Method Article

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

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L'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro caratterizzazione mediante citometria a flusso possono contribuire in modo significativo alla comprensione del modello di risposta immunitaria contro gli impianti. Questo articolo descrive un metodo preciso per l'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro colorazione per l'analisi citofluorimetrica.

Abstract

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Il successo dell'impianto di un tessuto coltivato in laboratorio o di un dispositivo medico in un individuo è soggetto alla risposta immunitaria dell'ospite ricevente. Considerando un impianto come un corpo estraneo, una risposta immunitaria ostile e disregolata può portare al rigetto dell'impianto, mentre una risposta regolata e il recupero dell'omeostasi possono portare alla sua accettazione. L'analisi dei microambienti degli impianti sezionati in ambienti in vivo o ex vivo può aiutare a comprendere il modello di risposta immunitaria, che può in ultima analisi aiutare nello sviluppo di nuove generazioni di biomateriali. La citometria a flusso è una tecnica ben nota per caratterizzare le cellule immunitarie e i loro sottogruppi in base ai loro marcatori di superficie cellulare. Questa revisione descrive un protocollo basato sul taglio manuale a cubetti, la digestione enzimatica e la filtrazione attraverso un filtro cellulare per l'isolamento di sospensioni cellulari uniformi dal tessuto implantare sezionato. Inoltre, è stato spiegato un protocollo di colorazione della citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per le impostazioni iniziali del citometro per caratterizzare e quantificare queste cellule isolate mediante citometria a flusso.

Introduction

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I progressi nel campo della medicina hanno portato all'uso frequente di materiali impiantati per sostenere la funzione o la ricrescita del tessuto danneggiato 1,2. Questi includono dispositivi come pacemaker, impianti cosmetici ricostruttivi e placche ortopediche utilizzate per la fissazione delle fratture ossee 3,4. Tuttavia, i materiali utilizzati per realizzare questi impianti e le posizioni in cui vengono impiantati giocano un ruolo importante nel determinare il successo di questi impianti 5,6,7<....

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Protocol

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NOTA: La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo di citometria a flusso.

1) Preparazione dei reagenti

  1. Preparare i terreni per la diluizione degli enzimi e per la coltura dei tessuti.
    1. Aggiungere 5 mL di soluzione tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) in 500 mL di terreno RPMI e agitare bene. Conservare il terreno a 4 °C fino al successivo utilizzo.
  2. Calcolare il volume della soluzione enzimatica.
    NOTA: Il volume della soluzione enzimatica è il volume del terreno contenente gli enzimi (collagenasi e DNasi I) che saranno necessari per....

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Results

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Il processo di sviluppo dei pannelli di citometria a flusso per l'analisi immunitaria si basa spesso sul confronto dei risultati con i dati esistenti e la letteratura in materia. La conoscenza di come le popolazioni possono presentarsi nella citometria a flusso è fondamentale per una corretta interpretazione dei dati. Indipendentemente da ciò, le popolazioni e i tipi di cellule possono apparire in modo diverso nei diversi tessuti, quindi è prevedibile una certa variabilità. Nel contesto d.......

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Discussion

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Questa revisione descrive una metodologia dettagliata per isolare le cellule da impianti di biomateriali per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Inoltre, è stato fornito un protocollo dettagliato per la colorazione della sospensione cellulare per la citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per la configurazione di un citometro a flusso per ottenere risultati ottimali. I metodi di isolamento cellulare possono comportare più fasi, spesso utilizzando la dissezione manuale dei tessuti seguita dalla diges.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, tra cui il National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Dichiarazione di non responsabilità: il NIH, i suoi funzionari e dipendenti non raccomandano o approvano alcuna azienda, prodotto o servizio.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette coniche da 50 mLFisher Scientific14-432-22
Piastra a 6 pozzettiFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655Per il solo fissaggio delle cellule
Albumina sierica bovinaMillipore SigmaA7906Per la preparazione di FACS tampone di colorazione
CD11b AF700Biolegend101222Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5Biolegend117325Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121Clone: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207 Clone: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Clone: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Clone: 104/A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Clone: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouseBD Biosciences552843Per il controllo della compensazione
DNasi IMillipore Sigma11284932001Deossiribonucleasi pancreatica bovina I (DNasi I)
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Clone: BM8
Fc BlockBiolegend101301Clone: 93
Kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazioneBD Biosciences554714Per il fissaggio e la permeabilizzazione delle cellule.
Tampone HEPESThermo Fisher15630080Tampone per integrare i terreni cellulari
LiberaseMillipore Sigma5401127001Miscela di Collagenasi I e Collagenasi II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo FisherL23105Colorante vitale
Ly6c AF488Biolegend128015Clone: HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633Clone: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Clone: M5/114.15.2
Soluzione salina tampone fosfatoThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Terreni di coltura cellulare
Siglec F BV605BD Biosciences740388Clone: E50-2440
Piastraa 96 pozzetti con fondo a V

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

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Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

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