Questo protocollo descrive un metodo di rivestimento per limitare la crescita delle cellule endoteliali a una regione specifica di una piastra a 6 po porsi per l'applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando il modello di agitatore orbitale.
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Articolo metodologico
Segmentazione della crescita delle cellule endoteliali in piastre a 6 pozzi su uno shaker orbitale per studi meccanobiologici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stress da taglio imposto alla parete arteriosa dal flusso sanguigno influisce sulla morfologia e sulla funzione delle cellule endoteliali. Sollecitazioni di taglio di bassa magnitudine, oscillatorie e multidirezionali sono state tutte postulate per stimolare un fenotipo pro-aterosclerotico nelle cellule endoteliali, mentre si pensa che l'alta magnitudine e il taglio unidirezionale o uniassiale promuovano l'omeostasi endoteliale. Queste ipotesi richiedono ulteriori indagini, ma le tecniche tradizionali in vitro hanno dei limiti e sono particolarmente povere nell'imporre sollecitazioni di taglio multidirezionali sulle cellule.
Un metodo che sta guadagnando sempre più uso è quello di coltura delle cellule endoteliali nelle piastre standard multi-pozzo sulla piattaforma di uno shaker orbitale; in questo metodo semplice, a basso costo, ad alta produttività e cronico, il mezzo vorticoso produce diversi modelli e magnitudini di taglio, incluso il taglio multidirezionale, in diverse parti del pozzo. Tuttavia, ha una limitazione significativa: le cellule in una regione, esposte a un tipo di flusso, possono rilasciare mediatori nel mezzo che influenzano le cellule in altre parti del pozzo, esposte a flussi diversi, distorcendo così la relazione apparente tra flusso e fenotipo.
Qui presentiamo una modifica facile e conveniente del metodo che consente alle cellule di essere esposte solo a specifiche caratteristiche di sollecitazione di taglio. La semina cellulare è limitata a una regione definita del pozzo rivestendo la regione di interesse con fibronectina, seguita da passivazione utilizzando soluzione passivante. Successivamente, le piastre possono essere ruotate sullo shaker, con conseguente esposizione delle cellule a profili di taglio ben definiti come taglio multidirezionale di bassa magnitudine o taglio uniassiale di alta magnitudine, a seconda della loro posizione. Come in precedenza, l'uso di plastware standard per la coltura cellulare consente un'ulteriore analisi diretta delle cellule. La modifica ha già permesso la dimostrazione di mediatori solubili, rilasciati dall'endotelio con caratteristiche di sollecitazione di taglio definite, che colpiscono le cellule situate altrove nel pozzo.
Introduzione
Le risposte delle cellule vascolari al loro ambiente meccanico sono importanti nella normale funzione dei vasi sanguigni e nello sviluppo della malattia1. La meccanobiologia delle cellule endoteliali (EC) che ricorrono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni è stata un particolare obiettivo della ricerca meccanobiologica perché gli EC sperimentano direttamente lo stress da taglio generato dal flusso sanguigno su di essi. Vari cambiamenti fenotipico come risposte infiammatorie, rigidità e morfologia alterate, rilascio di sostanze vasoattive e localizzazione ed espressione delle proteine giunzionali dipendono dall'esposizione della CE all....
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Protocollo
1. Fabbricazione di dispositivi e preparazione di reagenti
- Fabbricazione di moduli in acciaio inossidabile
- Fabbricare il modulo in acciaio inossidabile da un acciaio inossidabile di grado 316 utilizzando una fresatrice CNC secondo il disegno ingegneristico fornito(Figura 1).
- Stampa 3D di uno stampo polidimetilsilossano (PDMS)
- Preparare un modello CAD (Computer Aided Design) 3D dello stampo PDMS utilizzando SolidWorks in base al disegno ingegneristico fornito (Figura 2).
- Esportate il modello CAD in un file STL e importate il file STL in Cura 2.6.2.
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Risultati
L'adesione degli HUVEC alle regioni della piastra del pozzo non rivestita con fibronectina è stata abrogata dalla passivazione Pluronica F-127; la crescita è stata limitata alla regione rivestita con fibronectina anche dopo 72 ore di coltura, con e senza applicazione di sollecitazioni di taglio(figura 4A, figura 4C). Senza la passivazione Pluronica F-127, gli HUCOV attaccati alla superficie senza fibronectina e proliferati ulteri.......
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Discussione
Il metodo del pozzo vorticoso è in grado di generare profili di flusso complessi in un unico pozzo : flusso multidirezionale di bassa magnitudo (LMMF) al centro e flusso uniassiale di alta magnitudine (HMUF) sul bordo del pozzo. Tuttavia, le secrezioni mediate dallo stress da taglio del mediatore solubile saranno mescolate nel mezzo vorticoso e influenzeranno le cellule in tutto il pozzo, mascherando potenzialmente il vero effetto di un particolare profilo di sollecitazione di taglio sulle cellule.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono con gratitudine una borsa di studio del progetto british heart foundation (a PDW), un National Medical Research Council Singapore TAAP e DYNAMO Grant (a XW, NMRC / OFLCG / 004/2018, NMRC / OFLCG / 001 /2017), una borsa di studio per laureati A * STAR (a KTP) e una studentessa del British Heart Foundation Center of Research Excellence (a MA).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolato da cordoni ottenuti da donatori con travaglio non complicato presso l'Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-marcato capra anti-coniglio IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Siero Bovino Albumina | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Fondo Piatto Non Trattato | Forniture di laboratorio scientifico Ltd | ||
| Fibronectina da plasma bovino | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| TNF-A umano ricombinante | Peprotech | 300-01A | |
| Filamento per stampante 3D PLA nero da 2,85 mm RS Pro, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Acciaio inox 316 | Metallo Supermercato | NA | |
| Sylgard184 Kit elastomero siliconico | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Soluzione tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Tecnologia di segnalazione cellulare dell'anticorpo Zonula Occludens-1 (ZO-1) | 13663 | ||
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | ||
| Leica TCS SP5 Microscopio confocale | NA | ||
| Pinze per anelli di sicurezza | Misumi | RTWP32-58 | |
| Anelli di sicurezza/Interno/Tipo C | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker Stampante 2+3D Ultimaker | NA | ||
| strong>Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | Il MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systèmes | NA |
Riferimenti
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.
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Ristampe e permessi
