L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.
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Articolo metodologico
Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biostampa sta emergendo come uno strumento promettente per fabbricare modelli di cancro umano 3D che ricapitolano meglio i tratti distintivi critici dell'architettura tissutale in vivo. Nell'attuale biostamma di estrusione strato per strato, le singole cellule vengono estruse in un bioink insieme a complessi segnali spaziali e temporali per promuovere l'auto-assemblaggio gerarchico dei tessuti. Tuttavia, questa tecnica di biofabbricazione si basa su interazioni complesse tra cellule, bioinchiostri e segnali biochimici e biofisici. Pertanto, l'auto-assemblaggio può richiedere giorni o addirittura settimane, può richiedere bioinchiostri specifici e potrebbe non verificarsi sempre quando è coinvolto più di un tipo di cellula. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica per biostampare direttamente sferoidi epiteliali del seno 3D pre-formati in una varietà di bioinchiostri. Gli sferoidi epiteliali del seno 3D prestampati biostampati hanno sostenuto la loro vitalità e l'architettura polarizzata dopo la stampa. Abbiamo inoltre stampato gli sferoidi 3D su reti cellulari endoteliali vascolari per creare un modello di co-coltura. Pertanto, la nuova tecnica di biostamgrafia crea rapidamente un modello di seno umano 3D più fisiologicamente rilevante a costi inferiori e con una maggiore flessibilità rispetto alle tradizionali tecniche di biostamgrafia. Questa versatile tecnica di biostamce può essere estrapolata per creare modelli 3D di altri tessuti in bioinchiostri aggiuntivi.
Introduzione
I modelli tumorali vascolarizzati in vitro 3D sono strumenti essenziali per lo studio meccanicistico della crescita e della metastasi del cancro. Per il cancro al seno in particolare, le cellule epiteliali del seno coltivate a Matrigel si organizzano in sferoidi polarizzati che assomigliano più da vicino all'architettura in vivo dell'acinomammario 1,2,3,4,5,6,7,8. La coltura cellulare epiteliale del seno....
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Protocollo
1. Crescita delle cellule epiteliali del seno e mezzi di dosaggio
- Cellule epiteliali del seno MCF10A
NOTA: La linea cellulare epiteliale del seno immortalato non tumorigenica è derivata da un paziente con malattia fibrocistica43. Le cellule non esprimono il recettore degli estrogeni.- Per preparare 20 μg/mL di fattore di crescita epidermico (FEG), sciogliere 100 μg di FEG liofilizzato in 500 μL di dHsterile 2O per fare 200 μg/mL FEG. Aggiungere 500 μL di 200 μg/mL FEG in 4,5 mL di BSA sterile 0,1% in dH2O per fare una soluzione stock EGF da 20 μg/mL. Conservare le aliquote EGF da 20 μg/mL preparate a -2....
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Risultati
Le cellule epiteliali del seno dovrebbero auto-organizzarsi in sferoidi 3D dopo 5-8 giorni di coltura su soluzione matriciale e in mezzo di coltura con soluzione matriciale al 2%. Gli sferoidi epiteliali al seno MCF10A non cancerogeni dovrebbero apparire rotondi e avere un centro cavo, con l'integrina α6 polarizzata al bordo esterno dello sferoide(Figura 1, l'interno mostra centri cavi). Le cellule epiteliali del cancro al seno MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari. Gli s.......
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Discussione
Questo protocollo è il primo del suo genere a biostampare sferoidi nella loro architettura 3D per la co-coltura con cellule endoteliali anche nella loro architettura 3D. I passaggi critici del protocollo includono la formazione iniziale di sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC. Estrema cautela deve essere presa nell'alimentazione degli sferoidi epiteliali del seno, in quanto sono facilmente interrotti dalla soluzione matriciale. Allo stesso modo, gli sferoidi epiteliali del seno devono essere trattati con cura quando.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata da NIH 1R01HL140239-01 ad AMC. Ringraziamo il Cell Imaging Center della Drexel University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 37 gradi; Incubatore C, 5% CO2 e 95% di umidità | Sanyo | MCO-20AIC | Incubazione cellulare |
| Stampante 3D Bio | su misura | Nessuno | Utilizzato per la biostampa |
| Vetrini da camera a 8 pozzetti | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | per la semina di sferoidi |
| Ago calibro 25 | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | ago per siringa per bioprinting |
| Etanolo assoluto (200 proof) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | ricostituzione di componenti del media |
| Affinipure F(ab′)2 frammenti di capra anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | blocco secondario - Immunofluorescenza |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday anticorpo-Immunofluorescenza |
| Insulina bovina | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additivo |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Agente bloccante -Immunofluorescenza |
| Falcon 70 µ m Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Rimuovere sferoidi grandi o raggruppati |
| CellTracker™ Rosso CMTPX colorante | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-colorante per provette HUVEC |
| Centrifuga compatta | Hermle-Labnet, Edison, NJ | Z206A | Per centrifugazioni cellulari |
| Tossina colera | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Additivo per terreni |
| Provette coniche 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Raccolta e risospensione di cellule |
| Countess II-FL Contatore di cellule | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | celle di conteggio |
| Pipette di vetro (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | risospensione cellulare |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A terreno basale |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 terreno basale |
| Endoteliale Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC terreno basale |
| Endoteliale Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompagnato da un Bulletkit (contenente fattori di crescita) |
| Alexa Fluor™ 488 Falloidina | Thermo Fisher, Waltham, MA | Etichettatura MDA-MB-231 sferoidi | |
| Fetale Siero bovino fetale | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additivo |
| Siero di capra | Thermo Fisher, Waltham, MA | Componente di marcatura dell'immunofluorescenza | |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | componente tampone di immunofluorescenza |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Immunofluorescenza della colorazione dei nuclei |
| Siero di cavallo | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Additivo multimediale |
| Idrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Additivo per terreni |
| Cellule endoteliali della vena umblicale umana (HUVECs) | Applicazioni cellulari, San Diego, CA | 200-05f | Linee cellulari endoteliali |
| Integrina e alfa; 6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Componente di marcatura degli sferoidi in immunofluorescenza |
| dei morti vivi | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Saggio di colorazione delle cellule vive e morte per la vitalità cellulare |
| LSM 700 Microscopio confocale | Zeiss, Thornwood, NY | Utilizzato per visualizzare le cellule | |
| Matrigel - fattore di crescita ridotto 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Sferoide formazione |
| di cellule MCF10A | ATCC | CRL-10317 | Linea cellulare mammaria |
| MDA-MB-231 cellule | ATCC | HTB-26 | Linea cellulare mammaria |
| Paraformaldeide | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | fissativo cellulare |
| Penicillina e streptomicina | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Additivo per terreni |
| Fosfato tamponato Soluzione salina 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Tampone di lavaggio per cellule prima della tripsinizzazione |
| Soluzione salina tampone fosfato 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | componente tampone per immunofluorescenza |
| Prolunga l'oro antisbiadimento Thermo | Fisher, Waltham, MA | P36934 | mezzo montante per immunofluorescenza |
| Fattore di crescita epidermico umano ricombinante, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ componente del terreno di analisi |
| Azide di sodio | Sigma, St.Louis, MO | tampone per immunofluorescenza | S2002-25G |
| Siringa sterile (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | di bioprinting |
| Piatto per coltura tissutale (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | coltura cellulare monostrato |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | Componente tampone per immunofluorescenza | T8787-250ML |
| Blu di tripano 0,4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | additivo contatore di cellule |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | distacco cellulare |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | Componente tampone per immunofluorescenza |
| Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | Additivo per provette HUVEC |
| Software di imaging cellulare Volocity 6.3 | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
Riferimenti
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S.
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Ristampe e permessi
