Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Summary

Descriviamo un metodo più coerente e rapido per quantificare la metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ.

Abstract

Il cancro al seno è una malignità devastante, che rappresenta 40.000 decessi femminili e il 30% delle nuove diagnosi di cancro femminile solo negli Stati Uniti nel 2019. La causa principale dei decessi correlati al cancro al seno è il peso metastatico. Pertanto, i modelli preclinici per il cancro al seno devono analizzare il carico metastatico per essere clinicamente rilevanti. Il modello di cancro al seno 4T1 fornisce un modello di topo spontaneamente metastasibile e quantificabile per il cancro al seno umano allo stadio IV. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli 4T1 quantifica il carico metastatico contando manualmente le colonie macchiate sulle piastre di coltura tissutale. Mentre questo è sufficiente per i tessuti con un minore carico metastatico, l'errore umano nel conteggio manuale causa risultati incoerenti e variabili quando le piastre sono confluenti e difficili da contare. Questo metodo offre una soluzione basata su computer all'errore di conteggio umano. Qui, valutiamo il protocollo usando il polmone, un tessuto altamente metastatico nel modello 4T1. Le immagini di lastre macchiate di metilene blu vengono acquisite e caricate per l'analisi in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina quindi la percentuale dell'area selezionata dell'immagine che è blu, rappresentando la percentuale della piastra con carico metastatico. Questo approccio basato su computer offre risultati più coerenti e rapidi rispetto al conteggio manuale o alla valutazione istopatologica per tessuti altamente metastatici. La coerenza dei risultati di Fiji-ImageJ dipende dalla qualità dell'immagine. Possono verificarsi lievi variazioni nei risultati tra le immagini, quindi si consiglia di prendere più immagini e mediare i risultati. Nonostante i suoi limiti minimi, questo metodo è un miglioramento nella quantificazione del carico metastatico nel polmone offrendo risultati coerenti e rapidi.

Introduction

A una donna su otto verrà diagnosticato un cancro al seno nel corso della sua vita, eppure nonostante le molteplici opzioni di trattamento il cancro al seno è la seconda causa principale di decessi correlati al cancro nelle donne^{americane 1}. Queste donne non stanno morendo per il tumore primario nel seno. Invece, il carico metastatico è responsabile della mortalità di questa malattia in quanto comunemente si diffonde al polmone, all'osso, al cervello, al fegato e ai linfonodi². Per questo motivo, i modelli di cancro al seno devono valutare la metastasi per contribuire a frenare la mortalità di questa malattia. Il modello....

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Virginia Tech e in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L'esecuzione di questo protocollo richiede l'autorizzazione delle istituzioni appropriate e il rispetto di tutte le linee guida appropriate.

1. Coltura cellulare

1. Crea supporti di coltura completi (RPMI + 10% siero bovino fetale +1% Pen Strep). Ravvivare le cellule 4T1 secondo il protocollo ATCC¹⁰ e incubare a 37 °C e al 5% di CO₂ in un pallone T-25 fino a confluenza. Cambia....

Results

Questo metodo contiene semplici regolazioni dal protocollo³ Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T1 e può essere visualizzato nella figura 1. Quando 3 ricercatori separati hanno contato manualmente colonie metastatiche per 12 piastre polmonari (diluizione 1:10), i risultati sono stati molto incoerenti tra diversi contatori(Figura 2A). Tutti i ricercatori sono stati indirizzati a "contare le colonie metastatiche che appaiono come punti blu", ma le.......

Discussion

Come dimostrato, il conteggio manuale delle colonie metastatiche su ogni piastra polmonare può essere un metodo impreciso e impreciso per quantificare la metastasi polmonare, dimostrando la necessità di un migliore mezzo di quantificazione (Figura 2). L'analisi istopatologica differiva leggermente sia dal conteggio manuale che dall'analisi Fiji-ImageJ (Figura 2B e 4D), probabilmente perché le diapositive H&E non sono un campione rappresentativo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera per anestesia	Vedi commenti	Vedi commenti Usa materiali	approvati nelle politiche del tuo istituto
Agente anestetico	Vedi commenti	Vedi commenti Usa materiali	approvati nelle politiche del tuo istituto
BALB/c Topi femmina	The Jackson Laboratory	000651
Forbici smussate	Roboz	RS-6700
Calcolatrice	Qualsiasi	Qualsiasi
Fotocamera	Qualsiasi		Qualsiasi Minimo 8 megapixel
Centrifuga	Qualsiasi	Qualsiasi	Deve essere in grado di 125 x g e 300 x g
Configurazione dell'eutanasia di CO2	Vedi commenti	Vedi commenti	Utilizzare materiali approvati nelle politiche della tua istituzione
Cella frigorifera, frigorifero, cella frigorifera	Qualsiasi	Qualsiasi
Computer con Fiji-ImageJ	Qualsiasi	Qualsiasi	Deve essere in grado di eseguire Fiji-ImageJ
Camera di conteggio	Fisher Scientific	02-671-10
Forbici curve	Roboz	RS-5859
Acqua distillata	Qualsiasi	Qualsiasi
Elastase	MP Biomedicals	100617
Bilancia elettronica	Qualsiasi	Qualsiasi
Siero fetale bovino (FBS)	R& D Systems	S11150
Pinze	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubatrice	Vedi commenti	Vedi commenti	Deve essere in grado di raggiungere il 5% di CO2 e 37 ° C
Metanolo	Fisher Scientific	A412SK-4
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillina Streptomicina	ATCC	30-2300
Perni o aghi		Qualsiasi	Qualsiasi Per bloccare i topi durante l'autopsia
Calibri in plastica	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Bilanciere o rotella	rotante Qualsiasi	Qualsiasi
Forbici affilate	Roboz	RS-6702
Filtro sterile monouso con membrana in PES	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flaconi	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flaconi	Fisher Scientific	10-126-10
Palloni T-75	Fisher Scientific	13-680-65
Bicchiere in plastica a tre angoli	Fisher Scientific	14-955-111F	Utilizzato per pesare i topi
Blu di tripano	VWR	97063-702
Tripsina-EDTA	ATCC	30-2101
Collagenasi di tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138
Piastre per coltura tissutale da 3,5 cm	Nunclon	153066
siringa da 1 mL	BD	309659
provette per microcentrifuga da 1,7 mL	VWR	87003-294
piastre per coltura tissutale da 10 cm	Fisher Scientific	08-772-22
piastra da 12 pozzetti	Corning	3512
provetta per centrifuga da 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Soluzione salina tamponata con phostfato di Dulbco (DPBS)	Fisher Scientific SH30028FS
1X Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
aghi da 27 g 1/2 pollici	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&timido; 2539™)	ATCC	CRL-2539
Provetta da centrifuga da 50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Tioguanina	Sigma-Aldrich	A4882
70 μ Filtro cellulare M	Fisher Scientific	22-363-548
70% etanolo	Sigma Aldrich	E7023	Diluire al 70% con acqua deionizzata