Articolo metodologico

Analisi delle reti linfatiche e sanguigne durante l'obesità

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DOI:

10.3791/61814

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19 novembre 2020

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1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 2Université Côte d'Azur, 3Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 13, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065, 4Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 7, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obesità è un problema di salute pubblica globale in crescita. È stato precedentemente associato a disfunzione linfatica, suggerendo un crosstalk vitale tra il tessuto adiposo e il sistema linfatico. Qui, proponiamo una metodologia accessibile che consente la marcatura distinta del sangue e dei vasi linfatici all'interno del tessuto adiposo sottocutaneo.

Abstract

I vasi riceventi linfatici e i linfonodi sono inevitabilmente incorporati nel tessuto adiposo. Il significato fisiologico di questa osservazione non è ancora stato chiarito. Tuttavia, l'obesità è caratterizzata da una funzione linfatica compromessa e da un aumento della permeabilità dei vasi. Al contrario, la disfunzione linfatica induce obesità nei topi, suggerendo una significativa interazione tra i vasi linfatici e il tessuto adiposo. Pertanto, la comprensione dei fattori che portano alla disfunzione linfatica potrebbe aprire nuove finestre terapeutiche per prevenire l'obesità e le comorbidità associate. Il primo passo di questo processo richiede una visualizzazione precisa e dettagliata della rete linfatica nel tessuto adiposo sano e infiammato. Qui descriviamo un metodo rapido, economico ed efficiente che consente di marcare e analizzare i vasi linfatici e sanguigni. Questo approccio sfrutta la localizzazione dei linfonodi brachiali drenanti della pelle all'interno del tessuto adiposo sottocutaneo. L'arborizzazione linfatica di questo tessuto può essere rivelata iniettando lectine coniugate con fluorocromo per via sottocutanea. Inoltre, l'approccio di marcatura in vivo fornisce un modo per valutare la densità e le funzioni dei vasi linfatici. Accoppiato alla colorazione dei vasi sanguigni, degli adipociti e delle cellule immunitarie, il protocollo consente la mappatura ad alta risoluzione del tessuto adiposo sottocutaneo mediante imaging 3D.

Introduzione

Il sistema circolatorio linfatico svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi tissutale e nell'induzione di risposte immunitarie efficienti. I vasi linfatici corrono paralleli ai vasi sanguigni e trasportano il liquido interstiziale, i metaboliti e le cellule immunitarie al linfonodo drenante locale (LN) e infine verso la circolazione venosa1. Il drenaggio linfatico disfunzionale è stato osservato durante l'infezione, l'infiammazione e le malattie metaboliche 2,3,4,5. La vascolarizzazione linfatica è composta da vasi di piccole dimensioni chiamati capillari linfatici. I capillari linfatici sono formati da un singolo strato di sottili cellule endoteliali linfatiche (LEC) caratterizzate da giunzioni aperte (giunzioni "a bottone") che facilitano l'ingresso nel liquido interstiziale, nei metaboliti e nelle cellule immunitarie, principalmente cellule dendritiche (DC) e cellule T, nel lume capillare linfatico5. I capillari linfatici si fondono in vasi più grandi chiamati vasi riceventi linfatici. I collettori linfatici sono caratterizzati da uno strato di LEC circondato da uno strato muscolare che fornisce un tono contrattile autonomo e mantiene il flusso di liquidi5. Inoltre, i recipienti raccoglitori sono dotati di valvole che assicurano un flusso linfatico unidirezionale.

Le LEC dei collettori e dei capillari esprimono un insieme specifico di marcatori che le distinguono dalle cellule endoteliali del sangue (BEC). Tra questi fattori, Prox1 è un fattore di trascrizione che guida la generazione di LEC ed è altamente espresso nelle LEC mentre è assente nelle BEC. Il coinvolgimento critico di Prox1 nella biologia delle LEC è stato illustrato dalla generazione e dall'analisi di topi carenti di Prox16. I topi eterozigoti Prox1 hanno uno sviluppo vascolare linfatico difettoso caratterizzato da una ridotta densità dei vasi linfatici e da un aumento della permeabilità vascolare6. Le LEC esprimono altamente VEGFR3, Podoplanina e CCL215. Questi marcatori non si trovano sui BEC e consentono di analizzare separatamente la rete dei vasi linfatici e sanguigni. Lyve1 è espresso selettivamente dai capillari linfatici mentre è assente dai vasi riceventi5.

Sono stati descritti tre tipi di tessuto adiposo in base al loro contenuto mitocondriale e al successivo colore. Il tessuto adiposo bruno termogenico ricco di mitocondri svolge un ruolo chiave durante l'esposizione al freddo e si trova nella regione interscapolare nei topi 7,8. Gli adipociti bianchi e beige hanno una densità mitocondriale inferiore e sono principalmente coinvolti nell'immagazzinamento di energia sotto forma di goccioline lipidiche. Gli adipociti bianchi e beige si trovano nei depositi viscerali e sottocutanei9.

Le osservazioni cliniche hanno stabilito un legame tra obesità e disfunzione linfatica10. L'obesità induce cambiamenti morfologici del sistema adiposo, della vascolarizzazione linfatica e porta a un alterato trasporto linfatico11. I dati ottenuti nei modelli preclinici hanno rivelato che la dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) induce un rimodellamento linfatico e i topi obesi hanno linfonodi più piccoli e un minor numero di vasi linfatici12. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari che governano questo fenotipo rimangono da chiarire. Il coinvolgimento delle LEC durante l'obesità è ulteriormente supportato da osservazioni in modelli genetici con alterato sviluppo dei vasi linfatici. Come discusso in precedenza, i topi eterozigoti Prox1 (Prox1+/-) presentano un sistema linfatico mal funzionante e sviluppano in modo coincidente un eccessivo accumulo di tessuto adiposo viscerale rispetto agli animali sufficienti per Prox16. È interessante notare che questo fenotipo del tessuto adiposo viene salvato dal ripristino della funzione linfatica13. Insieme, questi risultati hanno portato alla luce forti interconnessioni tra i vasi linfatici e il tessuto adiposo, che necessitano di ulteriori indagini.

Nel contesto dell'infiammazione, un segno distintivo dell'obesità, l'espressione alterata dei marcatori LEC e BEC compromette l'analisi di queste cellule attraverso la classica colorazione anticorpale14,15. Sono stati sviluppati modelli genetici per marcare specificamente LEC e BEC che consentono di attenuare questo problema 16,17,18,19. Tuttavia, l'uso di linee reporter genetiche richiede più fasi di riproduzione e aumenta considerevolmente la lunghezza e il costo di un progetto. Pertanto, proponiamo di utilizzare iniezioni di lectina coniugata con fluorocromo per studiare il sangue e i sistemi circolatori linfatici nel tessuto adiposo sottocutaneo, un approccio semplice e relativamente non costoso. La lectina coniugata a vari fluorocromi è disponibile in commercio e può essere iniettata per via endovenosa per marcare i vasi sanguigni, o per via sottocutanea per marcare i vasi linfatici drenanti della pelle incorporati nel tessuto adiposo sottocutaneo. Questo approccio si basa sull'uso di coniugati fluorocromo-lectina separati per ogni iniezione e consente la marcatura distinta di ciascun sistema vascolare. Questo metodo è anche compatibile con l'uso di modelli genetici per marcare la rete linfatica o vascolare del sangue. È importante sottolineare che fornisce più letture per analizzare lo stato di salute generale del tessuto adiposo sottocutaneo e delle vascolarizzazione del sangue e dei linfatici che lo perfondono. Questa procedura potrebbe essere facilmente applicata per analizzare le reti vascolari linfatiche e sanguigne durante le malattie acute e croniche della pelle, tra cui la psoriasi e le infezioni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i comitati etici locali.

NOTA: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) e Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory e incrociati per ottenere la linea di topi reporter linfatici inducibili Prox1-cre-ERT2::tdTomato. I topi sono stati reincrociati con lo sfondo C57BL/6 per 10 generazioni. I topi maschi Prox1-cre-ERT2::tdTomato di sei settimane hanno ricevuto una dieta a base di tamoxifene per 3 settimane. Tamoxifene dieta di Envigo Teklad (dieta n. TD.130857; 500 mg/kg). Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi di 12-14 settimane. Questo protocollo è applicabile a topi di qualsiasi età, sesso o ceppo.

1. Preparazione del materiale

  1. Sterilizzare forbici, pinze e perni da dissezione utilizzando etanolo al 70%.
  2. Preparare due siringhe da 1 ml con aghi da 25 a 27 gauge. Per l'iniezione sottocutanea si consiglia di utilizzare una micro-siringa per iniettare 10 μL nel cuscinetto superiore del piede.
  3. In una provetta di plastica da 1,5 mL, preparare 200 μL di lectina coniugata DyLight 488 diluita in PBS sterile a una concentrazione finale di 100 μg/mL.
  4. In un'altra provetta di plastica, 1,5 mL prepara 100 μL di lectina coniugata DyLight 649 diluita in PBS sterile a una concentrazione finale di 100 μg/mL.
  5. Preparare una piastra a 6 pozzetti contenente PBS e tenerla in ghiaccio.
  6. Preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% e saccarosio al 30%.

2. Marcatura del tessuto adiposo sottocutaneo, dei vasi sanguigni e linfatici.

  1. Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano al 5%. Valutare la profondità dell'anestesia pizzicando con decisione la zampa dell'animale per assicurarsi che l'animale non venga danneggiato durante la procedura. L'anestesia deve essere mantenuta fino alla fine delle fasi di iniezione della lectina o fino all'eutanasia.
  2. Iniettare 100 μl di lectina coniugata DyLight 488 per via endovenosa nella vena caudale per marcare il sistema vascolare del sangue. Attendere 15 minuti prima di procedere al prelievo dei tessuti.
  3. Utilizzando una siringa diversa, iniettare 10 μL di lectina coniugata DyLight 649 per via sottocutanea sul cuscinetto superiore del piede dell'animale per marcare i vasi linfatici drenanti. Attendere 15 minuti prima di procedere al prelievo dei tessuti.
  4. Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale o esposizione a CO2 15 minuti dopo l'iniezione.

3. Prelievo di tessuto adiposo sottocutaneo

  1. Appoggia il topo sulla schiena su una tavola di dissezione.
  2. Sterilizzare il pelo del topo utilizzando etanolo al 70%.
  3. Sollevare la pelle del fianco con una pinza e praticare un'incisione trasversale per esporre il cuscinetto adiposo brachiale.
  4. Tirare delicatamente la pelle per dissociarla dal deposito di tessuto adiposo brachiale, rivelando così l'intero tessuto adiposo brachiale sottocutaneo contenente il linfonodo e il vaso collettore linfatico.
  5. Usando pinze e forbici, rimuovere delicatamente i depositi di grasso sottocutaneo e trasferirli in un piatto contenente PBS freddo. Per ottenere i migliori risultati, si consiglia di rimuovere i depositi di grasso in un unico pezzo.
  6. Da qui in poi, proteggi il tessuto dalla luce.

4. Fissazione tissutale

  1. Immergere il tessuto raccolto in una soluzione contenente il 4% di paraformaldeide e il 30% di saccarosio.
  2. Incubare il tessuto in questa soluzione almeno una notte prima di prepararlo per l'imaging.

5. Colorazione e imaging

  1. Per risultati ottimali, eseguire la pulizia dei tessuti e l'acquisizione confocale 3D come descritto da Gilleron e colleghi20. Si consiglia di utilizzare un microscopio a foglio ottico per l'analisi di tessuti di grandi dimensioni. Durante il processo di schiaritura è possibile eseguire ulteriori macchie.
  2. Per ottenere la migliore mappatura dei tessuti, è necessario utilizzare i seguenti anticorpi:
    Per gli adipociti: Perilipina
    Per i macrofagi: colorazione CD68 e CD11b.
    Per le cellule dendritiche: MHC II e CD11b.
    Per le cellule B: colorazione con B220 (CD45R).
    Per le cellule T: colorazione CD3.
    NOTA: Questo metodo è compatibile con l'uso di modelli genetici per marcare le cellule immunitarie.
  3. Per l'analisi del vaso collettore linfatico mediante microscopia intravitale a 2 fotoni, iniettare la lectina per via sottocutanea nel cuscinetto inferiore e visualizzare il vaso collettore linfatico popliteo.

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Risultati

Per eseguire l'analisi topologica del sangue del tessuto adiposo brachiale e delle reti di vasi linfatici, abbiamo iniettato per via sottocutanea la lectina coniugata Alexa Fluor 649 e iniettato per via endovenosa la lectina coniugata Alexa Fluor 488. Il tessuto adiposo brachiale è stato accuratamente asportato, fissato, sottoposto a protocollo di clearing e analizzato mediante colorazione a montatura intera. Una rappresentazione schematica della procedura è inclusa nella Figura 1A. I vasi s...

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Discussione

Questo approccio fornisce una marcatura efficiente e robusta delle vascolarature del sangue e delle vascolarerie linfatiche del tessuto adiposo sottocutaneo. L'analisi separata delle reti endoteliali del sangue e del sistema linfatico potrebbe svelare i meccanismi patologici che interessano uno o entrambi i sistemi circolatori durante l'obesità o altre condizioni patologiche. Questo protocollo mira ad analizzare l'architettura dei sistemi vascolari, la loro interazione con le cellule str...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcuna divulgazione e conflitto di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

SI è sostenuto dall'Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) e dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 e ANR-19-ECVD-0005-01). AG è sostenuta dal governo francese, attraverso i progetti UCAJedi Investments in the Future gestiti dall'Agenzia Nazionale della Ricerca (ANR) con il numero di riferimento ANR-15-IDEX-01. RSC è supportato da FA-2020-01-IBD-1 del Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lectina DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Descritto nel protocollo
Lectina DyLight 488Vector LabsDL-1174Descritto nel protocollo
ParaformaldeideVWR Chemicals9713.1000
SaccarosioEuromedexNumero CAS 57-50-1
Anti-PodoplaninaAngioBio11-033Diluizione : 1/50
Lectina DyLight 594Vector LabsDL-1177Descritto nel protocollo
Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2)Biolegend107618Diluizione : 1/100
Anti-CD11b (Clone M1/70)Biolegend101218Diluizione : 1/100
Anti-CD68 (Clone FA.11)Biolegend137004Diluizione : 1/100
Anti-B220 (Clone RA3-6B2)Biolegend103225Diluizione : 1/100
Anti-Perilipina (Clone PERI 112.17)Progen651156Diluizione : 1/50
Anti-CD3 (Clone 17A2)Biolegend100210Diluizione : 1/100

Riferimenti

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