Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

Jia Wang; Dongsheng Xu; Jingjing Cui; Chen She; Hui Wang; Shuang Wu; Ling Zou; Jianliang Zhang; Wanzhu Bai

doi:10.3791/61742

Articolo metodologico

Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

DOI:

10.3791/61742

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6 gennaio 2021

Jia Wang^*¹ , Dongsheng Xu^*¹ , Jingjing Cui¹ , Chen She¹ , Hui Wang¹ , Shuang Wu¹ , Ling Zou¹ , Jianliang Zhang¹ , Wanzhu Bai¹

¹Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l'origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.

Abstract

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Lo scopo di questo studio era quello di esaminare la distribuzione e l'origine delle fibre nervose sensoriali immunoreattive del peptide (CGRP) immunoreattive del basamento cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la tecnica di tracciamento retrogrado. Qui, le fibre nervose e i vasi sanguigni sono stati macchiati usando rispettivamente immunofluorescenza e tecniche istochimiche con CGRP e falloidina fluorescente. La correlazione spaziale delle fibre nervose durali CGRP-immuoreattive e dei vasi sanguigni è stata dimostrata dalla ricostruzione 3D. Nel frattempo, l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP sono state rilevate con la tecnica di tracciamento neurale con fluorogold (FG) dall'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nella dura mater cranica al ganglio trigeminale (TG) e gangli della radice dorsale cervicale (C). Inoltre, sono state esaminate anche le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG nei TG e nei DRG insieme al CGRP utilizzando doppie immunofluorescenze. Sfruttando il campione trasparente a montaggio intero e la ricostruzione 3D, è stato dimostrato che le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole etichettate con phalloidina corrono insieme o formano separatamente una rete neurovascolare uditivo in una vista 3D, mentre i neuroni etichettati FG sono stati trovati nei rami oftalmico, mascellare e mandibolare del TG, così come nei DRG C2-3 ipsilateral sul lato dell'applicazione del tracciante in cui alcuni dei neuroni etichettati FG presentavano espressione immunoreattiva CGRP. Con questi approcci, abbiamo dimostrato le caratteristiche distributivi delle fibre nervose immunoreattive CGRP intorno ai vasi sanguigni nella dura madre cranico, così come l'origine di queste fibre nervose da TG e DRG. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranicio sotto la condizione fisiologica o patologica.

Introduzione

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Il dura mater cranico è lo strato più esterno di meningi per proteggere il cervello e contiene abbondanti vasi sanguigni e diversi tipi di fibre nervose^1,². Molti studi hanno dimostrato che la dura mater cranici sensibilizzata può essere il fattore chiave che porta al verificarsi di mal di testa, che coinvolge la vasodilatazione e l'innervazione^{anomale 3}^,⁴^,⁵. Pertanto, la conoscenza della struttura neurovascolare nella dura madre cranale è importante per comprendere la patogenesi del mal di testa, specialmente per l'e....

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-09-29-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati dodici ratti maschi adulti Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Gli animali [numero di licenza SCXK (JING) 2017-0005] sono stati forniti dai National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervazione del dura mater cranale di ratto

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Risultati

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Struttura neurovascolare del dura mater craniciale
Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali e i tessuti connettivi etichettati con falloidina sono stati chiaramente dimostrati in tutta la dura madre cranica a montaggio intero in un modello 3D(Figura 2C,D, E, F). È stato dimostrato che sia le fibre nervose immunoreatt.......

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Discussione

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In questo studio, abbiamo dimostrato con successo la distribuzione e l'origine delle fibre nervose cgrp-immunoreattive nel dura mater cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione 3D e gli approcci di tracciamento neurale con anticorpo CGRP e tracciante neurale FG, fornendo le evidenze istologiche e chimiche per comprendere meglio la rete neurovascolare udirica.

Come era noto, il CGRP svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'emicrania⁴^,.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dal progetto del National Key R&D Program of China (Project Code n. 2019YFC1709103; n. 2018YFC1707804) e National Natural Science Foundation of China (Project Code n. 81774211; n. 81774432; n. 81801561).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen di Thermo Fisher Scientific	A21202	Protegge dalla luce; RRID: AB_141607
Strumento per stereotassi cerebrale	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Versione 1.1	Software del microscopio a fluorescenza
Sistema di imaging confocale	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Sistema di imaging fluorescente	Olympus	BX53
Microtomo di congelamento	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Versione 4.2	software di elaborazione delle immagini confocali
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Topo anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Siero d'asino normale	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Falloidina 568	Molecolare& nbsp; Sonde	A12380	Proteggere dalla luce
Photoshop e Illustrazione	Adobe	CS6	Software di fotoritocco
Coniglio anti-Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus vetrini per microscopio	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm

Sistema

Riferimenti

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Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-9....

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Colorazione a immunofluorescenza Tecnica di tracciamento neurale Marcatura retrograda con Fluorogold Imaging a microscopia confocale Ganglio trigemino Gangli delle radici dorsali cervicali Ricostruzione 3D Preparazione whole mount

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