Method Article

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

DOI:

10.3791/61821

⸱

December 23rd, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi di compensazione dei tessuti idrofobici sono procedure facilmente regolabili, veloci e a basso costo che consentono lo studio di una molecola di interesse in campioni di tessuto inalterati. Le tradizionali procedure di immunolabeling richiedono il taglio del campione in sezioni sottili, il che limita la capacità di etichettare ed esaminare le strutture intatte. Tuttavia, se il tessuto cerebrale può rimanere intatto durante l'elaborazione, le strutture e i circuiti possono rimanere intatti per l'analisi. I metodi di compensazione precedentemente stabiliti richiedono molto tempo per eliminare completamente il tessuto e le sostanze chimiche aggressive possono spesso danneggiare gli anticorpi sensibili. Il metodo iDISCO elimina rapidamente e completamente i tessuti, è compatibile con molti anticorpi e non richiede attrezzature di laboratorio speciali. Questa tecnica è stata inizialmente convalidata per l'uso nel tessuto dei topi, ma l'attuale protocollo adatta questo metodo agli emisferi di controllo e ai cervelli transgenici dei ratti. Oltre a questo, il presente protocollo apporta anche diverse modifiche al protocollo preesistente per fornire immagini più chiare con meno macchie di sfondo. Gli anticorpi per Iba-1 e tirosina idrossilasi sono stati convalidati nel ratto transgenico HIV-1 e nei ratti di controllo F344/N utilizzando l'attuale metodo di compensazione dei tessuti idrofobici. Il cervello è una rete intrecciata, in cui le strutture lavorano insieme più spesso che separatamente l'una dall'altra. Analizzare il cervello come un intero sistema rispetto a una combinazione di singoli pezzi è il più grande vantaggio di questo metodo di compensazione dell'intero cervello.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l'uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all'indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un'immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine1. Tuttavia, le tecniche di idrogel utilizzano sostanze chimiche aggressive che hanno il potenziale di danneggiare i tessuti più fragili e campioni di tessuto più densi potrebbero non essere compatibili con il protocollo idrogel. Alcune tecniche di idrogel possono richiedere attrezzature costose o portare all'espansione dei tessuti. Le tecniche idrofile, come CUBIC, preservano la struttura 3D attraverso la formazione di legami idrogeno all'interno del tessuto2. L'espansione tissutale può verificarsi anche in alcuni protocolli idrofili. La capacità di compensazione delle tecniche idrofile spesso non corrisponde alla capacità che hanno le tecniche idrofobiche, che è importante per i tessuti più densi e più spessi3.

Le tecniche idrofobiche sono solitamente veloci, non richiedono attrezzature speciali e producono un campione facile da maneggiare e conservare. iDISCO è una tecnica idrofoba che elimina il restringimento che può verificarsi in altri protocolli idrofobici. Originariamente, la tecnica di compensazione dei tessuti iDISCO è stata descritta da Renier et al.4 per gli embrioni e gli organi densi e adulti dei topi. Questa tecnica rimuove l'acqua dal tessuto nella fase iniziale di disidratazione, riducendo così la dispersione della luce. Il tessuto viene permeabilizzato durante il pretrattamento per consentire la penetrazione profonda degli anticorpi. I coloranti Alexa Fluor nello spettro rosso lontano sono utilizzati per l'immunolabeling per evitare l'autofluorescenza del tessuto a lunghezze d'onda inferiori5. I tessuti che sono stati sottoposti a protocolli di clearing idrofobico sono in grado di essere maneggiati facilmente e possono essere ripresi più volte grazie alla longevità dei coloranti Alexa Fluor. Se conservati correttamente, i tessuti possono fornire immagini per mesi o un anno dopo l'elaborazione iniziale.

Nel presente protocollo, l'anticorpo tirosina idrossilasi (TH), l'anticorpo Iba1 e la subunità B della tossina del colera (CTB) sono stati utilizzati sia sul cervello di ratto maschile che femminile e transgenico HIV-1 (Tg). Il ratto HIV-1 Tg possiede sette dei nove geni che compongono il genoma virale dell'HIV-1, che porta a un modello non infettivo di esposizione a lungo termine alla proteina HIV-16,7,8. Alterazioni dopaminergiche sono state precedentemente dimostrate nel ratto HIV-1 Tg e l'HIV-1 stesso è una malattia infiammatoria, quindi la scelta degli anticorpi era rilevante per il disegno sperimentale9,10,11,12. CTB è un tracciante che si attacca ai neuroni tramite il legame gangliosidico e può essere utilizzato per tracciare proiezioni afferenti nel cervello. La CTB è stata precedentemente utilizzata per studiare le proiezioni dal nucleo accumbens all'area della substantia nigra, due aree del cervello fortemente coinvolte con le vie dopaminergiche13,14,15.

In questo protocollo, TH servirà come marcatore per la produzione di dopamina e Iba1 segnerà la microglia attivata. L'anticorpo TH utilizzato etichetta selettivamente una singola banda a circa 62 kDa che corrisponde alla tirosina idrossilasi. L'anticorpo Iba1 corrisponde alla sequenza carbossi-terminale Iba1. Entrambi gli anticorpi sono stati allevati nel coniglio ed erano policlonali. La CTB sarà utilizzata per il tracciamento retrogrado dei neuroni dall'area del nucleo accumbens all'area della substantia nigra. L'attuale protocollo offre anche una linea guida per l'adeguamento del protocollo iDISCO originale in due modi distinti: 1) riduzione complessiva della colorazione di fondo modificando i reagenti sierici nelle fasi di blocco e 2) ridimensionamento del tempo di incubazione per essere adatto a campioni di tessuto più grandi. Nel complesso, il presente protocollo fornisce prove continue che le tecniche di clearing idrofobico sono fattibili nei tessuti cerebrali del ratto, non hanno interazioni dannose distinguibili con le proteine virali hiv-1 e sono compatibili con l'anticorpo TH, l'anticorpo Iba1 e il CTB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud.

1. Preparazione della soluzione stock

  1. Soluzione 1 (1 L): A 900 mL di H2O deionizzato aggiungere 100 mL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mL di Triton X-100.
  2. Soluzione 2 (1 L): a 900 mL di H2O deionizzato, aggiungere 100 mL di PBS 10x, 2mL di Tween-20 e 1 mL di soluzione stock di eparina da 10 mg/mL.
  3. Soluzione 3 (500 mL): a 400 mL di Soluzione 1, aggiungere 11,5 g di glicina e 100 mL di dimetilsolfossido (DMSO).
  4. Soluzione 4 (50 mL): a 42 mL di Soluzione 1, aggiungere 3 mL di siero corrispondente e 5 mL di DMSO.
  5. Soluzione anticorpale primaria (50 mL): a 46 mL di Soluzione 2, aggiungere 2,5 mL di DMSO e 1,5 mL di siero corrispondente.
  6. Soluzione anticorpale secondaria (50 mL): a 48,5 mL di Soluzione 2, aggiungere 1,5 mL di siero corrispondente.
    NOTA: per la soluzione 4, la soluzione primaria e la soluzione secondaria, utilizzare un siero corrispondente all'anticorpo secondario (ad es. capra, cavallo, bovino).

2. Preparazione del campione

NOTA: eseguire i passaggi da 2.1 a 2.7 in una cappa aspirante per limitare l'esposizione al PFA.

  1. Anestetizzare profondamente il giovane ratto (3-6 settimane) usando il sevoflurano; procedere a 2.2 quando il ratto non risponde e non risponde al pizzico della dita e della coda.
  2. Posare il ratto in posizione supina e fare un'incisione attraverso la parete addominale usando un paio di forbici dell'iride.
  3. Tagliare attraverso il fondo della gabbia toracica fino alla clavicola su entrambi i lati della gabbia toracica usando le forbici Mayo.
  4. Apporre lo sterno e le costole lontano dal cuore e dai polmoni con un mostato.
  5. Forare il ventricolo sinistro con un ago da 23 G attaccato a una pompa di perfusione e tagliare l'atrio destro con le forbici dell'iride.
  6. Eseguire la perfusione transcardica con circa 75 mL di 100 mM (1x) PBS.
  7. Continuare la perfusione transcardica con circa 100 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% tamponata in 1x PBS.
  8. Rimuovere il cervello dal cranio usando una pinica.
  9. Posizionare il cervello in posizione sagittale e tagliare in 4 sezioni uguali (circa 3 mm di larghezza) usando una lama di rasoio e una matrice cerebrale di ratto.
  10. Fissare ogni sezione in PFA al 4% in 1x PBS in un tubo di plastica sigillato da 5 ml durante la notte a 4 °C su uno shaker.
  11. Continuare a fissare in 4% PFA in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) su uno shaker per 1 ora.
  12. Lavare ogni sezione con 1x PBS a RT per 30 min, 3 volte.

3. Disidratazione e depigmentazione

  1. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.
  2. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.
  3. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.
  4. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.
  5. Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT. Ripetere con più metanolo al 100%, incubando per 1 ora a RT.
  6. Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.
  7. Preparare una soluzione al 66% di diclorometano (DCM)/metanolo al 33%.
  8. Incubare il campione durante la notte nella soluzione DCM/metanolo a RT, con agitazione.
  9. Lavare con metanolo a RT per 30 minuti, 2 volte.
  10. Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.
  11. Candeggina in perossido di idrogeno al 5% refrigerato e appena preparato in metanolo durante la notte a 4 ° C.
  12. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.
  13. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.
  14. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.
  15. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.
  16. Incubare il campione in 1x PBS per 1 ora a RT.
  17. Lavare in soluzione 1 per 1 ora a RT, 2 volte.

4. Etichettatura della subunità B della tossina del colera

  1. Inserire la punta dell'ago di 1 mL di siringa nel sito del nucleo accumbens.
  2. Iniettare lentamente 2,5 μL di 1% di biotina-CTB su 20 s.
  3. Lasciare la punta dell'ago in posizione per 1 minuto e rimuovere lentamente oltre 10 s per evitare perdite.

5. Applicazione di anticorpi

  1. Incubare il campione in Soluzione 3 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.
  2. Incubare il campione in Soluzione 4 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.
  3. Incubare con anticorpo primario per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.
  4. Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio. Conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte.
  5. Incubare con anticorpi secondari per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.
  6. Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio; conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte.
    NOTA: tutti i passaggi dalla versione 5.6 in poi, inclusa la conservazione finale, devono avvenire in condizioni di scarsa illuminazione. Le provette campione possono essere schermate con un foglio di alluminio. Le concentrazioni utilizzate per gli anticorpi in questo protocollo erano: TH a 1:100, Iba1 a 1:200 e l'anticorpo secondario a 1:100. Aggiungere la soluzione aggiuntiva 2 ai passaggi 5.1-5.6 per garantire che i tubi siano completamente riempiti.

6. Pulizia dei tessuti

  1. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.
  2. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.
  3. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.
  4. Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.
  5. Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT.
  6. Incubare in metanolo fresco al 100% durante la notte a RT.
  7. Incubare in 66% DCM/33% metanolo per 3 ore, con agitazione, a temperatura ambiente.
  8. Incubare in etere dibenzyl (DBE) senza agitare. Lasciare il campione in DBE fino a quando non è chiaro e memorizzare in DBE fino all'imaging.

7. Montaggio

  1. Ottieni una camera stampata in 3D in resina Visijet M3 Crystal (modelli disponibili sul sito web idisco.info).
  2. Fissare la camera a un vetrino per microscopio usando una resina epossidica.
  3. Posizionare il campione nello spazio quadrato al centro della camera.
  4. Riempire completamente la camera con DBE.
  5. Posizionare un coverslip di 0,17 mm di spessore sulla camera e applicare pressione fino a quando il coverslip non ha pieno contatto con le pareti della camera.
  6. Sigillare i bordi del coverslip alla camera usando la resina epossidica.
  7. Ruotare la camera per consentire alle bolle d'aria di fuoriuscire dall'ingresso di riempimento.
  8. Riempire la camera con DBE aggiuntivo.
  9. Sigillare l'ingresso di riempimento con resina epossidica e lasciare polimerizzare.
    NOTA: l'eccesso di DBE si riverserà durante il montaggio.

8. Imaging

  1. Utilizzare un sistema di microscopio confocale per eseguire z-scan con ingrandimento 4x (vedere il video 3Dallegato).
  2. Ottenere l'eccitazione fluorescente del campione utilizzando un set laser per emettere a una lunghezza d'onda simile alla lunghezza d'onda specificata dall'anticorpo secondario. L'eccitazione TH è stata ottenuta utilizzando un set laser HeNe per emettere a 632 nm.
  3. Impostare il rilevatore su una lunghezza d'onda vicina all'emissione laser. Per il presente protocollo, il rivelatore per TH è stato impostato a 650 nm.
  4. Aumentare il guadagno del rilevatore fino a quando non c'è un segnale visibile. Il guadagno di 650LP per le immagini è stato impostato su 7,50 B.
  5. Utilizzando l'opzione Scansione nel software di imaging confocale, spostare lo stadio del microscopio fino a quando il campione non viene messo a fuoco.
  6. Naviga intorno al tessuto in tutte le pianure e ottieni immagini singole o immagini z-stack utilizzando il software di imaging confocale.
  7. Una volta completata l'imaging, rimuovere il campione dalla camera. Rimetterlo in un tubo completamente riempito con DBE e conservarlo a RT in un luogo buio, preferibilmente coperto da un foglio di alluminio.
    NOTA: i campioni possono essere rimontati e ripresi finché il segnale di florescenza è ancora forte.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La completa eliminazione di ampie sezioni di tessuto cerebrale di ratto F344 / N e HIV-1 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo di compensazione del tessuto idrofobico modificato. La Figura 1 mostra una tipica immagine confocale per TH nella regione substantia nigra. La Figura 1A rappresenta una colorazione densa e positiva. Aree dense come queste possono essere analizzate concentrandosi attraverso il piano "Z" per confermare la colorazione positiva e la...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pulizia dei tessuti offre una soluzione ai limiti del protocollo IHC tradizionale. Un campione trasparente riduce al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce, che fornisce accesso ottico a livello cellulare ai tessuti intatti18,19. Le tecniche di pulizia dei tessuti trasformano un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione con la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campion...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 e da T32 Training Grant 5T32GM081740

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Subunità B della tossina del colera (ricombinante), Alexa Fluor 488InvitrogenC34775
DBESigma-Aldrich108014-1KG
DCMSigma-Aldrich270997-100mL
DMSOSigma-Aldrich472301-1L
GlycineFisher ChemicalG46-500
Capra anti-coniglio Alexa Fluor Plus 647InvitrogenA32733
Siero di capraSigma Life ScienceG9023-10mL
EparinaAcros Organics41121-0010
Iba1 anticorpo primarioFUJIFILM Wako019-19741
Kwik-sil epossidicoVWR70730-062
MetanoloSigma-Aldrich34860-1l-R
PBSFisher BioreagentsBP2944-100
Macchina per perfusioneVWR70730-062mini pompa a flusso variabile
PFASigma-Aldrich158127-3KG
TH anticorpo primarioMillipore SigmaAB152
TritonX-100Fisher BioreagentsBP151-500
Tween-20Fisher BioreagentsBP337-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404(2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152(2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrophobic Tissue ClearingRat Brain TissueTissue Clearing MethodMethanol DehydrationDCM Methanol SolutionDibenzyl Ether ClearingConfocal Microscopy ImagingAntibody Incubation ProtocolWhole Brain AnalysisCircuit Level Analysis

Related Articles