Un complesso compito subacqueo per il cibo per indagare l'organizzazione sociale e le interazioni nei ratti

I ratti sono animali altamente sociali, rendendoli un modello ideale per comprendere il comportamento sociale e il modo in cui si relaziona al processo decisionale. I ratti si dividono in gruppi gerarchici basati su relazioni dominanti e sottomessi. I ratti possono essere addestrati per compiti che esprimono cooperazione, gestione del rischio, comportamento ingannevole e comportamenti che cambiano a seconda delle decisioni di altri ratti^1,2. Gli studi con modelli di ratti che esprimono questi comportamenti si rivelano utili per comprendere la struttura sociale e la sua relazione con il processo decisionale con rilevanza per la psicologia umana.

Come risorsa necessaria, l'accesso al cibo è una delle principali ragioni dell'organizzazione sociale tra i ratti³. Ratti ingenui sono stati osservati impegnati nell'interazione sociale e nella differenziazione in situazioni in cui l'accesso al cibo era^{limitato 1,2,4,5,6,7,8}. In uno studio, ai ratti adulti è stato richiesto di attraversare un tunnel sott'acqua per accedere al cibo e quindi riportare il cibo attraverso il tunnel fino alla gabbia⁹. I singoli ratti all'interno di ciascun gruppo hanno potuto essere classificati in base al loro metodo di ottenimento del cibo. Sono emersi due profili comportamentali: i primi sono i "portatori", che si tuffano e nuotano sott'acqua fino all'alimentatore, ottengono un pellet e tengono il pellet in bocca mentre nuotano di nuovo nella gabbia. Il secondo gruppo sono i "non portatori", che non si tuffano e ottengono cibo solo rubando ai vettori. In gruppi di sei ratti, circa la metà erano portatori e l'altra metà non^9. Tutti i ratti sono stati osservati essere portatori quando sono stati addestrati individualmente nell'apparato subacqueo¹⁰.

Compiti comportamentali simili degli animali comportano la competizione per cibo o spazio e sono stati^{impiegati con polli 11,roditori 12,13,14,15}e maiali¹⁶. Nella prova a tubo, due topi vengono inviati attraverso un tubo stretto dalle estremità opposte, con un topo che necessariamente ce la trasli va dall'altro. Questo test aiuta a misurare la dominanza^{sociale 17,18,19}. Un test comportamentale indicato come test del punto caldo fa competere i topi per una posizione in un piccolo punto caldo in una gabbia altrimenti fredda^19,20.

Un successivo compito di immersione per cibo che è più complesso consente ai ratti portatori di avere accesso a una seconda gabbia, lontano dai non portatori, dove potrebbero consumare il loro cibo^{separatamente 4}. In questo protocollo, presentiamo un compito diving-for-food come modello alternativo per la gerarchia sociale e il comportamento nei ratti. Questo compito di immersione per cibo fornisce un metodo per i ratti per evitare i gruppi sociali della gabbia principale e quindi sfuggire all'aggressività e alle interazioni sociali di altri ratti. Questo compito introduce l'opzione di comportamenti sociali evitanti nei ratti che possono chiarire la nostra comprensione dell'aggressione sociale.

Il funzionamento sociale, che descrive la capacità di impegnarsi in normali ruoli sociali, può essere influenzato da condizioni come la depressione³. Gli individui depressi spesso lottano con la disoccupazione, hanno pochi contatti sociali e difficilmente si impegnano in attività ricreative³. Un trattamento efficace della depressione è spesso misurato dal miglioramento della funzione sociale e^{interpersonale 21}. I trattamenti antidepressivi, tuttavia, variano nella loro efficacia nel trattamento delle menomazioni nel funzionamento sociale legate alla depressione³.

In questa metodologia, abbiamo indotto una condizione depressiva nei ratti attraverso la prova di stress cronico e valutato il livello di anedonia dei ratti, una delle caratteristiche di uno stato simile alla depressione, con un test di preferenza al saccarosio. I ratti anedonici, così come i ratti anedonici ai quali venivano somministrati antidepressivi, sono stati monitorati attraverso il compito diving-for-food rispetto a un gruppo di controllo.

Le attività subacquee per alimenti precedentemente menzionate assomigliano a test di competizione alimentare che spesso usano una sola coppia di animali o una dicotomia come punto di confronto, come vettori e non portatori e una singola analisi che confronta la sottomissione al dominio^15,17,22. Il nostro metodo definisce interazioni più complesse tra ratti attraverso divisioni in molteplici tipi di comportamento, tra cui: portatori e non portatori, coloro che combattono per il cibo e coloro che non lo fanno, e ratti che condividono cibo o vanno in gabbie separate. Crediamo che questo protocollo sia l'unico tipo che utilizza una gerarchia per valutare una complessa struttura di interazione sociale in un gruppo di animali, piuttosto che in coppia. Sarà utile per studi che testano il dominio basato sulla preferenza alimentare, così come studi che mirano a chiarire relazioni più gerarchiche che non si limitano a un modello dominante-sottomesso.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio il complesso compito diving-for-food per indagare l'organizzazione sociale e le interazioni nei ratti con cambiamenti nel comportamento individuale, in particolare dopo lo sviluppo dell'anedonia. Questo modello animale può anche essere utilizzato per studiare altre condizioni psichiatriche associate a cambiamenti nel comportamento sociale e nella gerarchia.

Gli esperimenti sono stati condotti conformemente alle raccomandazioni delle dichiarazioni di Helsinki e di Tokyo e agli orientamenti per l'impiego di animali da esperimento della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Il codice di autorizzazione per questo esperimento era IL-55-8-12.

1. Preparazione del ratto

1. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).
2. Seleziona ratti adulti Sprague Dawley. Escludere gli animali che presentano tratti fisici anomali, come convulsioni o altri deficit motori.
   NOTA: Per questo protocollo, abbiamo usato ratti maschi adulti, del peso di 300−350 g, di età compresa tra 4 e 8 mesi. Possono essere utilizzati anche ratti di sesso femminile.
3. Mantenere i ratti a temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C), con cicli di luce 12 ore e 12 ore di buio. Fornire chow di ratto e acqua ad libitum. Casa 3 ratti per gabbia.
   NOTA: Tutti i ratti alloggiati nella stessa gabbia devono essere nello stesso gruppo sperimentale.
4. Posizionare casualmente 120 ratti in uno dei tre gruppi sperimentali. Utilizzare il gruppo 1 (n=60) w come gruppo di controllo. Indurre il gruppo sperimentale, gruppo 2 (n=30), con fattori di stress come descritto di seguito. Indurre il Gruppo 3, il gruppo sperimentale con trattamento (n=30), con anedonia e successivamente somministrare trattamento antidepressivo. La sequenza temporale per il protocollo sperimentale è disponibile nella figura 1.
5. Contrassegnare i ratti con penne colorate all'inizio dell'esperimento per consentire l'identificazione individuale.
6. Esegui tutti gli esperimenti tra le 6:00 .m e le 12:00.m.
7. Pesare i ratti ogni giorno durante tutta la procedura per una possibile perdita di peso. La perdita di peso superiore al 20% escluderà i ratti dallo studio. Cfr. punto 3.1.3.

2. Induzione di anedonia nei ratti

1. Modello di stress cronico imprevedibile
   1. Indurre ratti del gruppo sperimentale e del gruppo sperimentale con trattamento con caratteristiche di uno stato depressivo dal modello di stress cronico imprevedibile, come^{precedentemente dettagliato 23}.
2. Modello di stress cronico imprevedibile
   1. Indurre ratti dai due gruppi sperimentali con comportamenti depressivi dal modello di stress cronico imprevedibile, come precedentemente dettagliato²³.
      NOTA: I ratti sono esposti a 2 dei 7 fattori di stress al giorno in ordine casuale; uno di giorno e il secondo di notte per 5 settimane^24,25.
   2. Introdurre i seguenti fattori di stress in ordine casuale:
      1. Ratti domestici con 6 animali per gabbia invece di 3 per 18 ore.
      2. Posizionamento della gabbia di inclinazione di 45° lungo l'asse verticale per 3 h.
      3. Privare gli animali del cibo per 18 ore.
      4. Privare gli animali dell'acqua per 18 ore e quindi introdurre una bottiglia d'acqua vuota.
      5. Mantenere una gabbia sporca per 8 ore con 300 mL di acqua versata nella biancheria da letto.
      6. Mantenere l'illuminazione continua e invertire il ciclo luce/buio per 48 ore a settimana.
      7. Riscaldare l'ambiente a 40 °C per 5 min.
   3. Confermare lo sviluppo dell'anedonia, una delle caratteristiche di uno stato depressione- simile, eseguendo un test di preferenza del saccarosio. Cfr. sezione 4.
3. Terapia anti-depressione
   1. Somministrare per via intraperitoneale 20 mg/kg di cloridrato di imipramina (antidepressivo triciclico) una volta al giorno per 3 settimane ai ratti del^{gruppo sperimentale 26,27,28}.
      NOTA: Un sottogruppo (n=3 in ogni insieme di ratti) del gruppo sperimentale viene somministrato per via intraperitoneale allo 0,9% saline (placebo) una volta al giorno per la durata di 3 settimane, allo stesso volume del gruppo di trattamento antidepressivo.

3. Il test dell'organizzazione sociale (complesso compito diving-for-food)

NOTA: L'apparato sperimentale è stato descritto in^{studi precedenti 9,29,30} con piccole modifiche. Tutte le parti dell'apparecchio devono essere composte da plexiglass trasparente.

1. Preparare l'apparecchio e acclimatare i ratti.
   1. Collegare due gabbie (50 cm x 50 cm x 50 cm) a un acquario (130 cm x 35 cm x 50 cm) tramite gallerie (45 cm x 15 cm x 15 cm)(Figura 2). Assicurati che non ci sia accesso da una gabbia all'altra senza immergerti^{nell'acquario 25}. Mantenere la temperatura dell'acqua a 25 °C.
   2. Posizionare tubi con pellet di cibo (un pellet alimentare in ogni tubo) ad un'estremità dell'acquario.
      NOTA: Una riduzione dell'accessibilità dei pellet alimentari nella gabbia di partenza dovrebbe gradualmente incoraggiare il topo, che altrimenti svilupperebbe l'abitudine di rubare, a immergersi per raggiungere il cibo.
   3. Il primo giorno dell'esperimento, introdurre ogni gruppo di 6 ratti ad apparati sperimentali senza acqua per sessioni di 3 ore. Riportare i ratti nella gabbia standard dopo la sessione.
      1. Limita l'accesso al cibo per topi alle sessioni di 3 ore, senza altri accessi al cibo durante il resto della giornata.
      2. Rimuovi i ratti che hanno perso più del 20% del loro peso di base dall'esperimento insieme al loro gruppo sociale e dai ad libitum cibo e acqua.
      3. Tamponare manualmente i ratti secchi o fornire l'accesso a una fonte di calore fino a quando non si asciugano e prima di rimetterli nel loro alloggiamento normale per evitare l'ipotermia.
      4. Ripetere queste sessioni per i giorni 2-3.
         NOTA: Registrare continuamente ratti nell'apparecchio per sessioni di 3 ore. Assicurarsi che la fotocamera sia impostata su alta definizione (720p) e che la messa a fuoco automatica sia disattivata.
2. Eseguire attività subacquee per il cibo
   1. Nei giorni 4-17, aggiungere progressivamente acqua fino al raggiungere il livello massimo dell'acqua, come descritto in precedenza⁴. Nei giorni 17-21, mantenere il livello massimo dell'acqua.
   2. Osserva i ratti che si tuffano per l'accesso al pellet.
   3. Registrare i seguenti parametri per ogni ratto:
      1. Valutare la frequenza di ingresso nel tunnel.
      2. Conta ogni tentativo di immergerti per il cibo.
         NOTA: Il viaggio dalla gabbia all'acquario verso una gabbia non deve superare i 5-6 secondi, il che garantirà che il pellet rimanga commestibile.
      3. Valuta il numero di volte in cui il cibo viene ottenuto per attacco tra ratti che nuotano per cibo e ratti che non lo fanno.
      4. Registra il numero di volte in cui il cibo viene trasportato da un topo che nuota.
      5. Registrare il tempo trascorso dai ratti in gabbie separate rispetto al tempo trascorso nella gabbia originale.
         NOTA: Tutti i dati sono stati ottenuti mediante osservazione visiva continua.

4. Valutazione dell'anedonia: il test di preferenza del saccarosio

1. Valutare l'anedonia mediante la prova di preferenza del saccarosio con modifiche minori, come^{descritto in precedenza 23,25,31,32,33}. Eseguire questo test nei giorni -6, 0, 35, 41, 62 e 68 della procedura (vedere la figura 1 per la sequenza temporale del protocollo).
   1. Consentire ai ratti di consumare soluzione di saccarosio per 24 ore mediante libero accesso alle due bottiglie di ciascuna gabbia, contenenti 100 ml di soluzione di saccarosio (1%, w/v).
   2. Dopo 24 ore, sostituire una delle bottiglie con acqua per ulteriori 24 ore.
   3. Privare i ratti di acqua per 12 ore³⁴.
   4. Dare ai ratti entrambe le bottiglie (una con acqua e una con saccarosio). Dopo 4 ore, registrare il volume sia della soluzione di saccarosio consumata che dell'acqua.
   5. Calcolare la preferenza per il saccarosio come preferenza per il saccarosio (%) = consumo di saccarosio (mL)/(consumo di saccarosio (mL) + consumo di acqua (mL)) × 100%.
      NOTA: Quando si utilizza il modello di stress cronico imprevedibile in combinazione con un test dell'organizzazione sociale, si consiglia non solo di registrare il consumo medio di saccarosio e acqua, ma anche di notare i cambiamenti nel comportamento di ogni singolo ratto. Ciò consentirà una comprensione più specifica dei cambiamenti comportamentali all'interno dell'individuo anziché all'interno del gruppo di fronte a un modello gerarchico come l'attività diving-for-food.

5. Analisi statistica

1. Determinare i confronti tra gruppi utilizzando il Kruskal-Wallis seguito da Mann-Whitney per i dati non parametrici o un'analisi uni-way della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Bonferroni o dal test t dello studente per i dati parametrici.
   NOTA: I risultati sono considerati statisticamente significativi quando p < 0,05 e molto significativi quando p < 0,01.

Cambiamenti del peso corporeo
Un ANOVA uni-way non ha mostrato alcuna differenza nei cambiamenti nel peso corporeo tra i gruppi sperimentali per i 21 giorni del compito diving-for-food. Dai giorni da 2 a 21, si sono letete il peso corporeo per tutti e 3 i gruppi (p<0.01, Tabella 1).

Prova di preferenza del saccarosio
All'inizio dell'esperimento (giorno 0), non vi era alcuna differenza nella percentuale di preferenza per il saccarosio tra il gruppo sperimentale di ratti indotti con anedonia (85,6% ± 18,6), il gruppo sperimentale trattato con terapia antidepressiva (85,1% ± 18,8) e il gruppo di controllo (85,7% ± 9,9). Il giorno 35, rispetto al gruppo di controllo (84,13% ± 12,3), nel gruppo sperimentale si è avuto una preferenza per il saccarosio significativamente inferiore (62,69% ± 17,7, p<0,01) e nel gruppo sperimentale con trattamento (68,48% ± 13,9, p<0,01, Figura 3A). Non c'erano ancora differenze tra il gruppo sperimentale e il gruppo sperimentale con trattamento. Il giorno 62, i ratti sperimentali avevano una percentuale inferiore di preferenza per il saccarosio (68% ± 15) rispetto al gruppo di controllo (78,5% ± 16) e al gruppo sperimentale con trattamento (77% ± 16, p<0,05, figura 3B). Al momento non vi erano differenze tra il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo. I dati sono presentati come percentuale di preferenza per il saccarosio ± deviazione standard.

Attività subacquea per il cibo
L'attività sociale dei ratti in una situazione di accesso limitato al cibo è illustrata nella figura 4. I ratti del gruppo sperimentale hanno dimostrato un aumento della frequenza delle entrate nel tunnel (113% ± 3,7, p<0,01, Figura 4A), immersioni per alimenti (141% ± 7, p<0,01, Figura 4B),alimenti ottenuti trasportando (168% ± 12, p<0.01, Figura 4C),tempo trascorso in gabbie separate (123% ± 7,9, p<0,01, Figura 4D) e alimenti ottenuti per attacco (232% ± 26, p<0.01, Figura 4E) rispetto al gruppo sperimentale con trattamento (44% ± 7, 53% ± 6, 54% ± 5, 55% ± 4,7, 67% ± 3,4, rispettivamente). Le differenze tra il gruppo sperimentale di ratti e i ratti sperimentali trattati con antidepressivi erano statisticamente maggiori della differenza tra il gruppo sperimentale e il gruppo di controllo in tutti e 5 i parametri della prova diving-for-food (p<0.05). I dati sono presentati come percentuale media rispetto ai controlli ± errore standard della media.

Figura 1. Una sequenza temporale del protocollo sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Illustrazione dell'apparato diving-for-food. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. La prova di preferenza del saccarosio (A) dopo 35 giorni e (B) dopo 62 giorni. All'inizio dell'esperimento non vi era alcuna differenza nel consumo di saccarosio. (A) Al giorno 35 dell'esperimento, il gruppo anedonico (p<0.01) e il gruppo anedonico trattato con terapia antidepressiva (p<0.01) avevano una preferenza di saccarosio significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo. (B) Il giorno 62, i ratti indotti con anedonia avevano una preferenza di saccarosio inferiore rispetto sia al controllo che al gruppo anedonico trattato con trattamento antidepressivo (p<0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Attività sociale dei ratti in una situazione di accesso limitato al cibo. (A) Frequenza delle entrate nel tunnel. (B)Immersioni per il cibo. (C) Alimenti ottenuti mediante trasporto. (D) Tempo trascorso in gabbie separate. (E)Alimenti ottenuti per attacco. I dati sono presentati come una percentuale media rispetto ai valori di controllo medi + errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La tabella 1. Variazioni del peso corporeo (in percentuale) durante il compito di immersione per cibo. Non vi sono state differenze tra i 3 gruppi sperimentali per cambiamenti nel peso corporeo durante i 21 giorni di attività. Dai giorni da 2 a 21, c'è stato un effetto complessivo tra i giorni espresso come variazione del peso corporeo (p<0.01).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.