spaziali (x, y e z), a causa delle limitazioni tecniche nell'utilizzo dei sensori FRET che mostrano intrinsecamente un basso rapporto segnale/rumore (SNR). Inoltre, i tradizionali approcci di imaging basati su filtri sono spesso inefficaci per la misurazione accurata dei segnali cAMP nelle regioni subcellulari localizzate a causa di una serie di fattori, tra cui la diafonia spettrale, la potenza limitata del segnale e l'autofluorescenza. Per superare queste limitazioni e consentire l'utilizzo di biosensori basati su FRET con più fluorofori, abbiamo sviluppato approcci di imaging e analisi FRET iperspettrali che forniscono specificità spettrale per il calcolo delle efficienze FRET e la capacità di separare spettralmente i segnali FRET dall'autofluorescenza confondente e / o segnali da etichette fluorescenti aggiuntive. Qui, presentiamo la metodologia per l'implementazione dell'imaging FRET iperspettrale e la necessità di costruire una libreria spettrale appropriata che non sia né sottocampionata né sovracampionata per eseguire l'unmixing spettrale. Mentre presentiamo questa metodologia per la misurazione delle distribuzioni tridimensionali di cAMP nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC), questa metodologia potrebbe essere utilizzata per studiare le distribuzioni spaziali di cAMP in una gamma di tipi di cellule.
L'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è un secondo messaggero coinvolto nei principali processi cellulari e fisiologici tra cui la divisione cellulare, l'afflusso di calcio, la trascrizione genica e la trasduzione del segnale. Un numero crescente di prove suggerisce l'esistenza di compartimenti cAMP nella cellula attraverso i quali si raggiunge la specificità di segnalazione1,2,3,4,5,6,7. Fino a poco tempo fa, la compartimentazione cAMP ....
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Questo protocollo segue le procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della University of South Alabama.
1. Preparazione di cellule, campioni e reagenti per l'imaging
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Questo protocollo descrive l'uso di approcci iperspettrali di imaging e analisi FRET per misurare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali nelle cellule viventi. Ci sono diversi passaggi chiave coinvolti nella generazione di questi risultati, per i quali è necessaria un'attenta attenzione durante l'analisi e la quantificazione dei dati. Questi passaggi chiave includono la costruzione di una libreria spettrale appropriata, lo smixing spettrale di sfondo, la soglia per identificare i bordi delle celle e i calcoli dell'e.......
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Lo sviluppo di biosensori FRET ha permesso la misurazione e la visualizzazione di segnali nucleotidici ciclici in singole cellule, e c'è una grande promessa per la visualizzazione degli eventi di segnalazione subcellulare13,22,37,38. Tuttavia, l'uso di biosensori FRET presenta diverse limitazioni, tra cui le basse caratteristiche segnale-rumore di molti reporter FRET fluorescenti basati su prot.......
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I dottori Leavesley e Rich rivelano l'interesse finanziario in una start-up, SpectraCyte, LLC, che è stata costituita per commercializzare tecnologie di imaging spettrale. Tuttavia, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state condotte utilizzando prodotti disponibili in commercio non associati a SpectraCyte, LLC.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute e van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Paesi Bassi) per averci fornito il biosensore H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) per l'aiuto tecnico nel ridurre il tempo impiegato per eseguire i nostri script di programmazione sviluppati su misura.
Gli autori desiderano riconoscere le fonti di finanziamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contiene camere di celle in acciaio e un O-ring in gomma. La camera cellulare trattiene il vetrino coprioggetto e l'O-ring fornisce un meccanismo di blocco per trattenere il tampone nella camera cellulare senza perdite |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvente utilizzato per preparare la soluzione madre forskolina. |
| DRAQ5 Soluzione per sonda fluoroscente | Thermo Scientific | 62252 | Etichetta nucleare |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contiene nutrienti e fattori di crescita per la crescita e la divisione delle cellule nelle piastre di coltura. |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F6178 | Integratore per il fattore di crescita che viene aggiunto al terreno di coltura, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Attivatore dell'adenilia ciclasi. |
| H188 Biosensore FRET AMP ciclico | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmide che codifica per turchese (fluoroforo donatore), Venere (fluoroforo accettore) e dominio di legame ottenuto da Epac. |
| Immagine J | image.net | Download gratuito | Un'altra piattaforma di elaborazione delle immagini utilizzata per estrarre le informazioni spettrali e l'elaborazione delle immagini. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Utilizzato per misurare l'intensità di illuminazione della linea laser a diverse intensità laser (?). |
| Laminin Proteina di Topo, | Naturale Invitrogen | 23017-015 | I vetrini coprioggetti sono rivestiti con laminina e questo aiuta l'attaccamento, la crescita e la motilità della cellula. |
| Kit di trasfezione Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000-015 | Reagente di trasfezione utilizzato per trasfettare le cellule con il biosensore FRET H188 |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | operazioni di elaborazione delle immagini (unmixing lineare e calcoli di efficienza FRET) vengono eseguite scrivendo programmi personalizzati nell'ambiente di programmazione MATLAB |
| Microscopio confocale Nikon A1R | Nikon Instruments | Nikon A1R | L'acquisizione spettrale delle immagini viene eseguita utilizzando il microscopio confocale. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Dongle | software utilizzato per esportare e gestire i file di immagine nd2 (file di immagine multidimensionali) acquisiti utilizzando Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | Una lampada con uno spettro noto per l'uso come PBS |
| standard pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly utilizzato tampone suring coltura cellulare |
| Cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC) | In house - Nucleo di coltura cellulare, Università dell'Alabama meridionale | Isolato da microvascolarizzazione polmonare di ratto | Le PMVEC formano il rivestimento interno di un vaso sanguigno. |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | vengono aggiunti a culture medum per prevenire la contaminazione delle cellule. |
| Micro vetrini con sigillo d'oro pre-puliti | Clay Adams | 3010 | Vetrini per microscopio utilizzati per la fissazione cellulare |
| Terreno di montaggio antisbiadimento ProLong Diamond | Invitrogen | P36961 | Se i campioni vengono fissati con un montante antisbiadimento, quest'ultimo protegge i coloranti fluoroscenti e i cromofori dallo sbiadimento. |
| Spettrometro | Ocean Optics | QE65000 | Utilizzato per misurare la risposta spettrale della sorgente luminosa (?) |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-056 | Digerisce il legame proteina-proteina tra la cellula e la matrice cellulare e aiuta a dissociare e sollevare le cellule durante la placcatura cellulare. |
| tampone Tyrodes viene utilizzato per realizzare soluzioni funzionanti e per mantenere le cellule in soluzione acquosa durante l'acquisizione dell'immagine. | |||
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Corning | 3506 | vengono inseriti in una piastra di coltura a 6 pozzetti (un coverlisps/pozzetto). Le cellule insieme al terreno vengono aggiunte in ogni pozzetto. |
| Vetrini coprimicroscopio rotondi da 25 mm Fisher | Scientific | 12545102 | Le cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetti rotondi |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | immersione in acqua e obiettivo comunemente usato per le cellule |
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