Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Sommario

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Abstract

I metodi di compensazione dei tessuti idrofobici sono procedure facilmente regolabili, veloci e a basso costo che consentono lo studio di una molecola di interesse in campioni di tessuto inalterati. Le tradizionali procedure di immunolabeling richiedono il taglio del campione in sezioni sottili, il che limita la capacità di etichettare ed esaminare le strutture intatte. Tuttavia, se il tessuto cerebrale può rimanere intatto durante l'elaborazione, le strutture e i circuiti possono rimanere intatti per l'analisi. I metodi di compensazione precedentemente stabiliti richiedono molto tempo per eliminare completamente il tessuto e le sostanze chimiche aggressive possono spesso danneggiare gli anticorpi sensibili. Il metodo iDISCO elimina rapidamente e completamente i tessuti, è compatibile con molti anticorpi e non richiede attrezzature di laboratorio speciali. Questa tecnica è stata inizialmente convalidata per l'uso nel tessuto dei topi, ma l'attuale protocollo adatta questo metodo agli emisferi di controllo e ai cervelli transgenici dei ratti. Oltre a questo, il presente protocollo apporta anche diverse modifiche al protocollo preesistente per fornire immagini più chiare con meno macchie di sfondo. Gli anticorpi per Iba-1 e tirosina idrossilasi sono stati convalidati nel ratto transgenico HIV-1 e nei ratti di controllo F344/N utilizzando l'attuale metodo di compensazione dei tessuti idrofobici. Il cervello è una rete intrecciata, in cui le strutture lavorano insieme più spesso che separatamente l'una dall'altra. Analizzare il cervello come un intero sistema rispetto a una combinazione di singoli pezzi è il più grande vantaggio di questo metodo di compensazione dell'intero cervello.

Introduzione

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l'uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all'indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un'immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine¹

Protocollo

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud.

1. Preparazione della soluzione stock

1. Soluzione 1 (1 L): A 900 mL di H₂O deionizzato aggiungere 100 mL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mL di Triton X-100.
2. Soluzione 2 (1 L): a 900 mL di H₂O deionizzato, aggiungere 100 mL di PBS 10x, 2mL di Tween-20 e 1 mL di soluzione stock di eparina da 10 mg/mL.
3. Soluzione 3 (500 mL): a 400 mL di Soluzione 1, aggiungere 11,5 g di glicina e 100 mL di dimetilsolfossido (DMSO).

Risultati

La completa eliminazione di ampie sezioni di tessuto cerebrale di ratto F344 / N e HIV-1 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo di compensazione del tessuto idrofobico modificato. La Figura 1 mostra una tipica immagine confocale per TH nella regione substantia nigra. La Figura 1A rappresenta una colorazione densa e positiva. Aree dense come queste possono essere analizzate concentrandosi attraverso il piano "Z" per confermare la colorazione positiva e la.......

Discussione

La pulizia dei tessuti offre una soluzione ai limiti del protocollo IHC tradizionale. Un campione trasparente riduce al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce, che fornisce accesso ottico a livello cellulare ai tessuti intatti^18,19. Le tecniche di pulizia dei tessuti trasformano un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione con la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Subunità B della tossina del colera (ricombinante), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Capra anti-coniglio Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Siero di capra	Sigma Life Science	G9023-10mL
Eparina	Acros Organics	41121-0010
Iba1 anticorpo primario	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epossidico	VWR	70730-062
Metanolo	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Macchina per perfusione	VWR	70730-062	mini pompa a flusso variabile
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH anticorpo primario	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500