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Articolo metodologico

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

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⸱

DOI:

10.3791/61740

⸱

4 giugno 2021

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, Taipei Veterans General Hospital, National Yang-Ming University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

In questo articolo

Sommario

I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un'elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.

Abstract

Un modello ideale di ictus tromboembolico richiede determinate proprietà, tra cui procedure chirurgiche relativamente semplici con bassa mortalità, dimensioni e posizione dell'infarto coerenti, precipitazione di coaguli di sangue misto piastrino-fibrina simili a quelli dei pazienti e un'adeguata sensibilità al trattamento fibrinolitico. Il modello di ictus fototrombotico a base di colorante rosa bengala (RB) soddisfa i primi due requisiti, ma è altamente refrattario al trattamento litico mediato da tPA, presumibilmente a causa della sua composizione del coagulo ricca di piastrine, ma povera di fibrina. Ragioniamo che la combinazione di colorante RB (50 mg/kg) e una dose sub-trombotica di trombina (80 U/kg) per la fotoattivazione mirata al ramo prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA) può produrre coaguli arricchiti di fibrina e sensibili al tPA. Infatti, il modello di fototrombosi combinato con trombina e RB (T+RB) ha innescato coaguli di sangue misti piastrina:fibrina, come dimostrato dall'immunocolorazione e dagli immunoblots, e ha mantenuto dimensioni e posizioni dell'infarto coerenti, oltre a una bassa mortalità. Inoltre, l'iniezione endovenosa di tPA (Alteplase, 10 mg/kg) entro 2 ore dalla fotoattivazione ha ridotto significativamente le dimensioni dell'infarto nella fototrombosi T+RB. Pertanto, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere un utile modello sperimentale per testare nuove terapie trombolitiche.

Introduzione

La trombectomia endovascolare e la trombolisi mediata da tPA sono le uniche due terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l'ictus ischemico acuto, che affligge ~700.000 pazienti all'annonegli Stati Uniti. Poiché l'applicazione della trombectomia è limitata all'occlusione dei grandi vasi (LVO), mentre la trombolisi tPA può alleviare le occlusioni dei piccoli vasi, entrambe sono terapie preziose per l'ictus ischemico acuto2. Inoltre, la combinazione di entrambe le terapie (ad esempio, l'inizio della trombolisi tPA entro 4,5 ore dall'insorgenza dell'ictus, seguita da trombectomia) migliora la riperfusione e gli esiti funzionali3. Pertanto, l'ottimizzazione della trombolisi rimane un obiettivo importante per la ricerca sull'ictus, anche nell'era della trombectomia.

I modelli tromboembolici sono uno strumento essenziale per la ricerca preclinica sull'ictus che mira a migliorare le terapie trombolitiche. Ciò è dovuto al fatto che i modelli di occlusione vascolare meccanica (ad esempio, l'occlusione MCA della sutura intraluminale) non producono coaguli di sangue e il suo rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione dell'occlusione meccanica è eccessivamente idealizzato 4,5. Ad oggi, i principali modelli tromboembolici includono la fototrombosi 6,7,8, l'applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl3)9, la microiniezione di trombina nel ramo MCA 10,11, l'iniezione di (micro)emboli ex vivo nell'MCA o nell'arteria carotide comune (CCA)12,13,14 e l'ipossia-ischemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Questi modelli di ictus differiscono nella composizione istologica dei coaguli che ne derivano e nella sensibilità alle terapie litiche mediate da tPA (Tabella 1). Variano anche nella necessità chirurgica di craniotomia (necessaria per l'iniezione di trombina in situ e l'applicazione topica di FeCl3), nella consistenza delle dimensioni e della posizione dell'infarto (ad esempio, l'infusione di microemboli da parte di CCA produce risultati molto variabili) e negli effetti globali sul sistema cardiovascolare (ad esempio, il tHI aumenta la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca per compensare la vasodilatazione periferica indotta dall'ipossia).

Il modello di ictus fototrombotico (PTS) basato su coloranti RB ha molte caratteristiche interessanti, tra cui semplici procedure chirurgiche senza craniotomia, bassa mortalità (in genere < 5%) e dimensioni e posizione prevedibili dell'infarto (nel territorio di fornitura di MCA), ma presenta due principali limitazioni. 8 Il primo avvertimento è la risposta debole a nulla al trattamento trombolitico mediato da tPA, che è anche uno svantaggio del modelloFeCl 3 7,19,20. Il secondo avvertimento dei modelli di ictus PTS e FeCl3 è che i trombi che ne derivano sono costituiti da aggregati piastrinici densamente impacchettati con una piccola quantità di fibrina, che non solo portano alla sua resilienza alla terapia tPA-litica, ma si discostano anche dal modello di trombi piastrinici:fibrina misti nei pazienti con ictus ischemico acuto21,22. Al contrario, il modello di microiniezione di trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizzata e un contenuto incerto di piastrine10.

Dato il ragionamento di cui sopra, abbiamo ipotizzato che la miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione mirata a MCA attraverso il cranio assottigliato possa aumentare la componente di fibrina nei trombi risultanti e aumentare la sensibilità al trattamento litico mediato da tPA. Abbiamo confermato questa ipotesi,23 e qui descriviamo in dettaglio le procedure del modello di ictus fototrombotico modificato (T+RB).

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Protocollo

Questo protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia e segue le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La Figura 1A delinea la sequenza delle procedure chirurgiche di questo protocollo.

1. Impostazione dell'intervento chirurgico

  1. Posizionare un tappetino riscaldante con temperatura impostata a 37 °C sull'adattatore per animali di piccola taglia almeno 15 minuti prima dell'intervento. Preparare un rotolo di clip per il naso per l'adattatore che consenta la rotazione della testa dell'animale. Preparare gli anestetici Ketamina (60 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg).
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra cui forbici, pinze, porta-aghi, emostatici, cotton fioc e suture con autoclave (121 °C a 15 psi per 60 min). Prepara la colla per tessuti e l'unguento per gli occhi. Prepara gli occhiali di protezione laser da 532 nm per i chirurghi.
    NOTA: Questo protocollo descrive una procedura chirurgica di sopravvivenza maggiore e deve essere condotta utilizzando tecniche asettiche.
  3. Configurare il sistema di illuminazione con una sorgente laser da 532 nm. Prepara un trapano dentale.
  4. Preparare la soluzione salina di Rose Bengal (10 mg/mL). Mettere un'aliquota di trombina bovina (0,1 U/μL) sul secchiello del ghiaccio.
  5. Iniettare Ketoprofene (4,0 mg/kg) per via sottocutanea nel topo come analgesia a 30 minuti prima dell'intervento chirurgico o utilizzare il regime analgesico raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.

2. Legatura dell'arteria carotide comune omolaterale

  1. Anestetizzare topi maschi C57BL/6NCrl di 10-14 settimane di età compresa tra 22 e 30 g mediante iniezione intramuscolare di ketamina (60 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
    NOTA: L'intera procedura chirurgica, che comprende la legatura dell'arteria carotide comune omolaterale attraverso il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale, dovrebbe richiedere ~ 120 minuti. Il regime anestetico sarà in genere efficace per l'intera durata, ma la profondità dell'anestetico deve essere rivalutata almeno ogni 15 minuti. Durante l'apprendimento di queste procedure, potrebbe essere necessario ridosare l'anestesia.
  2. Eseguire un pizzicotto del piede per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato. Rimuovere i peli sul collo sinistro per la legatura CCA e la testa per il diradamento del cranio con la crema depilatoria.
  3. Posizionare il mouse sull'adattatore per animali di piccola taglia in posizione supina. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di iodio povidone ed etanolo al 70%.
  4. Fissare la testa del mouse utilizzando le barre auricolari. Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione cervicale sinistra di 0,5 cm utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta a circa 0,2 cm lateralmente alla linea mediana.
  5. Utilizzare un paio di pinze seghettate fini per separare i tessuti molli e la fascia per esporre l'arteria carotide comune sinistra (LCCA). Separare con cura il CCA sinistro dal nervo vagale utilizzando un paio di pinze fini e lisce.
  6. Posizionare una sutura permanente a doppio nodo attorno all'LCCA utilizzando una sutura di seta 5-0 tagliata in segmenti di 20 mm, quindi chiudere la ferita utilizzando clip sterili per ferite.

3. Assottigliamento del cranio sopra il ramo MCA e fotoattivazione

  1. Capovolgere il mouse in posizione prona sull'adattatore per piccoli animali. Ruotare il rotolo della clip nasale di 15°. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di betadine ed etanolo al 70%.
  2. Praticare un'incisione di 0,8 cm nel cuoio capelluto utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta lungo l'occhio sinistro e l'orecchio per esporre il muscolo temporale, che si trova tra l'occhio e l'orecchio (Figura 1B).
  3. Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione di 0,5 cm lungo il bordo del muscolo temporale sull'osso parietale sinistro con un paio di pinze seghettate sottili. Eseguire una seconda incisione verticale di 0,3 cm sul muscolo temporale con una microforbice. Ritrarre il muscolo temporale per esporre il bordo dell'osso parietale e dell'osso squamoso. Assicurati di visualizzare il punto di riferimento della sutura coronale tra le ossa frontali e parietali (Figura 1B,C).
  4. Idratare il cranio applicando soluzione fisiologica sterile per rivelare l'MCA sinistro. Segna il ramo prossimale MCA sull'osso squamoso con un pennarello. Disegnare delicatamente un cerchio di circa 1 mm di diametro che circonda l'area contrassegnata con il trapano dentale pneumatico (impostazione della velocità della fresa al 50% del regolatore di velocità), quindi assottigliare il cranio di circa 0,2 mm di profondità senza toccare la dura sottostante. Interrompere la perforazione fino a quando non rimane uno strato molto sottile di osso.
  5. Mescolare la soluzione di trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) e Rose bengala (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) in base al peso corporeo del topo. Ad esempio, per un topo di 25 g di peso corporeo, mescolare 20 μL di trombina (0,1 U/μL) e 125 μL di RB (10 mg/mL).
  6. Iniettare lentamente la soluzione T+RB (145 μL per 25 g di peso corporeo) nel seno retroorbitale con una siringa da insulina (ago #31G).
    NOTA: Negli esperimenti pilota, il tasso di mortalità di dosi crescenti di trombina mescolate con la dose standard di colorante RB (50 mg/kg) è stato esaminato per la fotoattivazione. La mortalità è stata dello 0% per trombina da 80 U/kg (n=13), del 43% per trombina da 120 U/kg (n=7) e del 100% sia per la trombina da 160 U/kg (n=5) che per quella da 200 U/kg (n=5). Per questo modello è stata quindi scelta una dose di trombina da 80 U/kg. L'imaging a contratto con speckle laser è stato utilizzato anche per escludere la possibilità di coagulazione del sangue dilagante vicino alla cavità orbitale dopo l'iniezione del seno retro-orbitale di T+RB (Figura supplementare 1), nonché la deposizione diffusa di fibrina nell'emisfero controlaterale che non è stata sottoposta a illuminazione laser (Figura supplementare 2).
  7. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  8. Applicare l'illuminatore con una luce laser da 532 nm (con energia di 0,5 mW) sul sito perforato a una distanza di 2 pollici per 20 minuti. Visualizzare l'illuminazione sul ramo prossimale dell'MCA attraverso un occhiale di protezione laser (Figura 1C,D).
    NOTA: L'MCA con illuminazione a 532 nm mostra una fluorescenza rossa sotto la maschera. L'MCA distale scomparirà dopo 10 minuti di illuminazione. Escludere l'animale se il flusso distale di MCA è ancora presente dopo 20 minuti di illuminazione.
  9. Interrompere l'illuminazione laser dopo 20 min. Chiudere la ferita con clip sterili.

4. Imaging intravitale (opzionale)

NOTA: Per caratterizzare la formazione di trombi in vivo, utilizzare l'imaging intravirale mediante un confocale spin-disk con sistema di fotoattivazione23.

  1. Crea una finestra cranica di ~ 3 mm di diametro sull'osso parietale del cranio.
  2. Posizionare un vetro di copertura sulla finestra cranica e posizionare l'MCA distale (~50 μm di diametro) sotto un obiettivo a immersione in acqua 20x.
  3. Etichettare la piastrina circolante mediante iniezione nella vena caudale dell'anticorpo anti-GPIbβ coniugato DyLight488 (0,1 mg/kg) 5 minuti prima dell'imaging.
  4. Iniettare la miscela di trombina (80 U/kg) e rosa bengala (50 mg/kg) per via retroorbitale a 5 minuti prima dell'imaging.
  5. Fotoattivare l'MCA utilizzando un sistema laser a 561 nm con raggio laser di 10 μm di diametro e registrare l'immagine fino alla formazione del trombo.

5. Somministrazione di tPA

  1. Posizionare l'animale anestetizzato su un tampone caldo a 37 °C. Al punto di tempo di post-fotoattivazione selezionato, bagnare una garza con acqua tiepida a ~45 °C e avvolgerla sulla coda per 1 minuto.
  2. Iniettare tPA umano ricombinante (10 mg/kg) attraverso la vena caudale con un bolo al 50% e al 50% nell'arco di 30 minuti con pompa per infusione.
    NOTA: Sebbene la dose clinica di tPA umano ricombinante per il trattamento dell'ictus ischemico acuto sia di 0,9 mg/kg, una dose più elevata (10 mg/kg) è comunemente usata nei roditori per compensare la ridotta reattività del tPA interspecie. Abbiamo anche seguito il protocollo standard di somministrazione di tPA in modelli preclinici di ictus, utilizzando il 50% come bolo e il 50% infuso attraverso la vena caudale per 30 minuti.24

6. Monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale (CBF)

NOTA: Per confermare il recupero del CBF dopo il trattamento con tPA, utilizzare un sistema di imaging bidimensionale con contrasto a speckle laser15 e registrare immediatamente dopo la fototrombosi (passaggio 3.9) o a 24 ore dopo il trattamento con tPA.

  1. Posizionare l'animale anestetizzato in posizione prona e praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto con il cranio esposto.
  2. Idratare il cranio con soluzione fisiologica sterile e applicare delicatamente il gel per ultrasuoni sul cranio. Evitare capelli e bolle nel gel, che interferiranno con il segnale CBF.
  3. Monitorare il CBF in entrambi gli emisferi cerebrali con l'imager a contrasto a speckle laser per 10 minuti.
  4. Dopo aver registrato l'immagine CBF, chiudere il cuoio capelluto con colla per tessuti e riportare l'animale nella gabbia.
  5. Analizza il CBF nelle regioni selezionate e calcola la percentuale di recupero del CBF rispetto alla regione controlaterale.
  6. Quindi, rimetti l'animale in una gabbia calda per il recupero. Monitorare i topi per 5-10 minuti fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Mettere il cibo bagnato nella gabbia e riportarlo alla struttura di cura degli animali.
    NOTA: Fornire l'analgesia post-operatoria come raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.

7. Misurazione del volume dell'infarto mediante colorazione con cloruro di trifenile tetrazolio (TTC)

  1. Ventiquattro ore dopo la fototrombosi, anestetizzare profondamente l'animale secondo le linee guida istituzionali locali per la chirurgia di non sopravvivenza.
    NOTA: Somministriamo tribromoetanolo (avertina) 250 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale (IP).
  2. Eseguire la perfusione transcardica con PBS, raccogliere il cervello fresco e incorporare in gel di agar al 3%.
  3. Sezionare la fetta di cervello con uno spessore di 1 mm mediante vibratomo e incubare in una soluzione di TTC al 2% per 10 minuti.
  4. Quantificare il volume totale dell'infarto da 6 fette cerebrali come volume assoluto con il software ImageJ.
    NOTA: L'edema cerebrale non è stato utilizzato come misurazione dell'esito per due motivi. In primo luogo, la colorazione TTC misura la vitalità tissutale (attraverso l'attività di riduzione mitocondriale) che è una conseguenza più grave dell'edema. In secondo luogo, man mano che l'infarto procede, si verificano sia edema vasogenico che citotossico e non possono essere facilmente distinti dai metodi standard di misurazione dell'edema cerebrale. Tuttavia, abbiamo utilizzato la marcatura anti-immunoglobina (IgG) per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) e abbiamo trovato uno stravaso di IgG comparabile a 6 ore dopo la fotoattivazione in entrambi i modelli di ictus RB e T+RB (Figura 3 supplementare).

8. Misurazione della formazione del trombo

NOTA: Per misurare la formazione di trombi, prelevare il cervello a 1 ora e 2 ore dopo la fototrombosi per la misurazione del trombo nell'MCA mediante immunochimica (IHC) e per la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot, rispettivamente.

  1. Eseguire l'IHC per la caratterizzazione della composizione del coagulo. Fissare il cervello con il 4% di paraformaldeide durante la notte e poi disidratare il cervello con il 30% di saccarosio per l'inclusione dell'OCT.
  2. Sezionare il cervello con orientamento sagittale in 20 μm di spessore, ed eseguire l'IHC con anticorpi specifici contro fibrinogeno, piastrine (glicoproteina IIb), globuli rossi (TER119) e vasi sanguigni (isolectina GS-IB4).
  3. Eseguire la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot con un anticorpo contro il fibrinogeno.

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Risultati

In primo luogo, abbiamo confrontato il contenuto di fibrina in RB rispetto ai coaguli di sangue indotti dalla fototrombosi T+RB. I topi sono stati sacrificati mediante perfusione transcardica di fissativi a 2 ore dopo la fotoattivazione e i cervelli sono stati rimossi per la colorazione a immunofluorescenza del ramo MCA nei piani longitudinali e trasversali. Nella fototrombosi RB, il ramo MCA era densamente impacchettato con piastrine CD41+ e poca fibrina (Figura 2A,C

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Discussione

L'ictus fototrombotico RB tradizionale, introdotto nel 1985, è un modello interessante di ischemia cerebrale focale per semplici procedure chirurgiche, bassa mortalità e alta riproducibilità dell'infarto cerebrale. 5 In questo modello, il colorante fotodinamico RB attiva rapidamente le piastrine all'eccitazione della luce, portando a densi aggregati che occludono il vaso sanguigno 5,8,23. Tuttavia, la pic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 a C.Y.K.; e NS106592 a Y.Y.S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)SigmaT8877infarto
4-0 Sutura monofilamento di nylonLOOK766Bforniture chirurgiche
5-0 sutura di setaHarvard Apparatus624143forniture chirurgiche
Raggio laser 543nmMelles Griot25-LGP-193-249fototrombosi
topi maschi adultiCharles RiverC57BL/610~14 settimane (22~30 g)
Barra per anestesia perl'officina meccanicaconfigurazione chirurgica
Avertin (2, 2, 2-tribromoetanolo)SigmaT48402eutanasia
Trapano odontoiatricoDentamericaRotex 782configurazione chirurgica
Microscopio digitaleDino-LiteAM2111imaging cerebrale
Dissezione microscopioOlympusSZ40configurazione chirurgica
Pinze curve fini (seghettate)Strumento chirurgicoFST11370-31
Pinze curve fini (lisce)FST11373-12strumento chirurgico
capra anti-coniglio Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Immunoistochimica
Emostatici Halsted-MosquitoFST13008-12strumento chirurgico
Pompa di calore con cuscinetto riscaldantedichirurgica GaymarTP700
KD Scientific200trattamento trombolitico
Siringa da insulina con ago da 31GBD328291fototrombosi
KetaminaCCM,anestesia UVA
Laser protettivo google 532nmFototrombosi
KetoprofeneCCM, UVANSAID, analgesia
micro portaaghiFST12060-01chirurgico
15000-03strumento chirurgico
MoorFLPI-2, imager del flusso sanguignoMoorsorgente laser da 780 nmSpeckle Contrast Imaging
, adattatore per mouseRWD68014
Unguento Puralube VetFisherNC0138063prevenzione della secchezza oculare Punte
divaricatoriKent ScientificSurgi-5014-2configurazione chirurgica
Fototrombosi Rose BengalSigma198250Fototrombosi
TrombinaSigmaT7513
Colla tissutaleAbbott LaboratoriesNC9855218forniture chirurgiche
tPAGenetechCathflo activase 2mgtrattamento trombolitico
VibratomeStoelting51425TTC infacrt
xilazinaCCM, anestesia UVA
dell'adattatore del mouse, UVA Pompa infusione Thorlabs LG3, ,, strumento FST, , , Laser per

Riferimenti

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