Questo protocollo descrive la purificazione della tubulina da fonti di piccole/medie dimensioni come cellule coltivate o cervelli di topo singolo, utilizzando cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. La tubulina purificata è arricchita in specifici isotipi o ha specifiche modifiche posttraslazionali e può essere utilizzata in saggi di ricostituzione in vitro per studiare la dinamica e le interazioni dei microtubuli.
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Articolo metodologico
Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un aspetto importante degli studi sul citoscheletro microtubulo è lo studio del comportamento dei microtubuli negli esperimenti di ricostituzione in vitro. Consentono l'analisi delle proprietà intrinseche dei microtubuli, come la dinamica, e delle loro interazioni con le proteine associate ai microtubuli (POP). Il "codice di tubulina" è un concetto emergente che indica diversi isotipi di tubulina e varie modifiche posttraslazionali (PTM) come regolatori di proprietà e funzioni dei microtubuli. Per esplorare i meccanismi molecolari del codice della tubulina, è fondamentale eseguire esperimenti di ricostituzione in vitro utilizzando tubulina purificata con isotipi e PTT specifici.
Ad oggi, questo è stato tecnicamente impegnativo in quanto la tubulina cerebrale, che è ampiamente utilizzata negli esperimenti in vitro, ospita molte PTM e ha una composizione di isotipo definita. Quindi, abbiamo sviluppato questo protocollo per purificare la tubulina da diverse fonti e con diverse composizioni di isotipi e PTM controllate, utilizzando l'approccio classico dei cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Rispetto ai metodi esistenti basati sulla purificazione dell'affinità, questo approccio produce una tubulina pura e competente per la polimerizzazione, poiché la tubulina resistente alla polimerizzazione o alla depolimerizzazione viene scartata durante le successive fasi di purificazione.
Descriviamo la purificazione della tubulina dalle linee cellulari, coltivata in sospensione o come colture aderenti, e da cervelli di topo singolo. Il metodo descrive per la prima volta la generazione di massa cellulare sia in ambienti di sospensione che aderenti, la fase di lisi, seguita dalle successive fasi di purificazione della tubulina da cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione. Il nostro metodo produce tubulina che può essere utilizzata in esperimenti che affrontano l'impatto del codice di tubulina sulle proprietà intrinseche dei microtubuli e sulle interazioni dei microtubuli con le proteine associate.
Introduzione
I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Danno alle cellule la loro forma, costruiscono mandrini meiotici e mitotici per la segregazione cromosomica e fungono da binari per il trasporto intracellulare. Per svolgere queste diverse funzioni, i microtubuli si organizzano in modi diversi. Una delle domande intriganti sul campo è comprendere i meccanismi molecolari che permettono ai microtubuli conservati strutturalmente ed evolutivamente di adattarsi a questa pletora di organizzazioni e funzioni. Un meccanismo potenziale è la diversificazione dei microtubuli, definita dal concetto noto come "codice di tubulina"1
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Protocollo
La cura e l'uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 concessa dall'Autorità Nazionale) nel rispetto delle linee guida internazionali.
1. Preparazione dei reagenti per la purificazione della tubulina
NOTA: Tutti i tamponi utilizzati per la purificazione della tubulina devono contenere sali di potassio e NON sali di sodio30.
- Preparare 1 L di mezzo complet....
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Risultati
L'obiettivo principale di questo metodo è quello di produrre tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità sufficienti per eseguire ripetuti esperimenti in vitro con i componenti purificati. I microtubuli assemblati da questa tubulina possono essere utilizzati in test di ricostituzione basati sulla tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) con microtubuli dinamici o stabili, in esperimenti che testano la dinamica dei microtubuli, le interazioni con MAP o motori molec.......
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Discussione
Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma per generare rapidamente tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità medio-grandi dalle linee cellulari e dal cervello di un singolo topo. Si basa sul protocollo gold-standard di purificazione della tubulina dal cervello bovino utilizzato sul campo permolti anni 16,17. Un vantaggio particolare dell'approccio è l'uso di colture di sospensione delle cellule HeLa S3, che, una volta stabilite, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'ANR-10-IDEX-0001-02, dal LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 e dall'Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ è sostenuta dall'Institut Curie, l'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) assegna l'ANR-12-BSV2-0007 e l'ANR-17-CE13-0021, la sovvenzione Institut National du Cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1 e la Sovvenzione Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) DEQ20170336756. MMM è supportato dalla sovvenzione Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p e dalla sovvenzione francese Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. JAS è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito d....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl2 | Recipienti per colture cellulari Sigma | #M1028 | |
| 1-L | Techne F7610 | Utilizzato per colture spinner. Non mescolare mai le bottiglie vuote dello spinner. Quando i flaconi rotanti sono nell'incubatore per colture cellulari, tenere sempre leggermente aperte le valvole laterali dei flaconi rotanti per facilitare l'equilibrio dei terreni con l'incubatore' . Dopo l'uso, riempire immediatamente le bottiglie di centrifuga con acqua di rubinetto per evitare che le cellule residue si secchino sulle pareti della bottiglia. Lavare le bottiglie con acqua deionizzata, aggiungere circa 200 ml di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. Sotto una cappa di coltura cellulare sterile, rimuovere l'acqua e lasciare asciugare completamente le bottiglie, ancora sotto la cappa, per diverse ore. Non utilizzare mai detersivi per pulire le bottiglie della centrifuga perché eventuali tracce di detersivo possono essere deleterie per le cellule. | |
| da 1,5 e 2 ml | |||
| 14 ml a fondo tondo | |||
| per colture sterili da 15 cm di diametro | |||
| tappo a vite da 15 ml | |||
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoetanolo è tossico e deve essere usato sotto il cofano. |
| fluoruro di 4-(2-amminoetil)-benzensulfonilfluoruro | Sigma | ||
| 40% acrilammide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| Siringhe da 5, 10 e 20 ml Pipette | |||
| sterili da 5 ml, 10 ml, 25 ml Provette | |||
| tappo a vite da 50 ml | |||
| Persolfato di ammonio (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anticorpo anti-alfa-tubulina, 12G10 | Sviluppato da J. Frankel e M. Nelson, ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, sviluppato sotto l'egida del NICHD, e mantenuto dall'Università dell'Iowa | diluizione: 1/500 | |
| Anticorpo anti-tubulina glutamilata, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | diluizione: 1/20.000 |
| Aprotinina | Sigma | ||
| Balance (0,1 - 10 g) | |||
| Beckman Bottiglie in polipropilene da 1 l | Per la raccolta di colture spinner | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuga | Per la raccolta di colture spinner | ||
| Agitatore biologico | Techne MCS-104L | Installato nell'incubatore per colture cellulari (per colture spinner), 25 giri/min per cellule Hela S3 e HEK 293 | |
| Bis N,N'-Metilene-Bis-acrilammide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Frullatore IKA Ultra-Turrax® | Per la lisi del tessuto cerebrale, utilizzare una sonda da 5 mm, con la macchina impostata alla potenza 6 o 7. Frullare il tessuto cerebrale 2-3 volte per 15 secondi con ghiaccio. | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | ||
| Blu di bromofenolo | Sigma | #1.08122 | |
| Carbossipeptidasi A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentrazione: 1.7 U/µ l |
| Cappa | |||
| Incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi; C, 5% CO2 | |||
| dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO può migliorare la permeabilità cellulare e cutanea di altri composti. Evitare il contatto e utilizzare protezioni per la pelle e gli occhi. |
| DMEM medio | Tecnologie per la vita | #41965062 | |
| DTT, DL-Ditiotreitolo | Sigma | ||
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | ||
| Etanolo assoluto | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | ||
| Pressa a celle a pressione francese | Thermo electron corporation | #FA-078A | con una cella #FA-032; per la lisi di grandi quantità di cellule. Impostato su un rapporto medio e una pressione relativa di 1.000 psi (corrispondente a 3.000 psi all'interno della camera di disgregazione). |
| Glicerolo | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glicina | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | ||
| Blocco riscaldante | Stuart | ||
| cellule Hela | ATCC® CCL-2&commercio; | ||
| Cellule Hela S3 | ATCC | ATCC® CCL-2.2 e commercio; | |
| Acido cloridrico (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Microscopio invertito | Con fluorescenza se la trasfezione cellulare deve essere verificata | ||
| Isopropanolo | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| rotore JLA-8.1000 | Per la raccolta di colture di filatura | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH è corrosivo e provoca ustioni; utilizzare protezioni per gli occhi e la pelle. |
| L-glutammina | Tecnologie per la vita | #25030123 | |
| Centrifuga da laboratorio per provette da 50 ml | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptina | Sigma | #L2884 | |
| Azoto liquido | |||
| Micropipette p2.5, p10, p20, p100, p200 e p1000 e puntali | |||
| Micropestelli | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Tessuto cerebrale di topo | La cura e l'uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità Europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 rilasciata dall'Autorità Nazionale) in conformità con le linee guida internazionali. | ||
| Aghi 18G X 1 ½ ” (1,2 X 38 millimetri | Terumo | #18G | |
| Aghi 20G x 1 ½ ” (0,9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| aghi 21G x 4 ¾ ” (0,8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Tecnologie per la vita | #14190169 | |
| Penicillina-Streptomicina | Tecnologie per la vita | #15140130 | |
| pHmetro | |||
| Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) | Sigma | #P7626 | polvere PMSF è pericolosa. Utilizzare una protezione per la pelle e gli occhi durante la preparazione delle soluzioni PMSF. |
| TUBAZIONI | Sigma | ||
| Pipette-boy | |||
| Rotori | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; e apparecchiature per elettroforesi TLA 55 | ||
| SDS-PAGE | Bio-Rad | ||
| SDS, sodio dodecil solfato | VWR | #442444H | Per preparare il tampone Laemmeli |
| SDS, sodio dodecil solfato | Sigma | #L5750 | Per la preparazione dei gel 'TUB' SDS-PAGE Sonicator |
| Branson | #101-148-070 | Utilizzato per la lisi di cellule coltivate come colture aderenti. Utilizzare una sonda di 6,5 mm di diametro, impostare il sonicatore su " Controllo dell'uscita" 1, " Ciclo di lavoro" 10% e tempo a seconda del tipo di cella utilizzata. | |
| Centrifuga da tavolo per provette da 1,5 ml | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiammina | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | ||
| Base Trizma (Tris) | Sigma | ||
| Tripsina | Life Technologies | #15090046 | |
| Rotori per ultracentrifughe | Rotori TLA-55, TLA-100.3 e 70.1 Ti | Impostati a 4 gradi C o 30° C in base alla necessità dell'esperimento | |
| Provette per ultracentrifuga | Beckman | #357448 | per l'utilizzo con rotore TLA-55 |
| Provette per ultracentrifuga | Beckman | #349622 | con rotore TLA-100.3 |
| Beckman | #355631 | per l'utilizzo con rotore 70.1 Ti | |
| Ultracentrifughe | Beckman | Optima L80-XP (o equivalente) e Optima MAX-XP (o equivalente) | Impostato a 4 gradi; C o 30° C in base alla necessità dell'esperimento |
| a vortice | |||
| Bagnomaria dotato di galleggianti o portatubi | Impostato a 30 gradi C |
Riferimenti
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
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Ristampe e permessi
