Separazione meccanica e solubilizzazione proteica dei sottostrati perivitellini esterni ed interni dalle uova di gallina

Summary

Questo articolo riporta un metodo semplice per isolare i sottostrati perivitellini esterni ed interni delle uova di gallina riducendo al minimo l'alterazione strutturale e per ottimizzare la solubilizzazione proteica di ogni sottostrato per analisi proteomiche.

Abstract

Lo strato di perivitellina che circonda il tuorlo d'uovo gioca un ruolo fondamentale nella fecondazione, nella difesa delle uova e nello sviluppo dell'embrione aviario. È formato da due sottostrati proteici strettamente associati e formati da distinti organi riproduttivi femminili. Si presume che entrambe le strutture abbiano le proprie specificità funzionali, che rimangono da definire. Per caratterizzare la funzione delle proteine che compongono ogni sottostrato, la prima sfida è stabilire le condizioni che consentirebbero la separazione meccanica di questi due strati intricati, limitando al contempo eventuali danni strutturali. Il secondo passo è ottimizzare le condizioni sperimentali per facilitare la solubilizzazione proteica da questi due sottostrati, per successive analisi biochimiche. L'efficienza di questo approccio viene valutata analizzando il profilo proteico di ogni sottostrato da sodio Dodecil Solfato-Poli-acrilammide Gel Elettroforesi (SDS-PAGE), che dovrebbe essere distinto tra le due strutture. Questa procedura in due passaggi rimane semplice; richiede attrezzature biochimiche classiche e reagenti; ed è compatibile con un'ulteriore proteomica approfondita. Può anche essere trasposto ad altre uova aviari per la biologia comparativa, sapendo che la struttura e la composizione dello strato perivitellino hanno caratteristiche specifiche della specie. Inoltre, le condizioni di non denaturazione sviluppate per la separazione dei sottostrati (fase 1) consentono le loro analisi strutturali mediante microscopia elettronica a scansione e trasmissione. Può anche costituire il primo passo per la successiva purificazione proteica per analizzare le rispettive attività biologiche e la struttura 3D, o per eseguire ulteriori analisi immunoistochimiche o funzionali. Tali studi aiuterebbe a decifrare la funzione fisiologica di questi due sottostrati, le cui integrazioni strutturali e funzionali sono criteri determinanti del successo riproduttivo.

Introduction

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un protocollo che consenta la successiva caratterizzazione biochimica dello strato di perivitellina (PL), un sottile strato proteico che racchiude il tuorlo d'uovo e svolge un ruolo fondamentale nella riproduzione delle specie aviaari. Il PL, chiamato anche "membrana vitellina" in letteratura, è una rete tridimensionale di fibre spesse composta da diversi tipi di glicoproteine. Consiste in uno strato interno di perivitellina (IPL) (a contatto con il tuorlo) che viene assemblato nell'ovaio, e di uno strato esterno di perivitellina (OPL, a contatto con il bianco), sdraiato sull'IPL (Figura 1) e prodotto dall'infundibulum. Quest'ultimo tessuto è il segmento superiore simile a un imbuto dell'ovidotto che riceve il follicolo tuorlo maturo dopo l'ovulazione e il sito in cui avviene la fecondazione. La secrezione di OPL avviene dopo questi due eventi ed è seguita dal successivo deposito dell'albume d'uovo e del guscio d'uovo in altri segmenti specifici dell'ovidotto. Le funzioni fisiologiche del PL non sono legate solo alla fecondazione e alle prime fasi dell'embriogenesi, ma anche alla protezione fisica e molecolare dell'embrione. L'analisi proteomica dell'uovo di gallina eseguita su tutto il PL ha rivelato la presenza di 137 diverse proteine¹, ma la distribuzione della maggior parte di queste proteine tra IPL e OPL rimane da chiarire. La quantità minima di dati disponibili nel rapporto di letteratura che IPL e OPL mostrano profili proteici^{molto distinti 2,3,4}, che suggerisce diverse proprietà strutturali e funzionali. La relativa scarsità di dati sulla distribuzione delle proteine tra OPL e IPL è probabilmente dovuta alla difficoltà di separare entrambi i sottostrati sottili e incorporati.

Il metodo qui presentato descrive le condizioni da utilizzare per separare i due sottostrati con un impatto limitato sulla loro rispettiva struttura istologica preservando il loro contenuto proteico e per fornire il protocollo che consenta la completa solubilizzazione delle proteine per successive analisi da parte della proteomica. Comprende due fasi principali: 1) campionamento PL e separazione OPL/IPL e 2) trattamento PL, OPL e IPL per solubilizzazione proteica ed elettroforesi per l'analisi della spettrometria di massa. Il flusso di lavoro è presentato nella figura 2. Notevolmente, sebbene il presente protocollo sia stato ottimizzato per le analisi proteomiche (fase 2.2), esso può essere interrotto in alcuni passaggi per le analisi istologiche (ad esempio, microscopia elettronica), immunoistochimica, studi funzionali (fase 1) e per la purificazione delle proteine solubili in sale al fine di caratterizzarne la struttura e l'attività biologica (fase 2.1)(figura 2).

Il primo passo è la rimozione del PL totale dal tuorlo d'uovo(Figura 2,passo 1.1). Tutti i metodi pubblicati iniziano con la separazione dell'albume dal tuorlo manualmente o utilizzando un separatore di uova. È seguito dalla rimozione dell'albume rimanente e delle chalazae spesse con forcelle o dall'adsorbimento su una carta da^{filtro 5} (Figura 2A). Successivamente, le tecniche selezionate per campionare pl sono variabili a seconda degli articoli pubblicati. Alcune carte includono diversi lavaggi del tuorlo, in acqua deionizzata o distillata^1,5,6, in soluzione salina da 0,85 a 1%^2,7,8, in soluzioni tampone come 0,15 M NaCl/N-[Tris(idrossimetil)metil]-2-amminoetanosolfonico, pH 7,4⁴o in HCl 0,01N (pH 2)³. Queste procedure sono state applicate a pollo, anatra, fagiano dal collo ad anello, pernice grigia, pappagallo cacatua, piccione domestico o uova di ratiti^2,6,9. La rimozione del PL mentre il tuorlo d'uovo viene mantenuto in una piastra di Petri senza soluzioni acquose può essere molto laboriosa in quanto il PL è fragile e il tuorlo d'uovo tende ad attenersi a PL^1,5 e quindi rimane difficile da eliminare in seguito. Anche l'uso di tampone acido o soluzione per un'ora a 37 °C³ non è preferito in quanto tali condizioni possono alterare la struttura pl e possono causare la perdita di proteine. È anche importante rimuovere l'area contenente il disco germinale in quanto è probabile che questa zona abbia un modello strutturale e molecolare distinto, che non riflette l'intero PL^4,6,10 ( Figura2B). Questo metodo sfrutta le idee evidenziate da alcuni articoli pubblicati e propone alcuni miglioramenti per facilitare il campionamento pl preservandone l'integrità (Figura 2C).

Il secondo passaggio consiste nel separare i due sottolivello (Figura 2, passaggio 1.2). Questo passaggio è fondamentale in quanto OPL e IPL sono strettamente legati l'uno all'altro. Questo passaggio deve essere condotto con attenzione con le forcep al microscopio di sezionazione binoculare. Le pubblicazioni che riportano la separazione OPL/IPL^{sono piuttosto limitate 2,3,7,11} e alcune di esse utilizzano condizioni specifiche (tampone acido a 37 °C per 1 h^2,3) che possono influenzare la struttura istologica dei sottostrati e/o contribuire alla perdita di proteine o contaminazioni di tuorlo o bianco. Per distinguere meglio l'OPL dall'IPL, alcuni autori hanno riportato l'uso del blu toluidina per colorare leggermente l'OPL (lo strato interno rimane incolore)¹¹. Nel metodo sviluppato, abbiamo ottimizzato le condizioni in modo che la separazione sia facilmente raggiungibile e non richieda l'uso di alcun colorante (Figura 2D).

Il secondo passo principale è la solubilizzazione delle proteine che compongono ogni sottostrato. Classicamente, si ottiene mescolando liofilizzato pulito^1,essiccato^2,6,o preparato al momento^3,4,11 PL / sottostrati direttamente con il tampone Laemmli utilizzato per l'elettroforesi. Altri autori hanno preferito una solubilizzazione preliminare degli strati in 1% NaCl, in una soluzione tamponante SDS 1%^2,3,11 o in una soluzione contenente inibitori della proteasi e SDS⁶ a temperatura ambiente o Tritone seguita da incubazione a 45 °C¹², sotto costante agitazione vigorosa. Alcuni autori hanno anche descritto un protocollo in cui il PL è stato incubato in tampone fosfato salino o urea e sottoposto a sonicazione¹³. Tutti questi trattamenti sono stati tutti seguiti da una centrifugazione e diluizione nel tampone di Laemmli e tutti condividono lo svantaggio della solubilizzazione incompleta delle proteine dagli strati poiché la materia insolubile (il pellet ottenuto dopo la centrifugazione) viene scartata dal campione da analizzare.

Inoltre, l'uso di condizioni di denaturazione (urea, detergente, alta temperatura, ecc.) da parte di alcuni autori per la solubilizzazione delle proteine non è compatibile con la successiva purificazione proteica per la caratterizzazione in quanto è probabile che inattivano irreversibilmente le proteine, interferiscano con le loro attività biologiche e compromettano anche la loro struttura 3D. Per questo specifico passaggio 2, il protocollo include un primo sottopasso che consente la solubilizzazione delle proteine più abbondanti in condizioni non denaturanti dopo la destrutturazione meccanica PL/OPL/IPL, che non interferirà con ulteriori studi sulle proteine, se necessario(Figura 2, fase 2.1), e un secondo sottopasso che consente la completa solubilizzazione delle proteine per elettroforesi e proteomica approfondita(Figura 2, fase 2.2). Esso combina suggerimenti presi da vari articoli pubblicati e adeguamenti risultanti da nuove idee convalidate da studi sperimentali.

Protocol

1.PL, IPL e OPL

1. Campionamento PL
   1. Rompere manualmente l'uovo non fecondato appena deposto e utilizzare un separatore di uova sdraiato su un bicchiere di vetro per separare il tuorlo dal bianco. Rimuovere le chalazae con piccole forbici e arrotolare il tuorlo su una carta da filtro per rimuovere l'albume aderente che appare come una struttura trasparente e visibile (Figura 2A).
      ATTENZIONE: Fare attenzione a non forare il PL con le forbici. L'uso di pinzette al posto delle forbici per rimuovere i chalaza può provocare rotture PL e successive perdite di tuorlo. Il passo di laminazione sulla carta filtrante è fondamentale e deve essere eseguito molto rapidamente a causa delle proprietà assorbenti del filtro della carta che possono innescare la rottura pl. È anche molto importante utilizzare un uovo non fecondato dal giorno della deposizione, per ottimizzare il successo di questo primo passo e di tutti i passaggi successivi. In alternativa, possono essere utilizzate uova conservate meno di 10 giorni in un ambiente raffreddato, ma gli sperimentatori devono considerare i potenziali rischi di alterazioni del PL.
   2. Immergere il tuorlo in un cristallizzatore contenente 10 mM Tris-HCl pH 8 che è stato precedentemente raffreddato fino a 4 °C e rimuovere l'area PL sul disco germinale all'interno di una zona di 1 cm utilizzando forbici smussate(Figura 2B).
      NOTA: Inizialmente, PL era immerso in acqua deionizzata, ma questo approccio presenta alcuni svantaggi, come la mancanza di controllo del pH e le difficoltà di separare successivamente i sottostrati (fase 1.2). Pertanto, sono state testate diverse condizioni, tra cui la concentrazione di Tris(figura 3A)e il pH(figura 3B). L'uso di un tampone a pH 8, invece di acqua deionizzata o demineralizzata, è in accordo con la fisiologia delle uova (il pH dell'albume è di circa 7,8 il giorno della deposizione)¹⁴ e riduce al minimo la perdita di proteine. Al contrario, si sospetta che il pH acido o molto alcalino innescherà la destrutturazione pl e la solubilizzazione precoce delle proteine (Figura 3B). Il tampone composto da 10 mM Tris-HCl pH 8 è risultato ottimale, in quanto rispetta la fisiologia delle uova e non causa una significativa solubilizzazione proteica (la concentrazione proteica nel tampone di lavoro rimane minima, Figura 3A,B).
   3. Rompono il PL con piccole forbici nel tampone. Tenere i due bordi del PL rotto con le forcep e staccare il PL dal tuorlo.
   4. Mantenere il PL con pinza e sciacquare il PL più volte in diversi bagni di Tris-HCl da 10 mM, pH 8 fino a quando non è visibile alcuna traccia di tuorlo. In questa fase, assicurarsi che il PL sia pulito, bianco e fluttuante nel buffer. Può essere lavorato al passaggio 1.2 per la separazione del sottostrato o direttamente al passaggio 2.1 per le analisi biochimiche.
2. Campionamento OPL e IPL
   1. Stendere l'intero campione pl mettendo OPL verso l'alto in una piastra di Petri di plastica e mantenendolo piatto con meno rughe possibili. Coprire il campione con 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Utilizzare una piastra di Petri in plastica (e non vetro) per limitare i movimenti PL, perché PL si attacca meglio alla plastica.
      1. Per individuare il lato OPL, esaminare dove si trova la posizione delle chalazae rimanenti collegate all'OPL e non all'IPL. Questo passaggio richiede una piccola concentrazione di NaCl (50 mM) per facilitare la separazione del sottostrato.
         NOTA: Sulla base del grafico presentato nella figura 3C e nella^{letteratura 11}, questa concentrazione non dovrebbe portare a gravi perdite proteiche. Inizialmente, l'acqua deionizzata è stata utilizzata per separare i sottostrati, come descritto in^{precedenza 1,5,6}, ma questa tecnica è risultata molto laboriosa e ha portato all'alterazione dell'integrità strutturale del PL. Pertanto, diverse concentrazioni di NaCl (Figura 3C) sono state testate in quanto il sale ha facilitato la separazione dei due sottostrati. Tuttavia, è degno di nota il fatto che l'uso della concentrazione di NaCl >100 mM aumenti la solubilizzazione/rilascio proteico dal PL, che non è l'obiettivo qui (questo sarà l'obiettivo nella fase 2)(Figura 3C). L'aggiunta di NaCl da 50 mM al tampone pH 8 Tris-HCl da 10 mM facilita la separazione dei due sottostrati e riduce al minimo la perdita proteica.
   2. Tagliare il PL totale in pezzi di circa 2 cm x 3 cm con piccole forbici. Separare meccanicamente i due strati di ciascun pezzo PL con forcep di punta ultra precise sotto un microscopio binoculare (Figura 4). Conservare i campioni IPL e OPL risultanti singolarmente in microtubi a -80 °C, fino a un ulteriore utilizzo.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Va notato che l'efficienza e la facilità di separazione dei due strati dipendono notevolmente dalla freschezza dell'uovo. Infatti, le uova immagazzinate mostrano drastiche modifiche interne dovute al rapido aumento del pH dell'albume d'uovo e alla successiva alterazione dell'indice di tuorlo a causa dell'allentamento (e indebolimento) del PL. L'IPL è più fragile rispetto all'OPL. È quindi preferibile posizionare la faccia dell'OPL sopra e separare i due sottolivello tirando su OPL con le forcep. Entrambi i sottostrati dovrebbero essere maneggiati con cura preziosa.

2. Trattamento del campione per la solubilizzazione delle proteine e analisi SDS-PAGE

1. Solubilizzazione primaria delle proteine
   1. Congelare singolarmente campioni IPL e OPL. Una volta completata la liofilizzazione, tagliare approssimativamente 1 mg da ogni campione in microtubi puliti che possiedono un tappo a vite a prova di perdite. Conservare i campioni rimanenti in tubi ben chiusi per una conservazione prolungata a -80 °C.
      NOTA: L'uso di microtubi con tappo a vite a prova di perdite garantisce una chiusura ermetica e a prova di perdite per prevenire la reidratazione del campione e che proteggerà i campioni.
   2. Mescolare 1 mg di ogni sottostrato lyofilizzato con 400 μL di 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Utilizzare un miscelatore-mulino per 2 volte per 5 minuti a 30 Hz per disintegrare le strutture OPL e OPL in microparticelle e facilitare la solubilizzazione delle proteine. Raccogliere 400 μL dei campioni contenenti l'OPL e l'IPL in due microtubi puliti.
      NOTA: Il tampone qui utilizzato è stato scelto per aumentare la solubilizzazione proteica (a differenza del passaggio 1). Questo tampone si è basato sui risultati presentati nella figura 3, che mostrano un aumento della solubilizzazione delle proteine a pH 7 (Figura 3B) e utilizzando 0,5 M NaCl (Figura 3C). Il protocollo può essere messo in pausa qui. In questa fase, i campioni possono essere utilizzati per la purificazione proteica delle principali proteine PL o trasformati al passaggio 2.2.
2. Solubilizzazione proteica per elettroforesi
   1. Aggiungere 5x tampone campione SDS-PAGE (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% blu bromofenolo, 50% glicerolo, 5% SDS, 5% beta-mercaptoetanolo, pH 6,8) a ciascuno 400 μL del campione e calore a 100 °C per 5 min.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a -80 °C. In questa fase del protocollo, OPL e IPL sono completamente sciolti. L'efficienza della solubilizzazione del campione può essere valutata centrifugando campioni per 5 min a 10.000 x g. La solubilizzazione completa è caratterizzata da un'assenza di pellet visibile dopo la centrifugazione. Pertanto, dopo la completa solubilizzazione, si considera qui che 1 mg di sottostrato lyophilized corrisponde a 1 mg di proteine (la concentrazione proteica nel campione di 500 μL è di 2 mg/mL). Infatti, PL è composto da oltre l'80% di proteine^2,15. L'uso di un buffer di campioni 5x limita la diluizione del campione, ma è anche possibile utilizzare un buffer di esempio 1x o 2x.
   2. Caricare un massimo di 20 μg di proteine/corsia su un gel di poliacrilammide SDS (gel gradiente 4%-20%) ed eseguire l'elettroforesi a 120 V utilizzando un sistema di elettroforesi verticale.
      NOTA: L'uso di un gel gradiente 4%-20% non è obbligatorio, ma è preferibile qui in quanto OPL e IPL mostrano proteine con pesi molecolari che vanno da <10 kDa a >250 kDa. Potrebbe anche essere utile mantenere il gel impilabile (che di solito viene rimosso), poiché la presenza di proteine insolubili o aggregati proteici sul fondo dei pozzi indicherebbe una scarsa solubilizzazione e un possibile passo mancante durante la preparazione del campione.
   3. Dopo l'elettroforesi, rimuovere i gel dalle piastre di vetro e macchiare con la soluzione Coomassie Brilliant Blue (50% H₂O, 40% EtOH, 10% acido acetico e R250 Coomassie Brilliant Blue) per 30 min.
   4. De-macchia con una soluzione composta per il 50% da H₂O, 40% EtOH, soluzione di acido acetico al 10% fino a quando lo sfondo del gel appare azzurro.
   5. Infine trasferire il gel in piastre di Petri contenenti acqua deionizzata, per ottenere la de-colorazione e la reidratazione dei gel di poliacrilammide. Le proteine dovrebbero apparire come bande blu di uno sfondo trasparente.

Results

OPL e IPL sono stati separati dal PL di un uovo non fecondato appena deposto per analizzare i loro profili proteici da SDS-PAGE. Il flusso di lavoro sperimentale dell'intero protocollo è illustrato nella figura 2. La figura 3 mostra il rilascio di proteine a diverse concentrazioni di Tris (Figura 3A), vari pH (Figura 3B) e diverse concentrazioni di NaCl (Figura 3C). I due sottostrati risultanti sono stati osservati alla luce del microscopio binoculare e sono mostrati nella figura 4 dove l'IPL è traslucido mentre l'OPL è denso, torbido e biancastro. Queste caratteristiche possono in parte testimoniare l'efficienza della separazione del sottolivello.

Dopo la separazione, OPL e IPL sono stati liofilizzati in modo indipendente e il loro contenuto proteico è stato completamente sciolto grazie a una combinazione di macinazione meccanica, l'uso di un detergente anionico (SDS) e un agente riducente (beta-mercaptoetanolo), seguito dall'ebollizione. Dopo la migrazione in un gel di poliacrilammide (elettroforesi SDS-PAGE), i campioni OPL e IPL presentano profili elettroforetici distinti (Figura 5), come previsto.

Figura 1: Struttura del PL di un uovo non fecondato appena deposto. Microscopia elettronica di rappresentazione schematica e trasmissione dell'intero PL in sezione trasversale (dati personali, ©Piattaforma IBiSA de Microscopie Electronique, Università e CHRU di Tours, Francia, S. Georgeault). Si noti che questa immagine è stata ottenuta da PL preparato come presentato in questo protocollo. OPL, strato esterno di perivitellina; IPL, strato interno di perivitellina. La punta di freccia nera indica la membrana continua che separa i due sottostrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro che riassume i due passaggi principali del protocollo ed esempi di applicazioni. Il protocollo è stato ottimizzato per l'analisi proteomica dei livelli PL, ma può essere interrotto in alcuni passaggi per altre applicazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Ottimizzazione della composizione tampone per il campionamento PL. In breve, il PL pulito (n = 4) è stato incubato nello stesso volume delle varie soluzioni tampone per 2 h.PL è stato rimosso e la concentrazione proteica è stata stimata misurando l'assorbanza a 280 nm nel tampone rimanente. (A) Effetto della concentrazione di Tris-HCl a pH 8. (B) Effetto del pH (da 7 a 9). (C) Effetto della concentrazione di NaCl. Da questi risultati, abbiamo concluso che il tampone composto da Tris-HCl da 10 mM, pH 8, 50 mM NaCl è il più appropriato in quanto limita la perdita proteica. I risultati sono espressi come una ± deviazione standard di quattro diversi campioni pl. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando ANOVA uni-way seguito da un test di confronto multiplo di Tukey. Il valore P <0.05 è stato considerato significativo (ns, non significativo; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratteristiche OPL e IPL al microscopio binoculare. Dopo la separazione, l'IPL (a destra) apparve traslucido e l'OPL (a sinistra) era opaco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi SDS-PAGE di OPL e IPL separati dall'uovo non fecondato appena deposto. 4%-20% gel di acrilammide seguito da colorazione blu brillante Coomassie. La massa delle bande standard di peso molecolare è indicata in kDa. Il profilo OPL composto principalmente da proteine con una massa molecolare >30 kDa mentre le bande principali rilevate sul profilo IPL hanno masse molecolari <30 kDa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il successo del presente protocollo si basa su due passaggi critici che sono stati ottimizzati in modo indipendente: la separazione meccanica di OPL e IPL che devono essere il più possibile destrutturanti, seguita dalla completa solubilizzazione proteica di ogni sottostrato, che è, al contrario, destrutturazione e denaturazione. Evidenzia inoltre alcuni punti specifici che devono essere presi in considerazione per garantire il successo di ogni fase.

Il protocollo non dipende dal colore del guscio d'uovo, dal peso delle uova, dal tipo di produzione o dal ceppo genetico della gallina. Tuttavia, dipende dalla freschezza dell'uovo. Infatti, l'uovo subisce rapidamente profonde modifiche fisico-chimiche interne dopo essere stato deposto, anche se questi cambiamenti possono essere ritardati quando lo stoccaggio viene eseguito in condizioni^{refrigerate 14,15}. La perdita di anidride carbonica attraverso i pori guscio d'uovo durante lo stoccaggio si traduce nell'aumento del pH dell'albume (da 7,8 a 9,5) mentre alcuni scambi d'acqua si verificano tra il tuorlo e il bianco, attraverso il PL. Entrambe le modifiche hanno un impatto negativo sulla struttura molecolare e istologica del PL che si indebolisce e meno tesa^14,15,probabilmente a causa di modifiche fisico-chimiche del suo contenuto^{proteico 16,17,18}. Si presume che la separazione dei sottostrati diventerà molto difficile con le uova immagazzinate soprattutto se la conservazione viene condotta per un lungo periodo a temperatura ambiente. Aggiornato, il protocollo è stato eseguito utilizzando uova conservate per meno di 4 giorni a 4 °C e la durata massima di conservazione per un uovo per campionare in modo efficiente i sottostrati PL non è ancora nota. Inoltre, se l'obiettivo è l'analisi di ogni sottostrato, è fondamentale utilizzare uova non fecondate. Il giorno della deposizione, l'embrione di un uovo fecondato ha 23 ore e il suo sviluppo è molto rapido in seguito, se l'uovo viene incubato. Infatti, lo sviluppo embrionale e la crescita di alcune strutture extraembrioniche si espandono usando pl come substrato, che viene quindi rapidamente degradato, e sostituito dal sacco tuorlo extraembrionale¹⁹.

Dopo la separazione manuale del tuorlo e dell'albume, il tuorlo deve essere pulito dalle tracce di albume d'uovo e dalle chalazae che sono rimaste strettamente attaccate al PL. La punta è quello di arrotolare accuratamente il tuorlo su una carta da filtro e di eseguire ampi lavaggi del tuorlo in soluzioni tamponate (10 mM Tris-HCl pH 8). Il pH utilizzato per il tampone è coerente con il pH fisiologico dell'albume^{14 ed è stato dimostrato} che riduce al minimo la perdita di proteine ( Figura3). L'uso di un tampone refrigerato aiuterà quindi a rimuovere il PL dal tuorlo perché a 4 °C, il tampone faciliterà la rimozione del PL mentre il tuorlo lipidico si ritrae e diventa meno fluido a questa temperatura. Ulteriori lavaggi consentiranno la rimozione dei residui di tuorlo dal PL. È anche importante ritagliare la zona corrispondente al disco germinale perché questa struttura che contiene pronucleo femminile potrebbe non essere rappresentativa del PL. È il sito di fecondazione e moltiplicazione delle cellule embrionali quando l'uovo viene fecondato. Dovrebbe avere una composizione particolare che potrebbe non essere rappresentativa dell'intero PL, che è il motivo per cui è stato rimosso. Questo passaggio specifico è fortemente facilitato quando il tuorlo è immerso in un tampone freddo. Sebbene questa struttura del disco germinale venga scartata nel presente protocollo (fuori dagli obiettivi), analisi specifiche di quest'area nelle uova fecondate potrebbero essere molto utili per gli scienziati interessati a studiare l'evoluzione del contenuto pl (proteomica e attività) e della struttura (microscopia elettronica), durante le prime fasi dell'embriogenesi^19,20,21. In questa fase, l'intero PL è strutturalmente intatto e può essere elaborato per ulteriori analisi strutturali mediante microscopia elettronica (Figura 2), al passaggio 1.2 o al passaggio 2.1 (se l'obiettivo è analizzare l'intero PL).

Il passaggio 1.2 deve essere condotto al microscopio binoculare, poiché il PL è molto sottile e fragile (circa 10 μm di spessore). La separazione dei sottostrati è quasi impossibile in acqua o in tampone privo di sale minimo, e i primi tentativi di utilizzare queste opzioni hanno causato gravi danni da PL. Pertanto, il tampone selezionato per questo passaggio rimane a pH fisiologico (pH 8) e contiene NaCl da 50 mM. Questo passaggio è arduo e deve essere eseguito con attenzione e delicatezza per evitare lo strappo pl. Una volta separati, i due sottostrati possono essere facilmente identificati in quanto presentano caratteristiche fisiche peculiari (opache rispetto a traslucide). La mancanza di omogeneità dell'IPL alla luce del microscopio dovrebbe riflettere una separazione incompleta e quindi la presenza delle restanti macchie di OPL presenti sull'IPL. Inoltre, è molto difficile trattare l'intera membrana e l'uso di pezzi di 2 cm x 3 cm aumenta notevolmente le possibilità di successo. Il sottostrato risultante ottenuto è adatto per lo studio istologico mediante microscopia elettronica (Figura 1). È degno di nota che una specifica struttura lineare (spessa da 0,05 a 1 μm) chiamata membrana continua (CM) sia visibile sulla micrografia(Figura 1)e rimanga solitamente attaccata all'uno o all'altro sottostrato durante il processo di separazione. È stato precedentemente pubblicato che quando si utilizza una molarità salina relativamente elevata per la separazione (500 mM), il CM è rimasto attaccato all'OPL^{7 mentre} l'uso^{dell'acqua 5} favorirà l'attacco di CM all'IPL. In questo protocollo, una bassa molarità del sale viene utilizzata per raggiungere gli obiettivi specifici (sottostrato PL strutturalmente intatto e perdita minima di proteine), il che significa che questo CM è probabilmente associato all'IPL. Tuttavia, un'ulteriore analisi dell'IPL e dell'OPL mediante microscopia elettronica a trasmissione indicare chiaramente questa ipotesi. Strati di PL, OPL o IPL ottenuti alla fine del passaggio 1 possono anche essere utilizzati per saggi in vitro per analisi di legame sperma-uovo^{22 o} per analizzare le prime fasi dello sviluppo embrionale^23,24.

Il passaggio 2 si riferisce alla solubilizzazione del contenuto proteico, parzialmente (fase 2.1) o completamente (fase 2.2). PL e/o OPL vengono prima lyophilizzati per rimuovere le molecole d'acqua e consentire misurazioni precise del peso. Infatti, pl è composto principalmente da acqua (88%) 7 ,^mentrela sostanza secca contiene essenzialmente proteine (dall'80% al 90% a seconda degli studi), carboidrati, grassi e minerali^2,7,25. Considerando che l'acqua contenuta nel PL viene rimossa mediante liofilizzazione, che i carboidrati sono essenzialmente recuperati nelle glicoproteine PL e che il grasso e i minerali provengono dal tuorlo sono essenzialmente scartati da lavaggi estesi, si presume che il PL risultante sia composto quasi esclusivamente da proteine. Pertanto, il valore di peso ottenuto dopo la completa lofilizzazione dovrebbe corrispondere principalmente alle proteine. La stessa quantità di PL, OPL e/o IPL viene quindi diluita nel buffer contenente 0,5 M NaCl. L'elevata molarità salina combinata con la distruzione meccanica della rete fibrosa mediante macinazione facilita notevolmente la solubilizzazione delle proteine in condizioni di non denaturazione. Questo passaggio è seguito dalla completa solubilizzazione con ebollizione, detergente SDS e beta-mercaptoetanolo riducente (fase 2.2). Infatti, alcune proteine IPL sono glicoproteine solubili in SDS^25,26,27 e i principali costituenti dell'OPL sono nacl solubili^1,11. Usando questo protocollo, non abbiamo visto alcun pellet rimanente di proteine insolubili dopo la centrifugazione, il che indica che la solubilizzazione era probabilmente completa. Le proteine di PL, OPL e/o IPL sono state quindi analizzate da SDS-PAGE. I profili proteici risultanti sono coerenti con la^{letteratura pubblicata 2,4,11,16}, ma la risoluzione e l'intensità del segnale è altamente migliorata e molto più omogenea tra vari campionamenti indipendenti IPL e OPL.

Inoltre, il confronto quantitativo tra OPL e IPL è reso possibile grazie all'accuratezza del peso che abbiamo dedotto per i rispettivi sottolivetti^2,7. Inoltre, sia i profili OPL che IPL sono molto distinti e ad eccezione di una banda debole a 14 kDa e 75 kDa, entrambi i sottostrati PL non condividono visibilmente bande che mostrano lo stesso peso molecolare. Questa osservazione conferma l'efficienza della separazione dei sottostrati senza una contaminazione incrociata significativa. Secondo l'unica analisi proteomica PL^{pubblicata 1}, le bande più intense in OPL (<30 kDa) dovrebbero corrispondere al lisozima (14 kDa), alla proteina dello strato esterno della membrana vitellina 1 (17 kDa), beta-def aviariaensina 11 (peso molecolare apparente di 12 kDa), mentre le bande intense di IPL (>30 kDa) sono probabilmente la proteina Zona-Pellucida 1 (102 kDa) e la proteina Zona-Pellucida 3 (47 kDa). La distribuzione delle abbondanti proteine PL ovotransferrina (78 kDa), proteina X correlata all'ovobumina (45 kDa), ovalbumina (43 kDa)¹ tra i sottostrati deve ancora essere chiarita. In effetti, l'alto peso molecolare di queste proteine (>30 kDa) suggerisce che sono proteine IPL basate sul profilo SDS-PAGE, ma la loro specificità tissutale (proteine espresse da ovidotto) preferirebbe associare queste proteine a OPL^28,29. Inoltre, alcuni hanno suggerito una potenziale contaminazione dei campioni di PL da parte di proteine dell'albume d'uovo e del tuorlo d'uovo a causa di lavaggi^{insufficienti 1}. Questa mancanza di informazioni è la base per lo sviluppo del presente protocollo, che sarà ulteriormente utilizzato per la proteomica quantitativa approfondita di PL, OPL e IPL.

In alternativa, dal passaggio 2.1 e dopo la centrifugazione per rimuovere la materia insolubile, è possibile estrarre alcune proteine specifiche per un'ulteriore caratterizzazione biochimica e biologica. Tale approccio è stato recentemente applicato per caratterizzare le attività biologiche e/o la struttura 3D dei due componenti principali dell'OPL, la proteina dello strato esterno della membrana vitellina 1 (VMO1) e la beta-defensina aviaria 11 (AvBD11)^30,31. La disponibilità di queste proteine come molecole purificate può anche aiutare a produrre anticorpi specifici per ulteriori esperimenti come l'immunoistochimica o per lo sviluppo di saggi quantitativi, inclusi i test immunoassorbenti legati agli enzimi.

I due principali limiti di questo protocollo sono (1) la sfida con la separazione dei sottostrati, specialmente se le uova sono state immagazzinate più di 4 giorni a 4 °C e (2) il fatto che la solubilizzazione completa delle proteine richiede tamponi di riduzione e denaturazione, che compromettono l'attività biologica intrinseca dei campioni risultanti. Per quanto riguarda la prima limitazione, la separazione meccanica richiede competenze tecniche ma è facilmente raggiungibile dopo 2 o 3 corsi di formazione sperimentali. Alcuni piccoli pezzi IPL potrebbero rimanere attaccati all'OPL e viceversa poiché entrambi i sottolivello sono strettamente associati. Tuttavia, la contaminazione di un sottolivello da parte dell'altro dovrebbe essere minima se la separazione meccanica viene eseguita con cautela. I profili tipici IPL e OPL SDS-PAGE dopo una separazione ottimale del sottolivello sono illustrati nella figura 5. Per quanto riguarda la seconda limitazione, le fasi sperimentali presentate in questo articolo sono state ottimizzate per le analisi proteomiche, al fine di fornire un elenco esaustivo delle proteine che compongono ogni sottostrato. Per un'ulteriore caratterizzazione delle attività biologiche di ciascuna proteina, è necessario fermarsi al passaggio 2.1.2, prima di utilizzare condizioni di denaturazione (fase 2.2.1, uso del tampone con SDS e beta-mercaptoetanolo seguito dall'ebollizione). Tuttavia, è degno di nota che le proteine risultanti dal passo 2.1.2 siano solo proteine solubili in sale mentre le proteine insolubili al sale formano aggregati. Un'opzione per valutare ulteriormente la loro rispettiva attività può essere quella di produrre proteine insolubili al sale come proteine ricombinanti utilizzando sistemi eterologi(E. coli,baculovirus, lievito, ecc.).

Questo protocollo può essere adattato ad altre uova aviari per studi comparativi per apprezzare meglio l'originalità di ciascuna specie. Infatti, PL mostra alcune specificità degli uccelli sia strutturalmente che in termini di composizione proteica, probabilmente dovute all'adattamento a nuovi ambienti ma anche alle specificità^{dello sviluppo 2,6,9,32}. Lo sviluppo di questo protocollo che richiede una tecnica moderata e attrezzature / materiali classici apre nuove vie di ricerca nel campo della riproduzione degli uccelli e degli studi di speciazione.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio binoculare da dissezione	Vision Engineering, Francia		Modello Mantis
Elite Liofilizzatore	Cryotec, Francia		Modello Cosmos 80
Cella per elettroforesi Mini-Protean II	Biorad, Hercules, USA	1652960	Qualsiasi apparecchio adattato per l'elettroforesi delle proteine
Mulino miscelatore MM400	Retsch, Hann, Germania	20.745.0001	Vibromulino adatto per la macinazione a secco, a umido e criogenica di piccole quantità di campione Forbici per
dissezione ultra fine in acciaio inox lunghezza 12 cm	Dutscher, Brumath	5066
Pinza a punta ultra precisa acciaio inossidabile antimagnetico 9,5x 109,3 mm	Dutscher, Brumath	327005