Vari modelli animali di ernia diaframmatica congenita e occlusione tracheale fetale presentano vantaggi e svantaggi per quanto riguarda questioni etiche, costi, difficoltà chirurgiche, dimensioni, tassi di sopravvivenza e disponibilità di strumenti genetici. Questo modello fornisce un nuovo strumento per studiare l'impatto sia dell'occlusione tracheale che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.
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Articolo metodologico
Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'occlusione tracheale fetale (TO), una modalità di trattamento consolidata, promuove la crescita polmonare fetale e la sopravvivenza in ernia diaframmatica congenita grave (CDH). Dopo TO, la ritenzione del liquido epiteliale secreto aumenta la pressione luminare e induce la crescita polmonare. Vari modelli animali sono stati definiti per comprendere la fisiopatologia di CDH e TO. Tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi come la difficoltà della tecnica, le dimensioni dell'animale, il costo, alti tassi di mortalità e la disponibilità di strumenti genetici. Qui viene descritto un nuovo modello transuterino di TO fetale murino. I topi gravidi venivano anestetizzati e l'utero esposto attraverso una laparotomia mediana. La trachea di feti selezionati era legata con una singola sutura transuterina posta dietro la trachea, un'arteria carotide e una vena giugulare. La diga è stata chiusa e ha permesso di riprendersi. I feti venivano raccolti poco prima del parto. Il rapporto tra peso polmonare e corpo nei feti TO era superiore a quello dei feti di controllo. Questo modello fornisce ai ricercatori un nuovo strumento per studiare l'impatto sia del TO che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.
Introduzione
L'ernia diaframmatica congenita (CDH) si verifica in gravidanze 1:2500 e si traduce in ipoplasia polmonare e ipertensione polmonare neonatale1,2,3,4,5,6. L'occlusione tracheale fetale (TO) è una terapia prenatale stabilita nei pazienti affetti da CDH grave che coinvolge la fetoscopia nella settimanagestazionale 26-30 in cui un palloncino viene posizionato appena sopra la carena e quindi rimosso nella 32a settimana gestazionale. Questo TO temporaneo induce la crescita polmonare fetale e migliora la sopravvivenza. La sindrome da ostruzione delle alte vie aeree congenite è una condizione letale associata all'iperplasia polmonare, che ha ispirato i chirurghi a eseguire l'occlusione artificiale della trachea per promuovere la ritenzione del liquido epiteliale secreto. Questa occlusione ha aumentato la pressione luminare e indotto la crescita polmonare7. Tuttavia, l'occlusione deve essere invertita per consentire la maturazione delle cellule epiteliali.
Vari modelli animali di CDH e TO - ovino, coniglio, ratto e topo - sono stati sviluppati per comprendere la fisiopatologia di CDH e TO. Tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi come la difficoltà della tecnica, le dimensioni dell'animale, il costo, alti tassi di mortalità e la disponibilità di strumenti genetici. Sebbene la tecnica chirurgica utilizzata per il modello ovino sia molto simile a quella utilizzata nell'uomo e possa essere invertita, i principali inconvenienti di questo modello sono le spese dell'animale, il lungo periodo gestazionale e il numero limitato di interventi chirurgici possibili. Il modello di coniglio ha un periodo gestazionale più breve ed è meno costoso del modello di pecora. Tuttavia, il modello di coniglio è irreversibile8,9. Il modello murino ha il costo più basso, il maggior numero di feti per gravidanza, il genoma meglio caratterizzato e strumenti ampiamente disponibili per le analisi cellulari e molecolari. Tuttavia, uno svantaggio fondamentale è la mancanza di reversibilità dell'TO, che impedisce la piena comprensione dell'impatto di TO. Qui viene presentato un metodo che combina tutti i vantaggi dei modelli precedentemente menzionati e crea un modello to roditore facile, potenzialmente reversibile e minimamente invasivo.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati conformi alla Guida nazionale degli istituti sanitari per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (PUBBLICAZIONI N. 80023 del NIH, rivedute nel 1978). La procedura è stata approvata con il protocollo IACUC #2016-0068 dal Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione
- Per accoppiare topi C57BL/6 di tipo selvaggio abbinati all.m'età (WT), metterli nella stessa gabbia alle 18:00.m e separarli alle 9:00 del giorno successivo.
- Per determinare il giorno 0 embrionale (E0), guardare la spina vaginale, che ha una zona esterna omogenea attaccata alla parete vaginale e una zona interna fibrosa e include alcuni spermatozoi che formano masse impigliate mescolate con le fibre del materiale della spina.
- Registrare il peso dei topi al momento dell'accoppiamento.
- Ri pesare i topi sull'E10 per garantire una gravidanza in corso.
- Eseguire l'intervento chirurgico su E16.5 (fase canalicolare precoce).
- Sterilizzare gli strumenti che verranno utilizzati durante l'intervento chirurgico: forbici, porta ago, pinze, morsetti e coltelli chirurgici e maniglie.
- Preriparare la piattaforma chirurgica a 24 °C e preparare la soluzione salina calda (24 °C) prima dell'intervento chirurgico.
- Crea un ambiente caldo per il recupero e lascia il cibo umido all'interno della gabbia per l'alimentazione precoce.
- Resta con gli animali gestiti fino a quando non possono nutrirsi da soli.
- Tenere i topi operati da soli nelle loro gabbie individuali dopo l'intervento chirurgico.
2. Anestesia
- Applicare sottocutaneo 0,1 mg/kg di buprenorfina sulle dighe gravide 1 h prima della procedura.
- Utilizzare continuamente 5 mL/h di isoflurane per l'induzione e 2 mL/h continuamente durante la procedura per l'anestesia.
- Monitorare i movimenti dei cinguettii dei topi gravidi.
3. Laparotomia
- Pulire la superficie addominale con alcool e povidone-iodio. Mantenere condizioni sterili durante l'operazione.
- Eseguire un'incisione verticale per la laparotomia delle dighe gravide. Tagliare tutti i livelli separatamente.
- Identificare le corna uterine su ciascun lato.
- Determinare i feti candidati per l'intervento.
NOTA: Non operare sui feti più vicini alla vagina. - Operare su due feti in ogni corno uterino se ci sono un numero pari di feti su ciascun lato (4 il più delle volte), e su 1 feto in ogni corno uterino se c'è un numero dispari di utero (3 la maggior parte delle volte).
4. Occlusione tracheale
- Utilizzare occhiali di ingrandimento 2,5x per la visualizzazione.
- Posizionare il corno uterino in modo trasversale.
- Prendi i cuccioli, rivolti verso l'alto, tra due dita usando gli occhi dei cuccioli e la coda come guida per posizionare il feto.
- Applicare una leggera pressione sulla testa del cucciolo per consentire l'estensione della testa e quindi la visualizzazione del collo.
- Utilizzare una sutura in polipropilene 6.0 con un ago atraumatico per eseguire TO (Figura 1). Tenere la placenta sul lato e lontano dai punti di ingresso e di uscita dell'ago.
- Inserire l'ago trasversalmente attraverso il lato dell'utero lontano dalla placenta attraverso la parteanteriore 1/3 del collo.
- Spostare delicatamente l'ago fino alla linea mediana del collo e dirigerlo verso la parte anteriore, quindi uscire dal collo tra la trachea e di fronte alla focaia carotide e all'utero.
- Annodare la sutura, facendo attenzione a mantenere l'integrità delle membrane e della parete uterina e mantenere il cordone ombelicale al sicuro durante il nodo.
Figura 1: Occlusione tracheale. (A) La sutura transuterina che passa attraverso il collo. (B) Rappresentazione schematica delle strutture dopo che la sutura passa attraverso e prima del nodo. Abbreviazioni: C = Arteria carotide; J = Vena giugulare; T =Trachea; E = Esofago; V = Vertebra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Chiusura della parete addominale
- Sostituire il corno uterino nell'addome.
- Iniettare 2 mL di salina sterile calda nella cavità peritoneale prima della chiusura.
- Metti una sutura di poliglatina 5/0 da corsa per chiudere la parete addominale e chiudere la pelle con una sutura di seta non funzionante.
- Applicare 0,1 mg/kg di buprenorfina intraperitonealmente per l'analgesia e consentire il recupero della diga in un'incubatrice calda.
6. Vendemmia
- Applicare l'anestesia sulla diga incinta e raccogliere tutti i feti all'E18.5 con la sezione cesarea.
- Controlla la vitalità dei feti osservando i movimenti dei feti.
- Utilizzare almeno due tecniche diverse per l'eutanasia: l'insufflazione di anidride carbonica e la lussazione cervicale.
- Rimuovere i corpi secondo la regolazione del laboratorio veterinario.
- Pesa tutti i feti.
- Eseguire un'incisione verticale sul torace per la toracotomia per rimuovere i polmoni.
- Sezionare i polmoni degli embrioni e pesarli per calcolare il rapporto peso polmonare/corporeo totale (LBWR = (peso polmonare sinistro + peso polmonare destro)/peso corporeo x100).
7. Istologia
- Congelare i tessuti in azoto liquido, composto ottimale della temperatura di taglio e ghiaccio secco.
- Tagliare i campioni in sezioni da 10 μm utilizzando un criostato e montarli su diapositive rivestite in polilisina.
- Cuocere le diapositive a 60 °C durante la notte e macchiare le diapositive al forno con ematossilina ed eosina prima di montarle per l'acquisizione di immagini con ingrandimento 10-20x utilizzando un microscopio a campo largo.
8. Trattamento tissutale per analisi di proteine e DNA
- Congelare i polmoni fetali sezionati e omogeneizzarli in 300 μL di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione. Centrifuga a 4 °C per 5 min a 18.000 × g.
- Estrarre e quantificare proteine, DNA e RNA10,12.
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Risultati
Questo studio ha esaminato 37 feti: 20 (54,1%) rispetto ai 17 (45,9%) come controllo. Poiché la trachea non poteva essere occlusa in 4 feti nel gruppo TO, sono stati esclusi dallo studio. Non c'era alcuna differenza significativa nella mortalità in entrambi i gruppi: 4 feti (25%) nel gruppo TO e 2 feti (12%) nel gruppo di controllo (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, intervallo di confidenza del 95% (CI) 0,39-16,05). Il peso corporeo medio, il peso polmonare e il rapporto peso polmonare/corpor...
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Discussione
Questo metodo descrive una procedura chirurgica di occlusione tracheale fetale nei topi e il suo impatto sullo sviluppo polmonare. Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che dovrebbero essere eseguiti con attenzione per avere successo. Il calore della piattaforma su cui avviene l'intervento chirurgico e la soluzione salina introdotta nella cavità peritoneale è fondamentale per la progressione della gravidanza. Inoltre, è necessario applicare una leggera pressione sulla testa dei cuccioli per garantire l'esposizio...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica dalle agenzie di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro. Tutti gli autori hanno dato contributi sostanziali all'ideazione e alla progettazione dello studio, all'acquisizione, all'analisi e all'interpretazione dei dati, redigendo l'articolo e rivederlo per importanti contenuti intellettuali e approvazione finale della versione da presentare. Gli autori ringraziano Can Sabuncuoğlu per i suoi gentili sforzi nella produzione dell'opera d'arte della tecnica chirurgica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Per anestesia regionale |
| Isoflurano | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | Per anestesia generale |
| Occhiali di ingrandimento | USA Medico-chirurgico | SLR-250LBLK | Almeno 2,5x |
| Nikon 90i microscopio | Nikon | 3417 | Fluorescenza motorizzata |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Dü ren, Germania | 740952.5 | |
| Kit di analisi delle proteine Pierce BCA per l'isolamento del DNA | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Quantificazione delle proteine |
| Sutura in poliglactina | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, taglio |
| di vetrini in polilisina | VWR | 48382-117 | Vetrini di adesione per microscopio |
| Sutura in polipropilene | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA tampone | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Isolamento proteico |
| Sutura di seta | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, taglio |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Isolamento dell'RNA |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
