Articolo metodologico

Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus

DOI:

10.3791/61813

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8 giugno 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Viene presentato un protocollo che caratterizza funzionalmente le OR delle zanzare in risposta agli odori umani utilizzando un sistema di espressione di ovociti Xenopus accoppiato con un morsetto di tensione a due elettrodi, fornendo una nuova potente tecnica per esplorare le risposte delle OR delle zanzare all'esposizione agli odori umani.

Abstract

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La zanzara Aedes aegypti (Linnaeus), vettore di molte importanti malattie umane tra cui la febbre gialla, la febbre dengue e la febbre Zika, mostra una forte preferenza per gli ospiti umani rispetto ad altri animali a sangue caldo per i pasti di sangue. I segnali olfattivi svolgono un ruolo fondamentale per le zanzare mentre esplorano il loro ambiente e cercano un ospite umano per ottenere pasti di sangue, trasmettendo così malattie umane. I recettori degli odori (OR) espressi nei neuroni sensoriali olfattivi sono noti per essere responsabili dell'interazione dei vettori delle zanzare con gli odori umani. Per ottenere informazioni più approfondite sulla fisiologia olfattiva di Ae. aegypti e studiare le loro interazioni con gli esseri umani a livello molecolare, abbiamo utilizzato un protocollo ottimizzato dell'espressione eterologa degli ovociti di Xenopus per analizzare funzionalmente i recettori odorosi di Ae. aegypti in risposta agli odori umani. Vengono presentati tre esempi di esperimenti: 1) Clonaggio e sintesi di cRNA di OR e co-recettore del recettore degli odori (Orco) da antenne di Ae. aegypti di quattro o sei giorni; 2) Microiniezione ed espressione di OR e Orco in ovociti di Xenopus ; e 3) Registrazione della corrente di cellule intere da ovociti di Xenopus che esprimono OR/Orco di zanzara con un voltage-clamp a due elettrodi. Queste procedure ottimizzate forniscono un nuovo modo per i ricercatori di studiare la ricezione umana degli odori nelle zanzare Aedes e rivelano i meccanismi sottostanti che regolano la loro attività di ricerca dell'ospite a livello molecolare.

Introduzione

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La zanzara della febbre gialla Ae. aegypti può trasmettere molte malattie mortali tra cui la febbre gialla, la febbre dengue e la febbre Zika, causando un'enorme angoscia e la perdita di vite umane. Le zanzare fanno uso di molteplici segnali come la CO2, l'odore della pelle e il calore corporeo per localizzare i loro ospiti1. Dato che sia gli esseri umani che altri animali a sangue caldo producono CO2 e hanno temperature corporee simili, sembra probabile che le femmine di Ae. aegypti si affidino principalmente all'odore della pelle per la discriminazione dell'ospite2. Questo crea un quadro complesso, tuttavia, con uno studio iniziale che ha isolato più di 300 composti dalle emanazioni della pelle umana3. Ulteriori saggi comportamentali hanno indicato che un certo numero di questi composti evoca risposte comportamentali in Ae. aegypti 4,5,6,7, ma il modo preciso in cui questi composti vengono rilevati dalla zanzara rimane in gran parte sconosciuto. Recenti ricerche del nostro gruppo hanno identificato diversi odori umani che possono essere coinvolti nell'attività di ricerca dell'ospite di Ae. aegypti, anche se i loro ruoli devono ancora essere confermati da ulteriori saggi comportamentali8. Il modo in cui questi odori umani essenziali vengono decodificati nel sistema sensoriale periferico di Ae. aegypti deve ancora essere stabilito.

Gli insetti rilevano gli odori attraverso i sensilli chemiosensoriali sulle loro appendici olfattive. All'interno di ciascuno dei sensilli, diversi recettori olfattivi, inclusi i recettori degli odori (OR), i recettori ionotropici (IR) e i recettori gustativi (GR), sono espressi sulla membrana dei neuroni sensoriali olfattivi9. Questi OR sono responsabili del rilevamento di molti odori incontrati dagli insetti, in particolare gli odori associati al cibo, agli ospiti e ai partner di accoppiamento 10,11,12,13. Uno studio precedente incentrato sulla disorfanizzazione della funzione degli OR in Anopheles gambiae utilizzando il sistema di espressione Xenopus accoppiato con un voltage clamp a due elettrodi ha scoperto che gli OR di Anopheles sono specificamente sintonizzati sugli aromatici che sono i principali componenti nelle emanazioni umane14. Un recente studio sul genoma ha identificato fino a 117 geni OR in Ae. aegypti15. Di conseguenza, un modo per affrontare sistematicamente le funzioni di queste OR di Aedes in risposta a odori biologicamente o ecologicamente importanti come gli odori umani o gli stimoli di ovodeposizione fornirebbe informazioni utili per coloro che cercano di comprendere ulteriormente l'ecologia chimica o la neuroetologia di Ae. aegypti.

La tecnica del morsetto di tensione a due elettrodi (TEVC) è stata originariamente sviluppata per esaminare la funzione dei canali ionici a membrana a metà degli anni '9016,17. Da allora, il TEVC è stato utilizzato per studiare gli OR di un certo numero di diverse specie di insetti 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Questo esame funzionale delle OR ha contribuito in modo sostanziale a rispondere a importanti domande ecologiche negli insetti, tra cui: 1) In che modo gli insetti localizzano le fonti di cibo? 2) In che modo sono attratti dai feromoni sessuali volatili rilasciati dai loro partner di accoppiamento? 3) Come fanno a trovare un sito di ovideposizione perfetto per la loro prole? e 4) Esistono composti, di origine vegetale o sintetici, che possono proteggere efficacemente gli esseri umani dai morsi di insetti? Le risposte a queste domande sono fondamentali per il controllo di importanti vettori di malattie come le zanzare.

Un certo numero di altri approcci, tra cui quelli basati sulla linea cellulare di rene embrionale umano 293 (HEK293), il sistema di neuroni vuoti di Drosophila, la nucleasi a dita di zinco, la nucleasi effettrice simile all'attivatore della trascrizione e il sistema di editing genico CRISPR/Cas9, sono stati utilizzati anche negli studi funzionali OR 12,20,35,36,37. Tuttavia, tutte queste tecniche richiedono le competenze di un biologo molecolare esperto e coinvolgono molteplici fattori potenzialmente confondenti. L'espressione di TEVC/ovociti è in grado di misurare direttamente le correnti dei recettori evocate dagli odori e la conduttanza ionica e ha l'ulteriore vantaggio del tempo di configurazione rapido richiesto per esprimere i recettori dal cRNA. In questo studio, abbiamo quindi utilizzato il TEVC per esaminare le risposte di un Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) contro diversi odorizzanti con potenziale rilevanza biologica, rivelando che gli ovociti espressi con AaegOR55•AaegOrco hanno mostrato una risposta dose-dipendente all'odorante umano benzaldeide.

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Protocollo

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Il protocollo per questa procedura, la cura e l'uso degli animali da laboratorio, è approvato e monitorato (Auburn University's Institutional Animal Care and Use Committee: protocollo approvato # 2016-2987).

NOTA: La sintesi genica personalizzata è una valida alternativa alla clonazione per i geni OR delle zanzare.

1. Collezione di zanzare e appendici olfattive (antenne)

  1. Mantenere le zanzare Ae. aegypti (ottenute dal Dr. James Becnel, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit) a 25 ± 2°C e un fotoperiodo di 12: 12 (L:D) h (luci accese alle 8 del mattino).
  2. Anestetizzare ~800 zanzare femmine di 4-6 giorni senza alimentazione di sangue utilizzando CO2. Tagliare le antenne delle zanzare (tessuti olfattivi) al microscopio (40x) utilizzando un paio di forbici e raccoglierle in una provetta da centrifuga da 1,5 ml conservata su ghiaccio secco.
    NOTA: Le antenne raccolte possono essere conservate in congelatore a -80 °C o utilizzate immediatamente.

2. O Clonazione da antenne di Ae. aegypti

  1. Estrarre l'RNA totale dalle antenne utilizzando un kit di RNA totale disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore.
  2. Digerire l'RNA totale utilizzando il kit commerciale privo di DNA per rimuovere la DNasi e altri ioni seguendo il protocollo del produttore.
  3. Sintetizzare il cDNA da 1,5 μg di RNA privo di DNA utilizzando il sistema di sintesi del primo filamento SuperScript IV innescato con Oligo d(T)2013,30.
  4. Progettare primer PCR per i geni OR in base alle sequenze disponibili presso VectorBase (https://www.vectorbase.org/) e ai requisiti speciali del sito di taglio enzimatico. Aggiungere una sequenza di Kozak (GCCACC), che avvia la traduzione nella maggior parte degli organismi eucarioti, tra il sito di taglio e il codone iniziale in ciascun primer in avanti30.
  5. Clonare le sequenze codificanti dei geni OR mediante PCR utilizzando primer specifici per il gene contenenti siti endonucleasi di restrizione e la sequenza Kozak seguendo il protocollo del produttore.
  6. Rileva i prodotti PCR attraverso un gel di agarosio all'1% e purifica utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale seguendo il protocollo del produttore.
  7. Eseguire la costruzione di plasmidi ricombinanti attraverso il clonaggio di prodotti PCR in un vettore pT7Ts dopo la digestione mediante enzimi di restrizione seguendo il protocollo del produttore.
  8. Verificare i plasmidi ricombinanti mediante sequenziamento Sanger e confermare utilizzando il database VectorBase.

3. Sintesi del cRNA

  1. Linearizzare i plasmidi costruiti con enzimi di restrizione specifici.
    NOTA: Il DNA plasmidico deve essere linearizzato con un enzima di restrizione a valle del gene da trascrivere.
  2. Utilizzare i plasmidi linearizzati per sintetizzare cRNA con un kit T7 commerciale seguendo una precedente descrizione13,30.
  3. Premiscelare il cRNA di OR e Orco (1:1) in una provetta da centrifuga e aliquotare il cRNA miscelato in un volume di 2 μL (250 ng/μL/ciascuno) per ciascuna provetta PCR. Conservare il cRNA aliquotato a -80 °C prima dell'uso.

4. Collezione di ovociti di Xenopus

NOTA: La procedura segue le istruzioni di Schneider et al.38.

  1. Anestetizzare Xenopus laevis per 20-30 minuti in 1 L di acqua ultra-purificata con 1 g di sale di etil-m-amminobenzoato metanosolfonato (Figura 1A). Pizzicare una delle dita della rana usando le dita; Se non c'è risposta, la rana è sufficientemente anestetizzata e pronta per l'intervento chirurgico. Trasferire la rana anestetizzata sul letto di ghiaccio.
  2. L'intervento chirurgico
    1. Strofinare l'area ventrale della rana con una soluzione di iodio povidone al 10% e pulire la soluzione con batuffoli di cotone puliti. Ripeti questo passaggio 2 volte.
    2. Praticare una piccola incisione addominale (10-15 mm, Figura 1B) con un bisturi monouso. Penetrare separatamente nella pelle, nella fascia-strato muscolare. L'incisione si trova nella parte inferiore dell'addome, lateralmente alla linea mediana.
      NOTA: Non ferire gli organi interni.
    3. Afferrare parti dei lobi ovarici con una pinza e tirare delicatamente verso l'esterno. Solleva l'ovaia e tagliala a livello della parete del corpo con le forbici. Ripetere più volte fino ad ottenere abbastanza materiale ovarico (~200 ovuli, Figura 1C). Trasferire il materiale ovarico nel tampone di lavaggio (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM HEPES sale sodico, 10 μg/mL gentamicina, pH 7,6).
    4. Chiudere le ferite chirurgiche (sia muscolari che cutanee) con punti di sutura riassorbibili che in genere si degradano e cadono naturalmente in 10-14 giorni.
    5. Dopo ogni intervento chirurgico, metti la rana in 1 litro di soluzione di recupero (contenente 3,4 g di sale per conserve e sottaceti e 2 g di sale marino istantaneo dell'oceano) fino a quando non si sveglia e poi rimettila alla struttura della rana.
      NOTA: Su ogni rana possono essere eseguiti fino a 4 interventi chirurgici. L'intervallo di funzionamento di ciascuna rana dovrebbe essere superiore a 2 mesi.
  3. Digestione enzimatica defollicolata e coltura degli ovociti
    1. Separare gli ovociti (~200 ovuli, Figura 1C) in piccoli pezzi.
    2. Trasferire tutti gli ovociti in una soluzione digestiva, inclusi 10 mL di tampone di lavaggio (Sezione 4.2.3) e 2 mg/mL di collagenasi B per 40-60 minuti a temperatura ambiente al fine di rimuovere gli strati di cellule follicolari. Esaminare i campioni al microscopio per determinare se l'80% degli ovociti è stato completamente defollicolato; In caso contrario, controlla ogni 10 minuti fino a quando la maggior parte degli ovociti non è pronta.
    3. Sciacquare gli ovociti con 1 soluzione di Ringer (96 mM di NaCl, 2 mM di KCl, 5 mM di MgCl2·6H2O, 5 mM di sale sodico HEPES, pH 7,6), tampone di lavaggio (Sezione 4.2.3), soluzione salina di Barth modificata (78 mM di NaCl, 1 mM di KCl, 0,33 mM di Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM di CaCl2·2H2O, 0,82 mM MgSO4·7H2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES sale sodico, 1,8 mM piruvato di sodio, 10 μg/mL gentamicina, 10 μg/mL streptomicina, pH 7,6) in sequenza (5 volte per ogni tampone, utilizzando 10 mL ogni volta). Sciacquare abbondantemente gli ovociti con tamponi per rimuovere gli ovociti immaturi e di scarsa qualità.
    4. Raccogliere gli ovociti allo stadio V-VI secondo la classificazione di Dumont. Trasferire ovociti sani/di buona qualità allo stadio V-VI con una chiara divisione bianco/scuro e nessun danno visivo evidente (Figura 1D) in una piastra di Petri di 100 mm x 15 mm contenente soluzione salina di Barth modificata (Sezione 4.3.3). Scartare gli ovociti di cattiva qualità (Figura 1E). Mantenere gli ovociti digeriti nelle camere di crescita degli insetti a 18 °C per circa 24 ore prima della microiniezione.

5. Microiniezione di cRNA ed espressione dei recettori odorosi (OR) e dei co-recettori OR (Orco) negli ovociti di Xenopus

  1. Inserire una matrice metallica nella piastra di Petri da 100 mm x 15 mm, aggiungendo soluzione salina di Barth modificata (Sezione 4.3.3) fino a quando la matrice non è sommersa. Trasferisci gli ovociti sulla matrice e scarta gli ovociti che non soddisfano le dimensioni. Disporre gli ovociti con i pali vegetali nella parte superiore (Figura 1F).
  2. Estrarre un capillare di vetro nuovo (1,0 mm OD x 0,5 mm ID, lunghezza = 100 mm) per ogni campione utilizzando un estrattore per microtubi (calore = 525, trazione = 50, velocità = 50, tempo = 250) e affilare con una smussatrice per micropipette con un angolo di 25°. Montare il tubo capillare sull'iniettore di nanolitri.
  3. Prima dell'iniezione, rimuovere una provetta di cRNA premiscelati di OR e Orco (Sezione 3.3) dal congelatore e metterla sul ghiaccio fino a completa dissoluzione. Riempire il tubo capillare con la miscela OR/Orco premendo il pulsante di riempimento dell'iniettore di nanolitri.
  4. Iniettare 10 ng (5ng OR + 5ng Orco; ~20 nL) di cRNA premiscelato per ciascun ovocita con un iniettore di nanolitri in una stazione priva di RNAsi. (Figura 1F).
    NOTA: Prima dell'iniezione, premiamo il pulsante EMPTY per scaricare poca miscela per garantire che il tubo capillare non sia ostruito. Attendere circa 5 secondi per far entrare completamente i cRNA nell'ovocita.
  5. Dopo l'iniezione, conservare gli ovociti su una piastra di coltura cellulare sterile a 24 pozzetti con soluzione salina di Barth modificata a 18°C per 3-7 giorni prima della registrazione dell'intera cellula.

6. Registrazione della corrente a cella intera utilizzando un sistema di blocco della tensione a due elettrodi (Figura 2)

  1. Prima della registrazione del voltage-clamp a due elettrodi, sciogliere i singoli composti odorizzanti in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una serie di soluzioni madre (100 μg/μL). Diluire queste soluzioni madre con 1 tampone ND96 (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl,2·2H2O, 2 mM MgCl,2·6H, 2 O,5mM di sale sodico HEPES, pH 7,6) 1000 volte per ottenere un set di soluzioni di lavoro (0,1 μg/μL).
  2. Assicurarsi che tutto ciò che si trova sul tavolo di isolamento dalle vibrazioni TMC, compresi lo schermo metallico, il microscopio, la sorgente luminosa e la pompa di scarico, sia accuratamente collegato a terra per ridurre l'effetto del rumore elettrico esterno sulla registrazione del segnale dell'intera cella.
  3. Preparare i microelettrodi tirando un capillare di vetro (1,20 mm OD x 0,94 mm ID, lunghezza = 750 mm) utilizzando un estrattore per microtubi (calore = 525, trazione = 50, velocità = 50, tempo = 250). Riempire i capillari con 3 M di KCl. Cloridare i fili Ag/AgCl per 2-5 minuti in candeggina al 10% fino a quando non assumono un colore grigio scuro (i fili Ag/AgCl grigio chiaro devono essere clorurati).
  4. Accendere la macchina accendendo la pinza per ovociti e il digitalizzatore Digidata (Figura 3A). Aprire il software (ad esempio, Clampex 10.3) e fare clic sul pulsante Registra . Accendere l'interruttore per il tampone 1x ND96 (Sezione 6.1) e la pompa per il tampone di scarico.
  5. Eseguire un pre-test inserendo i microelettrodi nel tampone di flusso e quindi premendo il pulsante Vm Electrode Test e il pulsante Ve Electrode Test per verificare la resistenza dei microelettrodi. Vm deve essere < 40 mV e Ve deve essere < 40 μA. Spegnere il flusso del tampone 1x ND96 (Sezione 6.1) e la pompa di scarico dopo il pretest.
  6. Posizionare ogni ovocita nella camera di perfusione (Figura 2) riempita con 1 tampone ND96 (Sezione 6.1) e posizionare delicatamente gli ovociti con i poli vegetali rivolti verso l'alto dal bruco di vetro. Inserire lentamente gli elettrodi nell'ovocita (Figura 3B). Regolare il parametro Vm su 0 e quindi il parametro Ve su 0. Cambiare il pulsante Clamp da OFF a FAST. Regolare il pulsante Guadagno su ~ -80 mV.
  7. Controllare il valore di Ve, che dovrebbe essere costante. In caso contrario, c'è una perdita in almeno uno dei due microelettrodi. In tal caso, sostituire i componenti difettosi con nuovi capillari.
  8. Registrare le correnti di cellule intere dagli ovociti iniettati con un morsetto per ovociti a un potenziale di mantenimento di ~-80 mV (Figura 2).
  9. Eseguire l'acquisizione e l'analisi dei dati.
    1. Riprendere il flusso del tampone 1x ND96 (Sezione 6.1) e accendere la pompa di scarico.
    2. Applicazione della soluzione odorizzante tramite il sistema di perfusione: spegnere il tampone 1x ND96 (Sezione 6.1) e far scorrere la soluzione odorizzante per 10 secondi. Quindi registrare il valore di picco. Per ottenere la risposta dell'OR all'odorizzante di prova, sottrarre il valore basale dal valore di picco.
    3. Interrompere il flusso della soluzione odorizzante e passare al tampone 1x ND96 (Sezione 6.1). Lavare l'ovocita utilizzando il tampone fino a quando la traccia di corrente non si riprende dalla precedente stimolazione odorizzante. L'ovocita è quindi pronto per la stimolazione con un'altra soluzione odorizzante. Generalmente, un ovocita può essere utilizzato per rilevare 20-30 stimolazioni chimiche.
      NOTA: Quando si testa la risposta concentrazione-dipendente, la concentrazione più bassa deve sempre essere applicata prima di passare alle concentrazioni più alte.

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Risultati

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Utilizzando la tecnica di registrazione del singolo sensillum (SSR), abbiamo recentemente individuato gli odori umani ritenuti importanti per il comportamento di ricerca dell'ospite di Ae. aegypti 8. Tuttavia, il meccanismo molecolare che guida il processo di rilevamento degli odori umani nel sistema sensoriale periferico di Ae. aegypti rimane sconosciuto. Gli OR svolgono un ruolo importante nel rilevamento dei ligandi odorosi nella maggior parte degli insetti 10,11,12.

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Discussione

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La TEVC è una tecnica classica ampiamente utilizzata per esaminare la funzione dei recettori di membrana. Sebbene sia già stato pubblicato un protocollo dettagliato43 che condivide una notevole somiglianza con la procedura qui presentata, il metodo qui proposto introduce alcune importanti modifiche. Ad esempio, in questo caso, i cRNA di OR e Orco vengono premiscelati e aliquotati in campioni di piccolo volume subito dopo la sintesi e conservati a -80 °C fino all'u...

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Ringraziamenti

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Questo progetto è stato sostenuto da un premio dell'Alabama Agricultural Experiment Station (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 e ALA015-1-16009 a N.L.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiCytoOneCC7682-7524Utilizzata per la coltura di ovociti
Rana artigliata africanaNascoLM00535Utilizzata per raccogliere ovociti di Xenopus
Elettrodo a filo Ag/AgClWarner Instruments64-1282Utilizzato per microelettrodi
Clampex 10.3AxonN.A.Utilizzato per la registrazione del segnale
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.N.A.Utilizzato per l'analisi dei dati
Collagenasi BSigma11088815001Utilizzato per la digestione degli ovociti
Digidata DigitalizerAxon CNSDigidata 1440AUtilizzato per l'acquisizione dati
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Utilizzato per la preparazione di plasmidi
Etil-M-amminobenzoato metanosolfonato saleSigma886-86-2Utilizzato per l'anestetizzazione delle rane
Vetro capillareFHC30-30-1Utilizzato per microiniezione
Capillare in vetroWarner Instruments64-0801Utilizzato per la preparazione di microelettrodi
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Utilizzato per la digestione degli ovociti
Camere di crescita degli insetti CaronProdotti modello 6025Utilizzato per l'incubazione degli ovociti
Leica Microscopio LeicaS6 DUtilizzato per il taglio di antenne per zanzare
Sorgente luminosaSchottA20500Fornitura di sorgenti luminose per l'osservazione
Supporto magneticoNarishigeGJ-1Utilizzato per tenere l'elettrodo di riferimento
MicromanipolatoreLeica115378Utilizzato per piccoli movimenti dell'elettrodo
Estrattore di microtubiSuttermodello P-97Utilizzato per estrarre i capillari
Smussatrice per micropipetteSuttermodello BV-10Utilizzato per affilare i capillari
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Utilizzato per sintetizzare cRNA
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond3-000-204Utilizzato per microiniezione
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050 Utilizzato per sintetizzare cDNA
Microscopio Olympus OlympusSZ61Utilizzato per la microiniezione
One Shot TOP10 Cellule di E. coli chimicamente competentiInvitrogenC404003Utilizzato per la trasformazione
Amplificatore a morsetto per ovocitiWarner Instrumentsmodello OC-725CUtilizzato per la registrazione TEVC
Kit di estrazione rapida del gel QIAquickQiagen28704Utilizzato per il gel Tabella
di isolamento dalle vibrazioni TMCTMC63-500Utilizzato per isolare le vibrazioni dall'apparecchiatura
Kit TURBO senza DNAInvitrogenAM1907Utilizzato per rimuovere la DNasi e altri ioni nell'RNA

Riferimenti

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  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

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