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Articolo metodologico

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

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⸱

DOI:

10.3791/61725

⸱

26 agosto 2020

 ,  , 
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Abstract

Le api da miele sono di grande importanza ecologica e agricola in tutto il mondo, ma sono anche soggette a una varietà di pressioni che influenzano negativamente la salute delle api, compresa l'esposizione a patogeni virali. Tali virus possono causare un'ampia varietà di effetti devastanti e spesso possono essere difficili da studiare a causa di molteplici fattori che rendono difficile separare gli effetti dei trattamenti sperimentali dall'infezione di fondo preesistente. Qui presentiamo un metodo per produrre in serie grandi quantità di particelle virali insieme a un biotest ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Rese necessarie dall'attuale mancanza di una linea continua di cellule di api da miele prive di virus, le particelle virali vengono amplificate in vivo utilizzando pupe di api da miele, che vengono estratte dall'alveare in grandi volumi utilizzando una metodologia minimamente stressante. Queste particelle virali possono quindi essere utilizzate nei biotest delle gabbie delle api per testare la vitalità degli inoculi, nonché in varie altre dinamiche di infezione virale, comprese le interazioni con nutrizione, pesticidi e altri agenti patogeni. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di tali particelle è che riduce notevolmente le possibilità di introdurre variabili sconosciute nella sperimentazione successiva rispetto alle alternative attuali, come l'infezione tramite emolinfa delle api infette o omogeneizzato, anche se è necessario prestare attenzione quando si acquistano le api, per ridurre al minimo la contaminazione da virus di fondo. I saggi in gabbia non sostituiscono esperimenti su larga scala e realistici sul campo che testano gli effetti dell'infezione virale a livello di colonia, ma funzionano invece come metodo per stabilire risposte virali di base che, in combinazione con le particelle virali semi-pure, possono servire come strumenti importanti per esaminare varie dimensioni delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

Introduzione

Le api mellifere (Apis mellifera) svolgono un ruolo fondamentale nel moderno paesaggio agricolo globale, ma attualmente soffrono di una combinazione di fattori di stress biotici e abiotici, tra cui esposizione a pesticidi, foraggio scadente, parassiti e agenti patogeni 1,2. Uno dei più importanti agenti patogeni di preoccupazione sono i virus, molti dei quali sono vettorizzati da un altro dei principali fattori di stress delle api da miele, l'acaro parassita Varroa (Varroa destructor). Questi virus possono causare una serie di effetti negativi nelle api mellifere tra cui una ridotta sopravvivenza della covata, difetti dello sviluppo e paralisi che possono portare al collasso totale dell'alveare sia prima che dopo i periodi di svernamento 3,4,5. Sebbene ci siano stati progressi promettenti nello sviluppo di tecnologie utilizzate per combattere l'infezione da virus 6,7,8,9, le dinamiche con cui molti virus si propagano, si diffondono e interagiscono all'interno di un'ape o colonia di miele sono ancora poco conosciute 5,10 . Comprendere la biologia di base delle interazioni tra api e virus e le loro relazioni con altri fattori ambientali è fondamentale per lo sviluppo di tecniche efficaci di gestione dei virus.

Tuttavia, lo studio delle interazioni tra api e virus del miele pone sfide con numerosi fattori noti e sconosciuti che complicano il processo. Questi includono interazioni con la dieta11,12, esposizione ai pesticidi13 e background genetico delle api14,15. Anche quando ci si concentra solo sull'infezione da virus, le complicazioni sono comuni perché le popolazioni di api da miele, sia gestite che selvatiche, hanno sempre un certo grado di infezione da virus di fondo, anche se spesso senza manifestare sintomiacuti 16,17, e gli effetti della coinfezione da virus non sono ben compresi18. Ciò ha reso difficile districare lo studio degli effetti del virus delle api da miele.

Molti studi sul virus delle api da miele hanno utilizzato infezioni virali circostanziali per cercare interazioni con altri fattori di stress, osservando come le infezioni di fondo cambiano con altri trattamenti 12,19,20,21. Mentre questo approccio ha avuto successo nell'identificare effetti importanti, in particolare scoprendo come i pesticidi o i trattamenti dietetici influenzano i livelli e la replicazione del virus, l'inoculazione con un trattamento del virus di contenuto e concentrazione noti è fondamentale per i test sperimentali delle dinamiche di infezione da virus. Anche così, separare il trattamento sperimentale dall'infezione di fondo può anche porre delle sfide. Negli studi sul campo, i ricercatori hanno differenziato i ceppi del virus dell'ala deformata (DWV) per fornire prove della trasmissione del virus dalle api mellifere ai bombi22, ma l'uso di questo approccio sarebbe difficile solo all'interno delle api da miele. I cloni infettivi da virus sono uno strumento potente, non solo per il monitoraggio dell'infezione 23,24,25, ma per studi di genetica inversa sui virus delle api da miele e per la ricerca sull'interazione virus-ospite 26,27,28. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i cloni infettivi sono ancora necessari per soddisfare il ciclo di infezione all'interno delle cellule per produrre particelle. Tali particelle sono preferite come inoculi per trattamenti sperimentali perché la loro infettività è superiore all'RNA virale nudo e l'inoculazione con genomi incapsulati imita un'infezione naturale.

Anche la produzione di inoculi puri e incontaminati del virus delle api del miele (ceppi virali selvatici o derivati da cloni infettivi) pone delle sfide. Questi sono principalmente dovuti alle difficoltà nell'ottenere una linea cellulare di api da miele affidabile, a replicazione continua e priva di virus per produrre virus di ceppo puro29,30. Mentre alcune linee cellulari sono state prodotte, questi sistemi rimangono imperfetti; tuttavia, c'è la speranza che una linea cellulare praticabile possa essere prodotta29, il che consentirebbe un controllo più preciso della produzione e dell'indagine del virus. Fino a quando tale linea non sarà ampiamente disponibile, la maggior parte dei protocolli di produzione di virus continuerà a fare affidamento sull'uso della produzione e purificazione di virus in vivo 18,31,32,33,34. Questi approcci comportano l'identificazione e la purificazione di particelle virali di interesse (o la produzione di un clone infettivo) e il loro utilizzo per infettare le api da miele, di solito come pupe. Le pupe vengono iniettate con il virus bersaglio e poi sacrificate, e ulteriori particelle vengono estratte e purificate. Tuttavia, poiché nessuna ape è priva di virus per cominciare, c'è sempre un certo grado di contaminazione da tracce di altri virus in qualsiasi concentrato di questo tipo e, pertanto, è necessario prestare molta attenzione nella scelta delle api con una bassa probabilità di infezioni di fondo. Inoltre, i metodi per rimuovere le pupe dalle cellule del pettine per l'uso in questi protocolli33 sono molto laboriosi e possono indurre stress nelle api, limitando la produzione con questi mezzi18,32. Qui, riportiamo un metodo alternativo che consente la rimozione su larga scala delle larve con poco lavoro e meno stress meccanico sulle api.

Una volta ottenute le pupe e iniettate con l'inoculo del virus di partenza, devono essere incubate per fornire al virus il tempo di replicarsi. Successivamente, le particelle virali prodotte possono essere trasformate in una forma utilizzabile per infettare le api sperimentali. Esistono diversi metodi semplici per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'utilizzo di un omogeneizzato grezzo35,36 o emolinfa generata da api infette viralmente come fonte di infezione37. Questi metodi sono efficaci ma incontrano una maggiore possibilità di introdurre variabili sconosciute dal substrato di fondo (ad esempio, altri fattori negli omogeneizzati delle api morte). Inoltre, è auspicabile concentrare le particelle se un esperimento richiede di somministrare una dose ampia e nota di un virus in un breve periodo di tempo. Pertanto, per un migliore controllo, è preferibile utilizzare metodi che consentano un certo livello di purificazione e concentrazione delle particelle virali. Generalmente, una serie di fasi di precipitazione e centrifugazione comporterà la rimozione di quasi tutto il possibile materiale virale non bersaglio33.

Dopo aver prodotto questo inoculo concentrato, è utile quantificare i titoli virali (qPCR) e caratterizzarlo con biosaggi in vivo per testarne la vitalità e la capacità di causare mortalità, nonché per confermare che si ottengono titoli virali aumentati dopo l'infezione. Ciò può essere ottenuto attraverso esperimenti di iniezione (sia in pupe che in adulti) o esperimenti di alimentazione (in larve o adulti). Mentre tutti questi approcci sono possibili, l'alimentazione di gruppi di api adulte in una gabbia è spesso la più veloce e semplice. Il metodo di analisi della gabbia è anche ampiamente utilizzato per testare vari altri trattamenti sulle api, tra cui la tossicità dei pesticidi38, lo sviluppo dell'ovaio39 e l'influenza nutrizionale sul comportamento40,41 e, quindi, può costituire una buona base per esperimenti che collegano l'infezione da virus con altri fattori42.

Qui descriviamo un metodo affidabile per produrre grandi quantità di particelle virali semi-pure e altamente arricchite senza utilizzare un costoso ultracentrifuga, incluso un metodo per rimuovere le pupe che riduce il lavoro e lo stress meccanico sulle api e un biotest altamente ripetibile e ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Controllando strettamente la purezza dell'inoculo virale, i ricercatori sono in grado di ridurre la variazione della risposta virale delle api da miele rispetto ad altri metodi di inoculazione virale. Inoltre, il biotest può schermare gli effetti virali a livello di piccoli gruppi utilizzando unità sperimentali altamente ripetibili prima di scalare su impostazioni realistiche sul campo, che è molto più laborioso da gestire. In combinazione, questi due metodi forniscono gli strumenti necessari per gli studi che possono aiutare a migliorare la nostra comprensione generale delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

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Protocollo

1. Opzione di estrazione di massa delle api 1: auto-rimozione larvale

  1. Ingabbia una regina delle api mellifere su una cornice Langstroth vuota e tirata fuori e riportala alla sua colonia. Lascia che la regina deponga le uova su questo telaio per 24 ore.
    1. Controllare il telaio dopo 24 ore per assicurarsi che la maggior parte delle celle a pettine contenga uova appena deposte. A seconda della regina e della colonia, le uova a volte non vengono deposte molto bene nelle prime 24 ore. In tal caso, attendere ulteriori 24 ore e regolare il tempo se necessario.
  2. Dopo il periodo di deposizione delle uova di 24 ore, rilascia la regina. Segna chiaramente la cornice e restituiscila alla colonia.
  3. Esattamente 192 ore (8 giorni) dopo aver ingabbiato la regina (supponendo la normale deposizione delle uova entro le prime 24 ore; 8 giorni segna il punto proprio prima della pupa), rimuovere la cornice contrassegnata dalla colonia. Spazzolare via tutte le api adulte e trasferire il telaio in un'incubatrice che corrisponda alle condizioni interne di un alveare (34 °C e 50% di umidità relativa (RH)).
    1. Controlla che la maggior parte del telaio sia riempito con larve di 5° instar, che possono essere riconosciute dai loro grandi corpi bianchi a forma di C premuti strettamente contro i bordi inferiori delle celle a pettine. Probabilmente ci saranno anche alcune celle già coperte da un tappo di cera, specialmente vicino al centro del telaio.
  4. Preparare contenitori corrispondenti all'altezza e alla larghezza del telaio pieno di larve per ricevere le larve 5° instar pulendo accuratamente le superfici interne ed esterne con acqua e sapone, seguite da una soluzione di candeggina e infine etanolo. Asciugare accuratamente il contenitore prima di procedere.
    1. Rivestire il fondo dei contenitori con diversi strati di carta assorbente. Quindi aggiungere diversi strati sovrapposti di salviette detergenti più sottili e assorbenti (ad esempio, tergicristalli delicati) o carta da filtro. Il materiale deve essere assorbente. Evitare di sovrapporre lo strato superiore per migliorare la facilità di futuro trasferimento larvale.
  5. Posiziona i fotogrammi rivolti verso il basso (con le larve focali rivolte verso il basso) sopra i contenitori in modo che le larve possano cadere sullo strato di salviette detergenti.
    1. Coprire il contenitore e il telaio con un pezzo tendato di foglio di alluminio o altro rivestimento per trattenere l'umidità e restituire la configurazione all'incubatore. Lasciare la configurazione durante la notte. Le naturali tendenze alla ricerca di cibo delle larve le faranno strisciare fuori dalle loro cellule e cadere sulla superficie imbottita sottostante.
  6. Preparare vassoi di trasferimento separati pulendoli accuratamente utilizzando gli stessi passaggi descritti in 1.4. Lasciare asciugare i vassoi e stratificare il fondo con salviette detergenti. I vassoi non devono necessariamente corrispondere a dimensioni specifiche, ma i vassoi meno profondi consentiranno manipolazioni larvali più facili.
    1. Inizia a trasferire le larve dai contenitori ai vassoi sollevando con cura le singole salviette dallo strato superiore nei contenitori e versando delicatamente le larve sui vassoi. Le larve dovrebbero essere cadute nei contenitori durante la notte, formando diverse masse appiccicose (Figura 1A).
    2. Usa una pinza morbida smussata per separare le larve e disporle sulla superficie dei vassoi. Non hanno bisogno di essere distanziati uniformemente e possono essere vicini l'uno all'altro, ma non dovrebbero essere toccanti. Vedere la Figura 1B per una rappresentazione visiva delle larve separate.
    3. Cogli l'occasione per rimuovere eventuali larve danneggiate (scolorite) o di dimensioni inferiori alla media. Questi hanno maggiori probabilità di morire durante il processo di maturazione e possono portare infezioni / crescita fungina in tutto il vassoio.
  7. Coprire il vassoio con un foglio di alluminio tendato per trattenere l'umidità e restituire la configurazione all'incubatore.
  8. Controllare le larve ogni giorno e rimuovere quelle scolorite (marrone scuro o nero).
    NOTA: Le larve / pre-pupe defecano sulle salviette detergenti, manifestandosi come piccole macchie marroni. Possono anche produrre piccole quantità di cinghie bianche e sottili come parte del loro processo di tappatura. Nessuno di questi eventi richiede la sostituzione delle salviette detergenti, purché siano assorbenti.
  9. Permettere alle larve di impuparsi e maturare fino allo stadio degli occhi bianchi, che può essere identificato dalla loro forma generale che corrisponde a quella di un'ape adulta pur mancando di pigmentazione nei loro occhi e nella maggior parte del resto del loro corpo. Ciò dovrebbe verificarsi tra 14 e 15 giorni dopo l'ingabbiamento della regina. Le pupe sono ora pronte per l'iniezione di virus. Figura 1C, 1D per esempi di pupe dagli occhi bianchi.

2. Opzione di estrazione di massa delle api 2: escissione pupale manuale

NOTA: Sebbene l'opzione 2 (escissione pupale) sia un metodo praticabile di estrazione delle api, presenta anche diversi inconvenienti rispetto all'opzione 1 (auto-rimozione larvale). L'opzione 2 è molto più laboriosa, più difficile da controllare per l'età pupale e generalmente più stressante per le api stesse. L'opzione 1 è consigliata quando possibile.

  1. Selezionare una cornice di covata di api da miele con cappuccio contenente pupe in corrispondenza o in prossimità dello stadio degli occhi bianchi (vedere 1.9 per una descrizione) da una colonia adatta. Rimuovere il tappo dalle celle a pettine situate vicino al centro e ai bordi del telaio per confermare la presenza dello stadio di sviluppo appropriato.
  2. Trasferire il telaio in un incubatore impostato a 34 °C e 50% di umidità relativa. Riportare sempre il telaio all'incubatore quando non è in uso immediato.
  3. Preparare e pulire vassoi di trasferimento identici a quelli descritti al punto 1.6.
  4. Rimuovere il telaio dall'incubatore e posizionarlo su un supporto angolato sotto una fonte di luce. Inumidire una piccola pila di asciugamani di carta con acqua.
  5. Pulire un paio di pinze dure smussate usando l'etanolo. Usando la pinza pulita, rimuovere il tappo dalle cellule contenenti pupe dagli occhi bianchi, facendo attenzione a non danneggiare le pupe nel processo.
  6. Uno per uno, asportare delicatamente le pupe dalle cellule del pettine. È più sicuro afferrare le pupe intorno al torace e all'addome usando le punte della pinza, se c'è spazio sufficiente. In caso contrario, tuttavia, le pupe possono anche essere rimosse afferrando la testa e muovendola lentamente abbastanza lontano da essere afferrate intorno al corpo.
    1. Coprire le parti del telaio a cui non si accede immediatamente con asciugamani di carta bagnati per trattenere l'umidità. Rimuovere e sostituire se necessario durante il processo di escissione.
  7. Distanziare le pupe asportate lungo le salviette detergenti nei vassoi di trasferimento, assicurandosi che nessuna di esse si tocchi. Eventuali pupe sfigurate o scolorite devono essere scartate. Le pupe sono ora pronte per l'iniezione di virus.
    1. Scartare le pupe che rilasciano liquido a contatto con le salviette; probabilmente sono stati forati. A volte, le pupe mostreranno piccole macchie scure di melanizzazione vicino ai punti di contatto con la pinza entro 1 ora dalla rimozione. Ciò non dovrebbe influire sulla sopravvivenza. Se compaiono grandi chiazze di melanizzazione, le pupe colpite devono essere scartate.

3. Iniezione del virus Pupal

NOTA: Se si esegue questo protocollo per la prima volta (cioè senza precedenti scorte di inoculi virali), estrarre e concentrare prima le particelle utilizzando adulti, pupe o larve di una colonia con una sospetta infezione. Misurare i titoli virali nell'inoculo risultante come descritto nel passaggio 5 e determinare quali particelle propagarsi ulteriormente.

  1. Sterilizzare tutte le superfici di lavoro utilizzando acqua candeggina ed etanolo prima di iniziare a lavorare con i virus delle api mellifere. I guanti in nitrile devono essere indossati durante l'intero processo.
  2. Preparare un apparecchio iniettore in grado di iniettare fluido in quantità ~ 1 μL.
    NOTA: Un approccio economico ma efficace sarebbe quello di creare un dispositivo fatto a mano attaccando un ago ipodermico da 30 G alla punta di una punta multi-dispenser da 100 μL (vedi Tabella dei materiali) utilizzando resina epossidica flessibile o un altro adesivo liquido. Assicurarsi che i bordi del cappuccio dell'ago siano sigillati saldamente contro la punta multi-dispenser e lasciare asciugare l'apparecchio. Vedere la Figura 2 per una rappresentazione visiva di un apparecchio iniettore di esempio.
  3. Preparare una soluzione di diluizione per iniezione di virus mescolando il tipo desiderato di particelle virali con 1x PBS sterilizzato (soluzione salina tamponata con fosfato) in un tubo conico centrifugo da 15 ml. La quantità totale necessaria dipenderà dal numero di pupe che devono essere iniettate, con ogni pupa che richiede un'iniezione di 1 μL (ad esempio, 500 pupe = 5 μL di particelle virali + 495 μL PBS).
  4. Collegare l'apparecchio iniettore a una multitubetta manuale e testare l'efficacia prelevando 100 μL di acqua da un becher separato ed erogandolo in dosi da 1 μL. Assicurarsi che ogni quantità erogata sia uguale, sostituendo l'apparato iniettore se necessario. Eliminare l'acqua rimanente dall'iniettore.
  5. Recuperare i vassoi di pupe generati nel passaggio 1 o nel passaggio 2 dall'incubatore e rimuovere il rivestimento in foglio di alluminio.
  6. Pulire un paio di pinze dure smussate usando l'etanolo. Afferrare delicatamente la singola pupa lungo il torace, applicando una pressione appena sufficiente per forzare i fluidi interni all'addome. Questo dovrebbe rendere più evidenti le divisioni tergite.
  7. Prelevare 100 μL della soluzione di particelle virali utilizzando la pipetta multipla, inserire l'ago tra il terzo e il quarto tergite addominale e iniettare 1 μL della soluzione virale. Ripetere per ogni pupa disposta sui vassoi, avendo cura di evitare iniezioni ripetute. Qualsiasi pupa danneggiata durante il processo deve essere scartata.
    ATTENZIONE: Tutti i materiali correlati alla preparazione del virus sono designati come rischi biologici e devono essere autoclavati e smaltiti seguendo le linee guida istituzionali. Anche gli aghi devono essere smaltiti seguendo le linee guida istituzionali.
  8. Coprire i vassoi delle pupe iniettate con un foglio di alluminio e tornare all'incubatrice. Lasciare che le particelle virali si propaghino all'interno delle pupe per 3-5 giorni.
    1. Eseguire ispezioni giornaliere sulle pupe e rimuovere eventuali campioni morti o in decomposizione per prevenire l'accumulo di batteri o funghi. Piccoli punti di melanizzazione possono apparire nel sito di iniezione sull'addome, ma non dovrebbero influenzare la sopravvivenza.
  9. Campionare le pupe in tubi centrifughi conici da 50 ml e vortice per omogeneizzare il contenuto, avendo cura di campionare le pupe in provette per fonte di colonia per ridurre la contaminazione da virus non bersaglio. Assicurarsi che non rimangano pupe intere e trasferire i tubi in un congelatore a -80 °C fino a quando non sono pronti per la precipitazione e la concentrazione delle particelle virali.

4. Concentrazione di particelle virali

NOTA: questo protocollo non è stato testato per il recupero di virus avvolti.

  1. Autoclave di tutti i materiali e contenitori prima dell'uso. Guanti in nitrile, camici da laboratorio e protezione per gli occhi devono essere indossati durante l'intero processo. Sterilizzare tutte le superfici di lavoro utilizzando acqua candeggina, etanolo e soluzione inattivante RNasi prima di iniziare.
    1. Preparare 1 tampone TES (Tris-EDTA-salt): mescolare 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA e 150 mM NaCl. Sterilizzare con autoclave.
  2. Scongelare le pupe omogeneizzate e trasferirle in flaconi di centrifuga. Aggiungere circa tre volumi di 1x PBS (ad esempio, aggiungere un tubo completo da 50 mL di pupe a 150 mL di 1x PBS) ed equalizzare i volumi a quello della bottiglia più piena.
  3. Mescolare prima a mano e poi appoggiando su uno shaker orbitale a temperatura ambiente per 10 minuti.
  4. Centrifugare a 15.000 x g a 4 °C per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Ripetere questo passaggio se necessario se rimangono detriti cellulari.
    1. Se il surnatante ha grandi globuli di grasso che galleggiano in superficie, filtrare attraverso una garza in flaconi di centrifuga sterili separati prima di procedere.
  5. Estrarre il surnatante con 0,3 volumi di soluzione di cloroformio 24:1:isoamilico (ad esempio, 190 mL di surnatante + 57 mL di cloroformio:alcool isoamilico) e mescolare per inversione. Centrifuga a 21.000 x g a 4 °C per 20 min.
    ATTENZIONE: Evitare il contatto diretto con il cloroformio sulla pelle o sugli occhi. Indossare sempre DPI adeguati. Tutti i rifiuti di cloroformio dovrebbero essere smaltiti seguendo le linee guida istituzionali.
  6. Recuperare la fase acquosa da ogni flacone trascantando il surnatante in becher sterili separati da 500 ml in un bagno di ghiaccio o in una cella frigorifera a 4 °C. Fare attenzione ad evitare di contaminare il surnatante con il cloroformio in quanto renderà più difficile il processo di purificazione; è meglio perdere un po' di fase acquosa.
  7. Aggiungere acqua priva di RNase per portare ogni becher fino a un volume di 200 ml. Posizionare i bicchieri su piastre magnetiche e lasciarli cadere in una barra di agitazione di medie dimensioni. Impostare le piastre in modo che si mescolino con un'impostazione medio-bassa.
  8. Aggiungere lentamente NaCl a ciascun becher mescolando costantemente, portando ciascuno a una concentrazione finale del 2,3% (ad esempio, 4,6 g di NaCl per 200 ml di surnatante). Aggiungere il polietilenglicole 8000 (PEG) a ciascun becher fino a una concentrazione finale del 7% (ad esempio, 14 g PEG per 200 ml di surnatante).
  9. Coprire i bicchieri con un foglio di alluminio e continuare a mescolare a velocità medio-bassa sul ghiaccio o in una cella frigorifera per 1-5 ore per sciogliere il PEG. Più tempo si passa a mescolare, più accuratamente il PEG si dissolverà.
  10. Spegnere le piastre di agitazione. Incubare i becher coperti per 1-3 giorni sul ghiaccio o in una cella frigorifera per consentire alle particelle virali e alle proteine di precipitare. Più tempo si dedica all'incubazione, più particelle precipiteranno.
  11. Trasferire il contenuto di ciascun becher in bottiglie di centrifuga pulite separate e centrifuga a 15.000 x g a 4 °C per 30 minuti per recuperare un pellet di particelle PEG. Scartare il surnatante.
  12. Raschiare con cura il pellet di particelle PEG dai lati della bottiglia e risospenderlo in volumi minimi di 1x tampone TES all'interno di becher puliti aggiungendo lentamente piccole quantità di TES ai pellet (circa 10 ml per 100 api originali).
  13. Passare il pellet sospeso attraverso un ago da 18 G almeno dieci volte prima di aliquotarlo in tubi centrifughi da 2 ml. Tenere tutti i tubi sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per le 4.14.
  14. Centrifugare tubi da 2 mL a 13.000 x g a 4 °C per 15 minuti per rimuovere ulteriore PEG. Trasferire il surnatante in un altro tubo centrifugo da 2 mL utilizzando una pipetta da 1.000 μL e ripetere la fase di centrifugazione per garantire la completa rimozione di tutti i PEG.
  15. Concentrare le particelle rimanenti all'interno del surnatante in nuovi tubi centrifughi utilizzando unità filtranti centrifughe (cutoff 100 kDa) tramite diversi cicli di centrifugazione a 14.000 x g a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti ciascuno fino a raggiungere circa un quinto della concentrazione originale (10 mL di soluzione particella-TES a circa 2 ml di particelle concentrate). Le unità filtranti sono disponibili in diverse dimensioni; selezionare il più appropriato per il numero di campioni in lavorazione. Le unità che si adattano a tubi conici di dimensioni 15 mL sono solitamente le più appropriate.
  16. Risospesso le particelle concentrate passando attraverso un ago ipodermico da 26 G e centrifuga a 14.000 x g a RT per 5 minuti per un ultimo ciclo di rimozione del PEG. Se il fluido è ancora torbido, ripetere fino a rimuovere tutto il precipitato PEG.
  17. Aliquotare il surnatante viscoso nelle quantità desiderate e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.

5. Estrazione e quantificazione dell'RNA virale

  1. Estrarre l'RNA da api intere o particelle virali concentrate utilizzando qualsiasi metodo di estrazione dell'RNA appropriato (ad esempio, reagente di estrazione trIzol RNA seguito da trattamento con DNasi).
  2. Quantificare i titoli dei virus nell'inoculo generati nella fase 5.1 tramite RT-qPCR, preferibilmente utilizzando un metodo basato su curve standard che non si basa sull'espressione genica dell'ospite18, sebbene altri metodi possano anche consentire stime.

6. Biotest di alimentazione virale

  1. Preparare tutti i materiali necessari per il biodosaggio prima della fase di raccolta del telaio (6.2) o durante il periodo di emergenza delle api di 24 ore (6.3).
    1. Preparare gabbie pulite o altri involucri in grado di ospitare il numero di api necessarie per il biodosaggio (ad esempio, gabbie per scatole acriliche che misurano 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) tappando tutti i fori dell'alimentatore con un tubo centrifugo di dimensioni appropriate (Figura 3). Determinare e randomizzare i trattamenti tra le gabbie ed etichettare ciascuno con il trattamento designato per un facile riferimento futuro.
    2. Preparare i vassoi per inoculi etichettando le singole imbarcazioni di medie dimensioni con la gabbia e il trattamento corrispondenti.
    3. Preparare la soluzione di alimentazione mescolando la quantità appropriata di saccarosio con acqua deionizzata (ad esempio, 300 g di saccarosio per 1 L di acqua per una soluzione di saccarosio al 30%), assicurandosi di sterilizzare l'acqua prima e dopo l'aggiunta di saccarosio. La soluzione sterile di saccarosio può essere conservata in frigorifero a 4 °C per diverse settimane, ma deve essere eliminata in caso di torbidità.
    4. Preparare i tubi di alimentazione riempiendo parzialmente 15 mL di tubi di centrifuga con soluzioni di alimentazione prodotte in 6.1.3, invertendoli e praticando 1-2 fori attorno alla punta del tubo con una puntina. I fori possono anche essere sciolti utilizzando un ago ipodermico da 18 G riscaldato su una fiamma. Assicurati che i tappi dei tubi di alimentazione siano avvitati molto strettamente poiché i tappi larghi possono causare perdite lente che annegheranno gli abitanti della gabbia durante la notte.
      NOTA: le soluzioni di alimentazione e il volume del tubo di alimentazione possono essere regolati in base alle esigenze sperimentali.
    5. Preparare una raccolta ricettiva per le api appena emerse rivestendo leggermente i bordi di una grande vasca con olio vegetale o una sostanza grassa simile. Separatamente, preparare diverse piccole tazze usando lo stesso metodo di rivestimento.
  2. Seleziona e rimuovi i fotogrammi di covata delle api da miele sull'orlo dell'eclosione provenienti da almeno tre alveari separati. Le api opportunamente invecchiate assomigliano ad adulti completamente pigmentati sotto il cappuccio delle cellule del pettine. Un segno sicuro di emergenza in corso è osservare gli abitanti delle cellule che masticano lentamente la loro via d'uscita e / o le cellule recentemente svuotate con caratteristici segni di masticazione frastagliati lungo il tappo di cera.
    NOTA: la quantità esatta di fotogrammi richiesti dipenderà dalle dimensioni dell'esperimento, dalla quantità di covata emergente per fotogramma e dal periodo dell'anno. Un telaio profondo Langstroth standard contiene ~ 3.000 celle a pettine per lato; un telaio contenente pupe per lo più coperte, con alcune emergenti osservate può facilmente produrre oltre 400 api in 24 ore. Regolare per tutta la stagione, se necessario.
  3. Spazzolare via tutte le api adulte prima di posizionare i telai in scatole di emergenza e trasferirli in un'incubatrice che corrisponda alle condizioni interne di un alveare (34 ° C e 50% RH). Lascia che le api emergano per 24 ore.
  4. Rimuovere le scatole di emergenza dall'incubatrice e spazzolare tutte le api appena emerse nella vasca di raccolta. Assicurati di rimuovere tutte le api anche dalle scatole di emergenza per evitare l'inclusione di api invecchiate in modo errato in eventuali spazzolature successive. Qualsiasi ape in grado di volare è emersa > 24 ore fa e dovrebbe essere esclusa dal biotest.
  5. Produrre una miscela omogeneizzata di api appena emerse mescolando delicatamente le api nella vasca di raccolta a mano (non possono pungere a questa età) per ridurre al minimo gli effetti genetici dell'alveare da ogni singola colonia. Per applicazioni specifiche, possono essere auspicabili altre disposizioni per la fonte della colonia.
  6. Conta 35 singole api, mettendole nella stessa tazza unta prima di trasferire il contenuto in una gabbia acrilica. In alternativa, potrebbe essere più facile separare multipli più piccoli di api in diverse tazze unte (ad esempio, 5 tazze di 7 api ciascuna) per evitare errori di conteggio errato. Il numero di api utilizzate può essere variato in base alle esigenze e alle applicazioni.
  7. Trasferire le gabbie delle api in un incubatore (34 °C e 50% RH), assicurandosi di seguire l'ordine di posizionamento randomizzato creato in 6.1.1 per ridurre al minimo eventuali effetti microclimatici.
  8. Preparare lo spazio di lavoro per il lavoro sui virus pulendo tutte le superfici e le pipette con acqua candeggina, etanolo e soluzione inattivante RNasi prima di iniziare. Assicurati di indossare guanti di nitrile ogni volta che maneggia particelle virali.
  9. Preparare l'inoculo virale della concentrazione desiderata scongelando una quantità adeguata di particelle virali concentrate (fase 4.17) e mescolando accuratamente con una soluzione di saccarosio sufficiente (fase 6.1.3) in un contenitore sterile. Per le gabbie di 35 api, ognuna richiede 600 μL di inoculo. Le diluizioni seriali sono raccomandate se la concentrazione di virus desiderata è pari o inferiore allo 0,1%.
    1. Ad esempio, un esperimento che coinvolge 40 gabbie che necessitano tutte di un inoculo virale all'1% richiederà 24 mL di soluzione virale, che può essere creata combinando 240 μL di particelle virali concentrate con 23,76 mL di soluzione di saccarosio. Si raccomanda di includere circa il 15% di eccedenza nel volume iniziale poiché alcune perdite sono prevedibili con liquidi viscosi.
  10. Disporre i vassoi per inoculo preparati al punto 6.1.2 ordinati per tipo di trattamento e pipettare 600 μL dell'inoculo appropriato su ciascun vassoio.
    1. Inserire con cura i vassoi dell'inoculo nelle gabbie corrispondenti, facendo attenzione a non rilasciare accidentalmente le api. Cogli l'occasione per scansionare le api e sostituire quelle che potrebbero essere morte nel processo di trasferimento.
  11. Consentire il consumo completo dell'inoculo (circa 12-14 ore) prima di rimuovere i tubi della centrifuga che bloccano il foro di alimentazione superiore inserendo gli appositi tubi di alimentazione preparati al punto 6.1.4. Ciò aiuta a garantire che le api nella gabbia condividano l'inoculo in modo uniforme in tutta la popolazione. La soluzione di saccarosio viene fornita ad libitum e i tubi devono essere riempiti secondo necessità nel corso dell'esperimento.
  12. Registrare la mortalità all'interno di ciascuna gabbia a intervalli di 12 ore per le prime 72 ore di ciascun esperimento, a seguito delle quali spostare la registrazione a intervalli di 24 ore. Rimuovi le api morte dalle gabbie per aumentare la facilità dei conteggi futuri facendo scorrere la porta della gabbia abbastanza lontano da consentire a un paio di pinze di raggiungere e raccogliere le api morte. Assicurati di sterilizzare la pinza su una lampada ad alcool tra le gabbie per prevenire la contaminazione virale incrociata.
  13. Campione di api per la misurazione del titolo virale (5.1-5.2) selezionando a casaccio campioni vivi all'interno di ciascuna gabbia e collocandoli in tubi centrifughi su ghiaccio secco. In genere, tre api sono sufficienti per produrre misurazioni del titolo virale in un dato punto temporale senza spopolare anche la gabbia.
  14. Continuare le misurazioni regolari della mortalità per tutto il tempo necessario.

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Risultati

Seguire con successo i protocolli (Figure 1) per l'iniezione pupale e l'estrazione virale dovrebbe produrre grandi quantità di particelle virali. Tuttavia, il campionamento e l'iniezione di pupe provenienti da una varietà di colonie in più punti temporali massimizza le possibilità di acquisire virus bersaglio con bassa contaminazione. La dinamica con cui i virus si replicano e interagiscono tra loro all'interno di un'ape mellifera non è ben compresa; accoppiato con la probabilità di infezione preesistent...

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Discussione

Qui abbiamo delineato metodi che descrivono in dettaglio ogni fase del processo di amplificazione del virus e di preparazione dello stock di inoculo, compresa la raccolta delle larve e la propagazione, l'estrazione e la concentrazione del virus, nonché il trattamento virale sotto forma di esperimenti di alimentazione in gabbia. Questi metodi consentono la produzione di particelle virali semi-pure (Figura 4), la cui efficacia può essere costantemente quantificata mediante test di mortalità do...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare la dott.ssa Julia Fine per le sue idee e discussioni durante il processo di creazione del protocollo, così come la dott.ssa Cassondra Vernier per i suoi utili commenti durante l'editing. Questi materiali hanno contribuito a progetti che sono stati sostenuti in parte dalla Foundation for Food and Agriculture Research, nell'ambito della sovvenzione ID 549025.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
di candeggina al 10%
Cloroformio:alcool isoamilicoSigmaAldrichC0549
di etanolo
Gabbie per biotestA seconda della configurazione sperimentale
Combitips Advanced 0,1 mLEppendorf30089405Opzionale (se non è disponibile alcun apparecchio iniettore)
Contenitori per l'autorimozioneDovrebbe misurare circa 19" x 9-1/8" (dimensioni del telaio profondo Langstroth)
Pinzesmussate e morbide per la separazione larvale; pinze smussate e dure per l'escissione delle pupe
Cappa
IncubatriceIn grado di mantenere 34 º C e 50% di umidità relativa
KimwipesFisher Scientific06-666Qualsiasi salvietta assorbente funzionerà
BarcheFungono da vassoi per inoculo
Microcon-100kDa con membrana BiomaxMilliporeSigmaMPE100025
NaCl
Phosphate
soluzione salina tamponata PBSSimmaAldrichP5119
Polietilenglicole 8000 (PEG)SigmaAldrich1546605
Centrifugacapace di 15.000 x g
Centrifugacapace di 21.000 x g
Ripetitore M4 MultipipettaEppendorf4982000322Opzionale (se non è presente alcun iniettore ThermoFisher
7000TS1
Acqua senza RNAsiSigmaAldrichW4502
Saccarosio
TESSigmaAldrichT1375
Soluzione Soluzione al 70% larvale aspirante di peso medio Guanti in nitrile refrigerata da banco refrigerata

Riferimenti

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