Iniezione intravitreale e quantificazione dei parametri di infezione in un modello di topo di endoftalmite batterica

Summary

Descriviamo qui un metodo di iniezione intravitreale e la successiva quantificazione batterica nel modello di topo di endoftalmite batterica. Questo protocollo può essere esteso per misurare le risposte immunitarie dell'ospite e l'espressione batterica e genica ospite.

Abstract

Le infezioni batteriche intraoculari sono un pericolo per la vista. I ricercatori utilizzano modelli animali per indagare i fattori ospiti e batterici e le vie di risposta immunitaria associate all'infezione per identificare obiettivi terapeutici praticabili e testare farmaci per prevenire la cecità. La tecnica di iniezione intravitreale viene utilizzata per iniettare organismi, farmaci o altre sostanze direttamente nella cavità vitrea nel segmento posteriore dell'occhio. Qui, abbiamo dimostrato questa tecnica di iniezione per iniziare l'infezione nell'occhio del topo e la tecnica di quantificazione dei batteri intraoculari. Bacillus cereus è stato coltivato in mezzi liquidi per infusione cerebrale per 18 ore e restituito a una concentrazione di 100 unità di formazione di colonie (CFU)/0,5 μL. Un topo C57BL/6J è stato anestetizzato usando una combinazione di chetamina e xiazina. Utilizzando un microiniettore picoliter e aghi capillari in vetro, 0,5 μL della sospensione Bacillus sono stati iniettati nel vitreo medio dell'occhio del topo. L'occhio di controllo contralaterale è stato iniettato con mezzi sterili (controllo chirurgico) o non è stato iniettato (controllo assoluto). A 10 ore dall'infezione, i topi sono stati eutanasiati e gli occhi sono stati raccolti utilizzando pinzette chirurgiche sterili e collocati in un tubo contenente PBS sterile da 400 μL e perline di vetro sterili da 1 mm. Per i test ELISA o mieloperossidasi, l'inibitore della proteinasi è stato aggiunto ai tubi. Per l'estrazione dell'RNA, è stato aggiunto il buffer di lysis appropriato. Gli occhi sono stati omogeneizzati in un omogeneizzatore tissutale per 1-2 minuti. Gli omogeneati sono stati diluiti in serie 10 volte in PBS e traccia diluiti su piastre di agar. Il resto degli omogeneati è stato conservato a -80 °C per ulteriori saggi. Le piastre sono state incubate per 24 ore e la CFU per occhio è stata quantificata. Queste tecniche si traducono in infezioni riproducibili negli occhi del topo e facilitano la quantificazione di batteri vitali, la risposta immunitaria dell'ospite e l'omica dell'espressione genica ospite e batterica.

Introduction

L'endoftalmite batterica è un'infezione devastante che causa infiammazione e, se non trattata correttamente, può causare perdita della vista o cecità. L'endoftalmite deriva dall'ingresso di batteri all'interno dell'occhio^1,2,3,4,5. Una volta negli occhi, i batteri si replicano, producono tossine e altri fattori nocivi e possono causare danni irreversibili a delicate cellule e tessuti retinali. Il danno oculare può anche essere causato dall'infiammazione, a causa dell'attivazione di vie infiammatorie che por....

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio e nella Dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. I protocolli sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'University of Oklahoma Health Sciences Center (numeri di protocollo 15-103, 18-043 e 18-087).

1. Aghi di vetro sterili

1. Accendere l'estrattore della pipetta dell'ago.
2. Regolare la manopola del riscaldatore fino a quando il d....

Results

Generare un inoculo riproducibile e l'accuratezza della procedura di iniezione intravitreale sono passaggi chiave nello sviluppo di modelli di endoftalmite microbica. Qui, abbiamo dimostrato la procedura di iniezione intravitreale utilizzando Gram-positive Bacillus cereus. Abbiamo iniettato 100 CFU/0,5 μL di B. cereus nel medio-vitreo di cinque topi C57BL6. Dopo 10 h di postinfezione, abbiamo osservato una crescita intraoculare di B. cereus a circa 1,8 x 10⁵ CFU/occhio.

Discussion

Anche con la disponibilità di potenti antibiotici, farmaci antinfiammatori e chirurgia della vitrectomia, l'endoftalmite batterica può accecare un paziente. Gli studi clinici sono stati utili nello studio dell'endoftalmite; tuttavia, i modelli sperimentali di endoftalmite forniscono risultati rapidi e riproducibili che possono essere tradotti in progressi nello standard di cura, con conseguente migliore risultato visivo per i pazienti.

Il volume vitreo dell'occhio del topo è di circa 7 μL

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µ L pipetta	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubatore	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Infusione cardiaca	BD	90003-032
NA Microiniettore cellulare	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Pinze a punta fine	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Perle di vetro 1,0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubatore Agitatore	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Pipette microcapillari 5 microlitri	Kimble	71900-5	NA
Micro-pipetta Sutter	Instrument Co.	BV-10	NA
Microscopio Axiostar Plus	Zeiss
NA Microscopio OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Modello 607	NA
Pipetta multicanale 30-300 &; L	Biohit	15626090	NA
Pipetta multicanale 5-100 &; L	Biohit	9143724	NA
Estrattore per aghi/pipette	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO		Inibitore della
proteasi	Roche Roche	4693159001	Pinza ad
azione inversa	Katena	K5-8228	NA