Articolo metodologico

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

DOI:

10.3791/61780

⸱

24 febbraio 2021

 ,  , 
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la rimozione dei lipidi endogeni dagli allergeni e la loro sostituzione con ligandi specificati dall'utente attraverso HPLC in fase inversa accoppiato con ricottura termica. 31 di cui: La commissione per la P-NMR e dicroismo circolare consentono la rapida conferma della rimozione/caricamento del ligando e il recupero della struttura allergenica nativa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molti allergeni principali si legano a molecole idrofobiche lipidiche, tra cui Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Questi ligandi sono fortemente mantenuti e hanno il potenziale per influenzare il processo di sensibilizzazione stimolando direttamente il sistema immunitario o alterando le proprietà biofisiche della proteina allergenica. Al fine di controllare queste variabili, sono necessarie tecniche per la rimozione dei ligandi legati endogenamente e, se necessario, la sostituzione con lipidi di composizione nota. L'allergene scarafaggio Bla g 1 racchiude una grande cavità idrofobica che lega una miscela eterogenea di lipidi endogeni quando purificata con tecniche tradizionali. Qui descriviamo un metodo attraverso il quale questi lipidi vengono rimossi utilizzando HPLC in fase inversa seguito da ricottura termica per produrre Bla g 1 nella sua forma Apo o ricaricati con una miscela definita dall'utente di acidi grassi o carichi fosfolipidici. L'accoppiamento di questo protocollo con saggi biochimici rivela che i carichi di acidi grassi alterano significativamente la termostabilità e la resistenza proteolitica di Bla g 1, con implicazioni a valle per il tasso di generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità. Questi risultati evidenziano l'importanza dei protocolli di rimozione/ricarica lipidica come quello descritto nel presente documento quando si studiano gli allergeni provenienti sia da fonti ricombinanti che naturali. Il protocollo è generalizzabile ad altre famiglie di allergeni tra cui lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornendo un prezioso strumento per studiare il ruolo dei lipidi nella risposta allergica.

Introduzione

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Un'indagine del database degli allergeni rivela che gli allergeni si trovano solo nel 2% di tutte le famiglie proteiche conosciute, suggerendo che le proprietà funzionali e biofisiche comuni contribuiscono all'allergenicità1. Di queste proprietà, la capacità di legare carichi lipidici sembra essere fortemente sovrarappresentate tra gli allergeni, suggerendo che questi carichi possono influenzare il processo di sensibilizzazione1. In effetti, è stato dimostrato che l'allergene della noce del Brasile Ber e 1 richiede la co-somministrazione con il suo lipide endogeno per realizzare il suo pieno potenzialesensibilizzante 2. Questi lipidi potrebbero potenzialmente stimolare il sistema immunitariodirettamentecome illustrato dagli allergeni degli acari Der p 2 e Der p 7, entrambi condividono una forte omologia strutturale con proteine leganti LPS 3,4,5. Sulla base di questa osservazione è stato proposto che Derp 2 e Der p 7 potessero legare lipidi batterici e stimolare direttamente il sistema immunitario ospite attraverso la segnalazione mediata da TLR4, facilitando il processo di sensibilizzazione5,6. È anche possibile che i lipidi legati endogenamente possano alterare le proprietà biofisiche delle stesse proteine allergeniche. Ad esempio, la capacità di Sin a 2 (senape) e Ara h 1 (arachidi) di interagire con vescicole fosfolipidiche ha aumentato significativamente la loro resistenza alla degradazione gastrica ed endosomica7, mentre il legante al principale allergene di polline di betulla Bet v 1 ha alterato sia il tasso di lavorazione endosomica che la diversità dei peptidirisultanti 8. Ciò è particolarmente rilevante per l'allergenicità data la correlazione osservata tra stabilità, generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità per proteine come Bet v 1 e Bla g 1; quest'ultimo sarà oggetto di questo lavoro9,10.

Bla g 1 rappresenta il membro prototipo della famiglia proteica dell'insetto Major Allergen (MA) e possiede una struttura unica composta da 12 alfa eliche anfipatiche che racchiudono una cavità idrofobica anormalmentegrande 9,11. La struttura cristallina a raggi X disponibile di Bla g 1 mostra la densità degli elettroni all'interno di questa cavità coerente con i ligandi fosfolipidici o acidi grassi legati; una congettura confermata da 31P-NMR e spettrometria di massa. Questi carichi erano di natura eterogenea e la loro composizione dipendeva fortemente dalla fonte allergenica, con diversi profili lipidici osservati per il ricombinante Bla g 1 espresso in E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificato dalla sua fonte naturale di allergeni (frass di scarafaggio) conteneva prevalentemente acidi grassi all'interno del suo sito di legame, con una miscela di palmitato, oleato e stearato identificati come suoi ligandi "naturali"9,11. La capacità di Bla g 1 di trattenere lipidi e acidi grassi a seguito di molteplici fasi di purificazione ostacola gli sforzi per studiare la proteina in isolamento. Al contrario, è stato suggerito che i ligandi naturali palmitati, stearati e oleati di Bla g 1 (d'ora in poi denominati nMix) svolgano un ruolo chiave sia nella sua allergenicità che nella funzione biologica nativa9. Tuttavia, questi ligandi non sono presenti nel Bla g 1 ottenuto da fonti ricombinanti, rendendo difficile valutare questa ipotesi. Problemi simili sono stati osservati per altri allergeni leganti lipidici come Bet v 112,13. Per facilitare lo studio sistematico delle interazioni lipidico-allergene abbiamo sviluppato un protocollo attraverso il quale gli allergeni possono essere quantitativamente spogliati dei loro lipidi legati endogenamente e ricostituiti in forma Apo o caricati con ligandi specifici.

Gli allergeni sono più comunemente purificati dalle loro fonti naturali o ricombinanti usando cromatografia di affinità e/o cromatografia ad esclusione di dimensioni. Qui, introduciamo un ulteriore passaggio di purificazione sotto forma di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) impiegando una colonna C18 in fase inversa da cui l'allergene viene eluito in un solvente organico simile ai protocolli sviluppati per le proteine leganti gli acidigrassi 14. La proteina risultante viene quindi sottoposta a una fase di ricottura termica in assenza o presenza di acidi grassi e/o fosfolipidi. Oltre a recuperare la piega nativa Bla g 1, le temperature elevate aumentano la solubilità e l'accessibilità dei carichi lipidici, producendo Bla g 1 in forma di Apo o caricati uniformemente con il ligando idrofobico desiderato. 31 di cui: La commissione per la Gli spettri P-NMR di Bla g 1 purificati in questo modo hanno confermato la completa rimozione dei ligandi legati endogenamente e la sostituzione uniforme con i composti desiderati, mentre il dicroismo circolare ha confermato il successo del recupero della piega Bla g 1. L'utilità di questo metodo è evidenziata in un recente lavoro in cui è stato trovato il legame del carico per migliorare la termostabilità e la resistenza proteolitica bla g 1, alterando la cinetica della generazione di epitopi delle cellule T con potenziali implicazioni per la sensibilizzazione e l'allergenicità9.

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Protocollo

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1. Bla g 1 clonazione

  1. Ottenere il gene per l'allergene scarafaggio Bla g 1.0101 (residui 34-216), che rappresenta una singola ripetizione del dominio MA. Per semplicità, Bla g 1 sarà usato durante tutto il lavoro per rappresentare questa singola ripetizione, piuttosto che l'intera trascrizione bla g 1.0101.
  2. Subcllone il gene Bla g 1 nel vettore desiderato. In questo studio, il gene contenente un tag N-terminale glutatione S-transferasi (GST) accoppiato a un sito di scissione della proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) è stato inserito in un vettore pGEX per l'espressione come descrittoin precedenza 11.
  3. Trasformate il vettore Bla g 1 pGEX in cellule BL21 DE3 E. coli.
    1. Preparare uno stock di 10 ng/μL del vettore desiderato.
    2. Combinare 1 μL di 10 ng/μL di DNA stock con 50 μL di cellule BL21 DE3 come fornito dal produttore.
    3. Incubare la miscela BL21 DE3-DNA per 30 minuti sul ghiaccio. Trasferire in un bagno d'acqua a 42 °C per 1 min, quindi trasferire immediatamente sul ghiaccio per un'ulteriore incubazione di 1 minuto.
    4. Aggiungere 200 μL di mezzi LB alle cellule e incubare per un ulteriore 1 h a 37 °C.
    5. Placcare le cellule trasformate su piastre LB-Agar contenenti 100 mg/L di ampicillina e crescere a 37 °C durante la notte.

2. Espressione iniziale e purificazione

  1. Inoculare 1 L di supporti LB contenenti 100 mg/L di ampicillina con una singola colonia di cellule BL21 DE3 trasformate con il vettore Bla g 1 come descritto in 1.3. Crescere a 37 °C durante la notte.
  2. Il giorno successivo, le cellule di raccolta (OD600 ~1,5) tramite centrifugazione a 6.000 x g per 10 minuti e resuspend in 2 L di 2 mezzi YT contenenti 100 mg/L di ampicillina. Lasciare crescere le cellule per un ulteriore 1 h a 37 °C a un OD600 > 0,6.
  3. Indurre l'espressione proteica attraverso l'aggiunta di 0,5 mM IPTG. Trasferire le cellule a 18 °C e incubare durante la notte.
  4. Il giorno successivo, raccogliere le cellule come descritto al punto 2.2. Il pellet di cellule risultante può essere congelato e conservato a -20 °C.
  5. Pellet di resuspend ottenuto da 1 L di coltura in 50 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl) contenente 1 compressa inibitore della proteasi (o equivalente) e 1 μL di nucleasi benzonasi.
  6. Le cellule Lyse che utilizzano un sonicatore a sonda (500 W, 20 kHz) sono impostate sul 30-50% di potenza per 4 minuti con un ciclo di servizio del 50%. Mantenere il lysate in un bagno di ghiaccio durante la sonicazione
  7. Centrifuga lysate a 45.000 x g per 20 min. Scartare la frazione insolubile (pellet).
    1. Rimuovere 28 μL di proteine solubili. Combinare con 7 μL di buffer SDS-PAGE 5x e memorizzare per l'analisi SDS-PAGE. Ripetere questo passaggio per le frazioni di flusso, lavaggio ed eluizione della colonna GST prima e dopo l'incubazione con TEV.
  8. Applicare proteine solubili (supernatanti) su una colonna di resina glutatione (~10 mL volume totale del letto) equilibrata in PBS pH 7.4.
  9. Lavare tutte le proteine non unite utilizzando 50 mL di PBS.
  10. Elute GST-Bla g 1 con 50 mL di PBS contenente glutatione ridotto di 10 mM.
  11. Incubare proteine eluite con proteasi TEV da 0,2 kU durante la notte a 4 °C o temperatura ambiente per 6 ore per rimuovere l'etichetta GST.

3. Rimozione endogena dei lipidi tramite HPLC in fase inversa

  1. Raccogliere il Bla g 1 scisto e concentrarlo a ~2 mL utilizzando un'unità filtrante centrifuga con un taglio del peso molecolare <10 kDa.
    1. Aggiungere <12 mL alla parte superiore del concentratore e ruotare a 5.000 x g per 10-15 minuti in un rotore a benna oscillante.
      NOTA: Il volume del campione e la velocità di rotazione variano in base al filtro specifico e al tipo di rotore impiegato. Consultare la documentazione del produttore prima dell'uso.
  2. Caricare il concentrato su un sistema HPLC da 250 x 10 mm dotato di una colonna cromatografica in fase inversa C18 equilibrata con il 97% di tampone A (acqua, 0,1% di acido trifluoroacetico) e il 3% tampone B (acetonitrile, 0,1% acido trifluoroacetico).
    NOTA: possono essere utilizzate colonne più piccole, ma le proteine potrebbero essere caricate ed eluizzate utilizzando più cicli per adattarsi alla ridotta capacità di legame. Quando si seleziona una colonna assicurarsi che le perline di resina abbiano una dimensione delle particelle di < 5 μm e dimensioni dei pori di >200 Å per consentire un'efficace separazione delle molecole delle dimensioni di proteine
    ATTENZIONE: L'acido trifluoroacetico è altamente corrosivo e deve essere erogato all'interno di una cappa aspirante utilizzando DPI appropriati (ad esempio guanti nitrile, camice da laboratorio e occhiali). L'acetonitrile è sia moderatamente tossico, volatile e altamente infiammabile, deve essere usato e dispensato all'interno di una cappa aspirante utilizzando dPI appropriati (ad esempio guanti di nitrile, camice da laboratorio e occhiali).
  3. Elute Bla g 1 utilizzando il protocollo mostrato nella tabella 1 ad una portata di 1,5-4,0 mL/min. Monitorare il processo di eluizione utilizzando l'assorbanza di fluorescenza a 280 nm.
    1. Raccogliere e mettere in piscina Bla g 1 frazioni. Bla g 1 normalmente eluisce a >74% tampone B, o ~34-40 min.
      NOTA: il tempo di eluizione varia leggermente a seconda della portata o delle dimensioni della colonna. Raccogli frazioni basate su A280 per ottenere i migliori risultati.
Tempo (min)Buffer A (%)Buffer B (%)
0973
10973
253565
55595
65595
70973

Tabella 1: Protocollo di eluizione per bla g 1. Tabella che illustra il gradiente di eluizione impiegato nell'isolamento di Bla g 1 utilizzando una colonna HPLC C18.

  1. Aliquota il campione in provette di vetro, non riempiendo alcuna provetta più che a metà strada (~4 mL). Coprire i tubi con pellicola di paraffina e perforare il rivestimento con due fori per consentire lo sfiato.
    1. Preparare un'aliquota separata di 1 mL (aliquota di prova). Questo verrà utilizzato per determinare il rendimento previsto.
  2. Congelare i campioni e testare l'aliquota mettendoli in un congelatore a -80 °C per 1 h o immersione in azoto liquido. Nel caso del successivo, il tubo deve essere ruotato continuamente per evitare rotture della provetta a causa dell'espansione della fase liquida al momento del congelamento.
  3. Asciugare i campioni di proteine delipidati risultanti utilizzando un liofilizzatore. Le proteine essiccate possono essere conservate a 4 °C per diversi mesi in un contenitore sigillato.

4. Ricostituzione di Bla g 1 caricato con Apo e carico

  1. Determinare la resa prevista di Bla g 1.
    1. Aliquota di prova risuspend liofilizzata, delipidata (post-HPLC) in 5 mL di tampone di ripiezione( 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
    2. Scaldare la miscela in un bagno d'acqua (becher da 500 mL con acqua da 250 mL e mescolare la barra su una piastra calda) a 95 °C. Soluzioni vortici in modo intermittente e incubare a 95 °C per 0,5-1 h.
    3. Rimuovere il fuoco e lasciare lentamente che il bagno d'acqua equilibra a temperatura ambiente (~1 h). La proteina ricotta può essere conservata in questa forma durante la notte a 4 °C, se necessario.
    4. Passare la miscela bla g 1-lipidica ricotta attraverso un filtro siringa da 0,22 μM per rimuovere il particolato.
    5. Tamponare lo scambio della proteina filtrata 3x in PBS pH 7.4 utilizzando un filtro centrifugo con taglio da 10 kDa come discusso al punto 3.1 per rimuovere gli acidi grassi liberi residui e il solvente organico.
    6. Valutare la concentrazione proteica utilizzando il saggio BCA o altro metodo preferito come l'assorbanza UV. Utilizzare questa per determinare la resa prevista per le restanti aliquote Bla g 1.
  2. Ricostituire Apo- o carico Caricato Bla g 1
    1. Resuspend Bla g 1 aliquote nel tampone di ripiezione come descritto al 4.1.1.
    2. Per produrre Apo-Bla g 1, ripetere i passaggi 4.1.2–4.1.6 per ottenere la resa desiderata.
    3. Per caricare Bla g 1 con acidi grassi, preparare soluzioni stock da 20 mM del carico di acidi grassi desiderato in metanolo o DMSO.  Quindi, passa al passaggio 4.2.5.
    4. Per caricare Bla g 1 con fosfolipidi, preparare uno stock di 10 mg/ml del carico desiderato in cloroformio all'interno di una provetta di vetro.
      1. Evaporare il cloroformio per produrre un film lipidico. Aggiungere PBS alla provetta per produrre una concentrazione finale di fosfolipidi di 20 mM.
        ATTENZIONE: Il cloroformio è dannoso se inalato o ingerito. Utilizzare in una cappa aspirante chimica o utilizzare un respiratore se è disponibile una ventilazione inadeguata. Utilizzare guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali durante la manipolazione. Consultare MSDS prima dell'uso.
      2. Reidratare il film lipidico riscaldarlo al di sopra della temperatura di transizione di fase del carico lipidico e vortice fino a quando la soluzione diventa torbide. Si noti che la sonicazione potrebbe essere necessaria per ripresopendare completamente e reidratare alcuni carichi.
      3. Se è necessaria la sonicazione, posizionare la provetta nel sonicatore da bagno (100 W, 42 kHz) e sonicare alla massima potenza fino a quando il carico non viene rimorsi. In alternativa, un sonicatore a sonda (descritto al punto 2.6) può essere utilizzato con una potenza del 10-20% con un duty cycle del 50%.
        ATTENZIONE: La sonicazione utilizza onde sonore ad alta frequenza che possono danneggiare l'udito. Utilizzare DPI antirrosimento del rumore (tappi per le orecchie o silenziatori). Se possibile, posizionare il sonicatore all'interno dell'armadio o della camera di smorzamento del suono.
    5. Aggiungere l'acido grasso desiderato o il carico fosfolipidico per produrre un eccesso molare 20x di ligandi rispetto a Bla g 1 in base alla resa prevista determinata in 4.1. Il volume totale di solvente organico aggiunto in questo passaggio non deve superare il 2%. Vortice da mescolare.
      NOTA: 1 L di cellule Bl 21 DE3 produce tipicamente ~0,25-0,4 nmol di proteina, corrispondente a ~400 μM ligando per tubo.
    6. Ricottura della proteina come descritto al 4.1.

5. Conferma della rimozione/carico del carico fosfolipidico tramite 31P-NMR

  1. Concentrare campioni di Bla g da 1 a >100 μM caricato con Apo o carico utilizzando un'unità filtrante centrifuga come descritto al punto 3.1.
  2. Reidratare il fosfolipide di riferimento nel tampone PBS a concentrazioni finali di 2, 1,5, 1, 0,5 e 0,25 mM.
  3. Diluire i campioni 1:1 con tampone di colina (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholato) ad un volume totale di ~600 μL.
    NOTA: Il cholato viene utilizzato in questo passaggio per estrarre e solubilizzare completamente i lipidi dalla cavità idrofobica Bla g 1. Ciò garantisce che l'ambiente chimico che circonda i gruppi testo fosfolipidici sia coerente tra diversi campioni, consentendone la valutazione quantitativa utilizzando 31P-NMR. L'uso del colato può essere sostituito con cloroformio/metanolo come descritto in precedenza15.
  4. Acquisire spettri 1D 31P-NMR dei campioni bla g 1 solubilizzati in colina e standard fosfolipidi di riferimento utilizzando una sonda a banda larga.
    NOTA: Gli spettri 31P-NMR presentati in questo lavoro sono stati ottenuti utilizzando uno spettrometro a 600 MHz. Tuttavia, studi precedenti che utilizzano tecniche simili suggeriscono che una sensibilità accettabile può essere raggiunta a livelli di applicazione fino a 150-200 MHz15.
  5. Elaborare i dati risultanti utilizzando il softwareappropriato 16.
  6. Ottenere intensità di picco utilizzando il software di visualizzazione NMRpreferito 17.
  7. Confrontare gli spettri Bla g 1 31P-NMR con quelli ottenuti per i campioni di riferimento fosfolipidici per confermare la rimozione dei ligandi legati endogenamente e/o il legame dei ligandi desiderati in base agli spostamenti chimici dei picchi visibili (o della loro mancanza).
    1. Confermare la stechiometria a legame completo confrontando l'intensità di picco dello spettro Bla g 1 con quella degli standard di riferimento fosfolipidici.

6. Conferma Bla g 1 pieghevole

  1. Preparare campioni da 0,5 μM di Bla g 1 in tampone CD (100 mM KH2PO4, pH tampone 7,5). Caricare 2 mL del campione in una cuvetta CD da 10 mm con barra di agitazione magnetica.
  2. Misurare lo spettro CD di Bla g 1 per confermare la ricostituzione della struttura secondaria. Assicurarsi che la tensione del fotomoltiplicatore (PMT) non superi le raccomandazioni del produttore (generalmente 1 kV).
    1. Misurare il segnale CD da 260 a 200 nm a 25 °C con un'intonazione dati di 0,2 nm e una velocità di scansione di 20 nm/s con un tempo di integrazione dei dati di 1 s.
  3. Aumentare la temperatura nella cella CD da 25 °C a 95 °C ad una velocità di 0,5 °C/min. Attivare la barra di agitazione magnetica per garantire che la temperatura sia uniforme in tutto il campione.
  4. Monitora il CD a 222 nm, prendendo letture ogni 2 °C.
  5. Adattare i dati risultanti a una curva di Boltzman a 2 stati per determinare la temperatura di fusione. A causa dell'elevata stabilità di Bla g 1, la temperatura di fusione (MT25) è stata definita come la temperatura alla quale la proteina ha perso il 25% del suo CD iniziale a 222 nm.

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Risultati

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Usando la cromatografia di affinità, il ricombinante GST-Bla g 1 è stato facilmente isolato ad un alto livello di purezza (Figura 1A), producendo una resa di ~2-4 mg/L di coltura cellulare. L'incubazione notturna con proteasi TEV a 4 °C è sufficiente per rimuovere l'etichetta GST, producendo il prodotto finale a ~ 24 kDa. Si noti che in questo caso c'è una quantità significativa di GST-Bla g 1 nelle frazioni di flusso e lavaggio, suggerendo che la capacità di legame della resina glutatione è stata supera...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descritto in questo lavoro è stato applicato con successo per studiare sistematicamente le proprietà di legame lipidico di Bla g 1. Ciò ha rivelato una correlazione tra legame del carico, termostabilità e lavorazione endosomica, quest'ultima correlata alla diminuzione della generazione di un epitopo noto delle cellule T con potenziali implicazioni per l'immunogenicità9,18. Oltre a Bla g 1, altri allergeni come Pru p 3 e Bet v 1 hanno dimostrato di m...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e il Dr. Robert London per il loro aiuto e assistenza durante tutto questo lavoro, insieme al Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards per l'uso della loro strumentazione e la loro assistenza nella generazione dei costrutti Bla g 1 impiegati in questo studio. Ringraziamo Andrea Adams per l'assistenza con la spettrometria di massa e il Dott. Eugene DeRose per l'assistenza con la strumentazione NMR. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, Z01-ES102906 (GAM). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bla g 1 GeneGenescriptN/AServizio di sintesi genica personalizzato. GenBank Numero di adesione AF072219 Residui 34-216
Affinità naturale purificato Bla g 1 (nBla g 1)Biotecnologie per interniN/AOrdine personalizzato
Sistema HPLC Agilent serie 1100AgilentG1315B, G1311A, G1322ARivelatore, pompa e degasatore UV
Spettrometro Agilent DD2 600 MHzAgilentN/A
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-15AmiconUFC-1008
AmpicillinaFisher ScientificBP1760-5
BenzonasiSigma-AldrichE1014-5KU
Sonda a gradiente Z a banda larga da 5 mmVarianN/a
ChemStation per LC (Software)AgilentN/a
cOmplete Mini Proteasi InhibitorRoche11836153001
Distearoilfosfatidilcolina (18:0 PC)Avanti Polar Lipids850365C
E. Coli BL21 DE3 CellsNew England BiolabsC2530H
Freezone 4.5 Sistema di liofilizzazioneLabconco7750000
Resina di glutationeGenescriptL00206
Glutatione, ridottoFisher ScientificBP25211
Isopropil-beta;-D-tiogalattopiranoside (IPTG)Fisher Scientific34060
Jasco  Spettropolarimetro CDJascoJ-815
Millex Filtro per siringaEMD MilliporeSLGS033SS
NMRPipe (Software)Delaglio et al. N/ADelaglio, F. et al. Nmrpipe - Un sistema di elaborazione spettrale multidimensionale basato su tubi Unix. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (Software)Johnson et al. N/AJohnson, BA & Blevins, R. A. NMR View: Un programma per computer per la visualizzazione e l'analisi dei dati NMR. J. Biomol. NMR 4, 603... 614 (1994).
Acido oleicoSigma-AldrichO1008
Pierce BCA Protein AssaySigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10,0 mm Colonna HPLCAgilentSKU: A2000250X100
Pompa a vuoto SD-200VarianVP-195
Sodio cilato idratoSigma-AldrichC6445
Sodio palmitatoSigma-AldrichP9767
Sodio StearatoSigma-AldrichS3381
VnmrJ (Software)VarianN/A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556(2019).
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