Articolo metodologico

Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

DOI:

10.3791/61826

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5 novembre 2020

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1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la purificazione della tubulina da fonti di piccole/medie dimensioni come cellule coltivate o cervelli di topo singolo, utilizzando cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. La tubulina purificata è arricchita in specifici isotipi o ha specifiche modifiche posttraslazionali e può essere utilizzata in saggi di ricostituzione in vitro per studiare la dinamica e le interazioni dei microtubuli.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un aspetto importante degli studi sul citoscheletro microtubulo è lo studio del comportamento dei microtubuli negli esperimenti di ricostituzione in vitro. Consentono l'analisi delle proprietà intrinseche dei microtubuli, come la dinamica, e delle loro interazioni con le proteine associate ai microtubuli (POP). Il "codice di tubulina" è un concetto emergente che indica diversi isotipi di tubulina e varie modifiche posttraslazionali (PTM) come regolatori di proprietà e funzioni dei microtubuli. Per esplorare i meccanismi molecolari del codice della tubulina, è fondamentale eseguire esperimenti di ricostituzione in vitro utilizzando tubulina purificata con isotipi e PTT specifici.

Ad oggi, questo è stato tecnicamente impegnativo in quanto la tubulina cerebrale, che è ampiamente utilizzata negli esperimenti in vitro, ospita molte PTM e ha una composizione di isotipo definita. Quindi, abbiamo sviluppato questo protocollo per purificare la tubulina da diverse fonti e con diverse composizioni di isotipi e PTM controllate, utilizzando l'approccio classico dei cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Rispetto ai metodi esistenti basati sulla purificazione dell'affinità, questo approccio produce una tubulina pura e competente per la polimerizzazione, poiché la tubulina resistente alla polimerizzazione o alla depolimerizzazione viene scartata durante le successive fasi di purificazione.

Descriviamo la purificazione della tubulina dalle linee cellulari, coltivata in sospensione o come colture aderenti, e da cervelli di topo singolo. Il metodo descrive per la prima volta la generazione di massa cellulare sia in ambienti di sospensione che aderenti, la fase di lisi, seguita dalle successive fasi di purificazione della tubulina da cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione. Il nostro metodo produce tubulina che può essere utilizzata in esperimenti che affrontano l'impatto del codice di tubulina sulle proprietà intrinseche dei microtubuli e sulle interazioni dei microtubuli con le proteine associate.

Introduzione

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I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Danno alle cellule la loro forma, costruiscono mandrini meiotici e mitotici per la segregazione cromosomica e fungono da binari per il trasporto intracellulare. Per svolgere queste diverse funzioni, i microtubuli si organizzano in modi diversi. Una delle domande intriganti sul campo è comprendere i meccanismi molecolari che permettono ai microtubuli conservati strutturalmente ed evolutivamente di adattarsi a questa pletora di organizzazioni e funzioni. Un meccanismo potenziale è la diversificazione dei microtubuli, definita dal concetto noto come "codice di tubulina"1,2,3. Il codice della tubulina comprende due componenti principali: l'incorporazione differenziale dei prodotti gene α e β-tubulina (isotipi di tubulina) nei microtubuli e le modifiche posttraslazionali della tubulina (PTM).

Dagli anni '70, gli esperimenti di ricostituzione in vitro, combinati con tecniche di microscopia ottica in evoluzione, hanno aperto la strada a importanti scoperte sulle proprietà dei microtubuli: instabilità dinamica4 e tapis roulant5,e i loro altrimeccanismi e funzioni 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Quasi tutti gli esperimenti in vitro eseguiti finora sono stati basati su tubulina purificata dal tessuto cerebrale utilizzando cicli ripetuti di polimerizzazione e depolimerizzazione16,17. Sebbene la purificazione dal tessuto cerebrale conferisa il vantaggio di ottenere tubulina di alta qualità in grandi quantità (di solito quantità di grammi), uno svantaggio importante è l'eterogeneità come tubulina purificata dal tessuto cerebrale è una miscela di diversi isotipi di tubulina ed è arricchita con molte PTT di tubulina. Questa eterogeneità rende impossibile delineare il ruolo di un particolare PTM o isotipo di tubulina nel controllo delle proprietà e delle funzioni dei microtubuli. Pertanto, la produzione di tubulina competente per l'assemblaggio con PTT di tubulina controllata e composizione omogenea dell'isotipo è essenziale per affrontare i meccanismi molecolari del codice della tubulina.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio per purificare la tubulina mediante cromatografia di affinità utilizzando il dominio TOG legante i microtubuli (gene sopraespresso tumorale) del lievito Stu2p18. In questo metodo, la tubulina nei lisati grezzi di cellule o tessuti viene passata attraverso una colonna in cui si lega al dominio TOG immobilizzato dalla matrice, che consente l'analisi dell'intero pool di tubulina di un dato campione, anche molto piccolo. Negli ultimi anni è stato descritto anche un approccio tanto atteso per purificare la tubulina ricombinante. Si basa sul sistema baculovirus, in cui un vettore bi-cistronico contenente geni α- e β-tubulina è espresso nelle cellule degliinsetti 19. Tuttavia, questo metodo è molto ingombrante e dispendioso in termini di tempo ed è quindi utilizzato principalmente per studiare l'impatto delle mutazioni della tubulina20 e degli isotipi di tubulina21,22,23 in vitro.

Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo che utilizza il consolidato e ampiamente utilizzato approccio di polimerizzazione-depolimerizzazione come progetto per generare tubulina con diversi livelli di modifica sia dalle linee cellulari che dal tessuto cerebrale del topo24. In questa procedura, la tubulina viene pedalata tra la forma solubile (dimero di tubulina a 4 °C) e polimerizzata (microtubulo a 30 °C in presenza di guanosina 5'-trifosfato [GTP]). Ogni forma è separata attraverso fasi successive di centrifugazione: i dimeri di tubulina rimarranno nel supernatante dopo uno spin freddo (4 °C), mentre i microtubuli saranno pellettati a 30 °C. Inoltre, una fase di polimerizzazione viene effettuata ad alta concentrazione di piperazina-N,N′-bis(acido 2-etanosolfonico) (PIPES), che consente la rimozione delle proteine associate ai microtubuli dai microtubuli e quindi dalla tubulina infine purificata. La tubulina purificata dalle cellule HeLa S3 coltivate come colture sospese o aderenti è praticamente priva di qualsiasi PTM di tubulina ed è stata utilizzata in recenti esperimenti di ricostituzione in vitro25,26,27,28. Abbiamo ulteriormente adattato il metodo per purificare la tubulina dal cervello di un singolo topo, che può essere utilizzato per un gran numero di modelli di topi con cambiamenti negli isotipi di tubulina e nelle PTT.

Nel protocollo, descriviamo prima la generazione del materiale sorgente (massa cellulare o tessuto cerebrale), la sua lisi (Figura 1A), seguita dai successivi passaggi di polimerizzazione della tubulina e depolimerizzazione per purificare la tubulina (Figura 1B). Descriviamo inoltre il processo di valutazione della purezza(figura 2A,B)e della quantità(figura 3A,B)della tubulina purificata. Il metodo può essere adattato per produrre tubulina arricchita con un PTM selezionato sovraesprimendo un enzima modificante nelle cellule prima della purificazione della tubulina (Figura 4B). In alternativa, gli enzimi che modificano la tubulina possono essere aggiunti alla tubulina durante il processo di purificazione. Infine, possiamo purificare la tubulina priva di isotipi specifici o PTM dal cervello di topi carenti nei corrispondenti enzimi che modificano la tubulina (Figura 4B)29.

Il metodo che descriviamo qui ha due vantaggi principali: (i) consente la produzione di quantità sufficientemente grandi di tubulina in un tempo relativamente breve, e (ii) genera tubulina pura di alta qualità, con una specifica composizione di isotipo di tubulina o PTT. Nel video associato di questo manoscritto, evidenziamo alcuni dei passaggi critici coinvolti in questa procedura.

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Protocollo

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La cura e l'uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 concessa dall'Autorità Nazionale) nel rispetto delle linee guida internazionali.

1. Preparazione dei reagenti per la purificazione della tubulina

NOTA: Tutti i tamponi utilizzati per la purificazione della tubulina devono contenere sali di potassio e NON sali di sodio30.

  1. Preparare 1 L di mezzo completo: il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM), con siero bovino fetale al 10% (FBS, 100 mL), 200 mM L-glutammina (10 mL di 2 M di stock) e 1x penicillina-streptomicina (10 mL di stock 100x). Conservare a 4 °C.
  2. Preparare 10 M di idrossido di potassio (KOH) sciogliendo 140 g di KOH in acqua, regolare il volume finale a 250 mL e conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare 0,5 M di acido tetraacetico etilendiammina (EDTA), pH 8, sciogliendo 36,5 g di EDTA in acqua, regolare il pH a 8,0 usando KOH (altrimenti l'EDTA non si dissolverà) e il volume finale a 250 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare 5 mM di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-EDTA aggiungendo 5 mL di EDTA da 0,5 M a 500 mL di PBS, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
  5. Preparare 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, sciogliendo 75,5 g di TUBI in acqua, regolare a pH 6.8 con KOH (altrimenti PIPES non si dissolverà) e il volume finale a 500 mL, filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C.
  6. Preparare 1 M K-PIPES, pH 6.8, sciogliendo 15,1 g di TUBI in acqua, regolare a pH 6.8 con KOH e il volume finale a 50 mL, filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C.
  7. Preparare 0,5 M di glicole potassio-etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico (K-EGTA, pH 7.7) sciogliendo 47,5 g di EGTA in acqua, regolare a pH 7,7 con KOH e il volume finale a 250 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
  8. Preparare BRB80 (K-PIPES da 80 mM, pH 6.8; 1 mM K-EGTA; 1 mM di cloruro di magnesio [MgCl2]) mescolando 3,2 mL di TUBI da 0,5 M, 40 μL di 0,5 M K-EGTA e 20 μL di 1 M MgCl 2 eregolare il volume finale a 20 mL. Conservare a 4 °C.
  9. Preparare 0,1 M di fluoruro di fenilmetanosulfonil (PMSF) sciogliendo 435 mg di PMSF in isopropanolo per ottenere un volume finale di 25 mL e conservare a -20 °C.
  10. Preparare la miscela di inibitori della proteasi (200x) sciogliendo 10 mg di aprotinina, 10 mg di leupeptina e 10 mg di 4-(2-amminoetil)-benzenesulfonil fluoruro in acqua per ottenere un volume finale di 2,5 mL, fare aliquote di 100 μL e conservare a -20 °C.
  11. Preparare il 10% di Tritone X-100 mescolando 5 mL di Triton X-100 in 45 mL di acqua, sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
  12. Preparare il tampone di lisi (BRB80 integrato con 1 mM 2-mercaptoetanolo, 1 mM PMSF, 1 miscela di inibitori della proteasi e, facoltativamente, per le cellule HEK-293, 0,2% Tritone X-100) il giorno della purificazione della tubulina mescolando 20 mL di BRB80 con 1,5 μL di 2-mercaptoetanolo, 200 μL di 0,1 M PMSF, 100 μL della miscela di inibitori della proteasi e, facoltativamente, per le cellule HEK-293 , 400 μL del 10% Tritone X-100.
    NOTA: Il 2-mercaptoetanolo è tossico e deve essere utilizzato nella cappa dei fumi.
  13. Preparare 0,2 M GTP sciogliendo 1 g di GTP in 9,5 mL di acqua, regolare il pH a 7,5 usando KOH, fare aliquote di 20 μL e conservare a -20 °C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
  14. Preparare 1 M tris (idrossimetil) aminometano-cloridrato (Tris-HCl) sciogliendo 60,56 g di Tris in acqua, regolare a pH 6,8 con HCl, completo di un volume finale di 500 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
  15. Preparare 5x tampone campione di Laemmli (450 mM ditiotrimetolo (DTT); 10% dodecilsolfato di sodio (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glicerolo; ~0,006% blu bromofenolo) aggiungendo 4 g di SDS a 16 mL di Tris-HCl preriscaldato, pH 6,8 e mescolare delicatamente la soluzione. Aggiungere 2,6 g di DTT e 20 mL di glicerolo al 100% alla miscela e mescolare fino a quando la soluzione diventa omogenea. Aggiungere la quantità desiderata di blu bromofenolo (2,5 mg) per raggiungere l'intensità di colore richiesta. Fare aliquote da 5 mL e conservare a -20 °C. Preparare la soluzione di lavoro 2x del tampone campione Laemmli diluire lo stock 5x in acqua distillata.

2. Fonti di amplificazione e raccolta della tubulina

NOTA: In questo protocollo sono state utilizzate tre fonti di tubulina: (i) cellule (HeLa S3 e HEK-293) coltivate come colture di sospensione; (ii) cellule coltivate come colture aderenti (HEK-293, HeLa e U2 OS); e (iii) tessuto cerebrale del topo. Questo protocollo considera il giorno della purificazione della tubulina come "giorno 0" e, di conseguenza, sono stati descritti altri passaggi relativi al giorno 0.

  1. Amplificazione delle cellule
    1. Cellule coltivate come colture di sospensione
      NOTA: Per purificare con successo la tubulina dalle colture di sospensione, utilizzare almeno 2 L di coltura delle sospensioni.
      1. Per 2 L di coltura di sospensione, ravvivare e far crescere il tipo di cella preferito per ottenere 6 × 107 cellule 10 giorni prima del giorno di preparazione. Il giorno -10, celle di piastra su sei piatti di 15 cm di diametro a 107 celle per piatto.
      2. Il giorno -8, preriscaldare la quantità richiesta di mezzo completo a 37 °C. Aggiungere 1 L di mezzo preriscaldato a ogni bottiglia di filatore in condizioni sterili. Posizionare i filatori su un tavolo agitatore fissato a 20-25 giri/min all'interno dell'incubatore di coltura cellulare, aprire leggermente i tappi dello spinner laterale per consentire al mezzo di equilibrare nell'atmosfera dell'incubatore.
        NOTA: Per evitare qualsiasi contaminazione, pulire accuratamente la superficie esterna del supporto e delle bottiglie di filatore utilizzando il 70% di etanolo.
      3. Il giorno -7, tripinare e raccogliere le cellule coltivate fino all'80-90% di confluenza (circa 1,8 × 108 cellule). Raccogliere celle da 3 piatti alla volta, girare verso il basso (200 × g, 5 minuti, temperatura ambiente) e sospendere di nuovo tutte le celle in 10 mL di DMEM.
        NOTA: Una dissociazione approfondita delle cellule a questo punto è molto importante per evitare la formazione di aggregati più grandi nelle bottiglie spinner, che influisce sulla sopravvivenza cellulare e si traduce in una bassa resa di tubulina.
      4. Aggiungere 5 ml della sospensione cellulare a ogni bottiglia di filatore contenente 1 L di DMEM, restituire i filatori al tavolo dell'agitatore nell'incubatore di coltura cellulare e consentire alle cellule di crescere per una settimana.
    2. Cellule coltivate come colture aderenti
      NOTA: Per purificare con successo la tubulina dalle cellule aderenti, utilizzare un minimo di 10 piatti di confluenza dell'80-90%.
      1. Ravvivare e amplificare il tipo di cella desiderato per ottenere 1 × 108 celle tre giorni prima del giorno della preparazione della tubulina.
      2. Il giorno -3, placcare queste cellule su dieci piatti da 15 cm a 1 × 107cellule per piatto e consentire loro di coltivare l'80-90% di confluenza.
      3. Il giorno -1, se necessario, trans infettare le cellule con un plasmide per esprimere un enzima che modifica la tubulina o un particolare isotipo di tubulina.
  2. Raccolta delle cellule/tessuto cerebrale
    1. Cellule coltivate come colture di sospensione
      1. Trasferire la sospensione cellulare dai filatori in bottiglie di centrifuga da 1 L(Table of Materials)e celle a pellet a 250 × g,15 min, temperatura ambiente. Per iniziare immediatamente un'altra coltura di celle HeLa S3 nelle bottiglie spinner, lasciare 100 ml di sospensione cellulare nei filatori e aggiungere 1 L di DMEM completo e preriscaldato alla bottiglia spinner.
        NOTA: Controllare attentamente la contaminazione batterica prima di procedere per la purificazione della tubulina.
      2. Resuspend celle a pellet da ogni bottiglia di centrifuga in 10 ml di PBS ghiacciato e trasferire tutte le celle in tubi a vite da 50 ml. Durante la sospensione, tenere le cellule sul ghiaccio. Pellettizzare le cellule a 250 × g,15 min, 4 °C.
        NOTA: Seguire le raccomandazioni per la pulizia e lo stoccaggio delle bottiglie di filatore (vedi Tabella dei materiali).
      3. Scartare il supernatante e determinare il volume del pellet cellulare. Da 2 L di coltura di sospensione (due bottiglie spinner), aspettatevi un pellet di cella di 5-6 ml.
        NOTA: Nel protocollo descritto di seguito, si presume che il volume del pellet di cella sia di 10 mL. Regolare l'esperimento in base ai volumi del pellet.
      4. Aggiungere 1 volume (10 mL) di tampone dilisi e sospendere di nuovo il pellet di cella.
        NOTA: Il rapporto tra il volume del pellet cellulare e il volume del tampone di lysis è molto importante per una corretta purificazione della tubulina. L'aggiunta di più tampone di lisi riduce la concentrazione di tubulina, che poi non riesce a raggiungere la concentrazione critica necessaria per la polimerizzazione, riducendo così notevolmente la resa della tubulina.
        NOTA: Le cellule resospendate nel tampone dilisi possono essere congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 °C per due mesi.
    2. Cellule coltivate come colture aderenti
      NOTA: Le cellule provenienti da colture aderenti devono essere raccolte molto rapidamente per una corretta purificazione della tubulina (circa 15 minuti per la raccolta di dieci piatti da 15 cm). Tre persone hanno partecipato a questa fase del protocollo.
      1. Rimuovere il mezzo dai piatti da 15 cm inclinando i piatti, quindi lavare delicatamente le celle con 7 mL di PBS-EDTA a temperatura ambiente (persona 1). Lavorare solo con tre piatti da 15 cm alla volta per evitare di lasciare le cellule senza mezzo o tampone.
      2. Aggiungere 5 mL di PBS-EDTA alle cellule e incubarle per 5 minuti a temperatura ambiente.
      3. Utilizzare un sollevatore di celle per staccare delicatamente le celle spalafilandole su un bordo del piatto (persona 2) e raccogliere tutte le celle in un tubo a vite da 50 ml (persona 3). Risciacquare ogni piatto con altri 2 mL di PBS-EDTA per raccogliere eventuali celle rimanenti dai piatti. Durante questa fase, mantenere il tubo a vite da 50 ml contenente la sospensione cellulare sul ghiaccio.
      4. Pellet le cellule a 250 × g, 10 min, 4 °C. Scartare il supernatante e determinare il volume del pellet cellulare. Aspettatevi un volume di ~ 1 mL da dieci piatti da 15 cm.
        NOTA: Nel protocollo descritto di seguito, si presume che il volume del pellet di cella sia di 10 mL. Regolare gli esperimenti in base ai volumi del pellet.
      5. Rimescolare le celle in 1 volume (10 mL) di tampone di lysis.
        NOTA: Le cellule resospense nel tampone di lysis possono essere conservate a -80 °C per un massimo di due mesi.
    3. Tessuto cerebrale
      NOTA: Possono essere utilizzati topi di qualsiasi età, sesso o background genetico. La scelta del ceppo transgenico di topo dipenderà dalla questione scientifica da affrontare. In questo manoscritto, mostriamo l'esempio della tubulina purificata dal topo ttll1-/-, privo di un importante enzima glutamilante cerebrale, la proteina 1 (TTLL1) simile alla tirosina della tubulina31.
      1. Sacrifica il topo per lussazione cervicale, decapita rapidamente e raccogli il cervello in un tubo a fondo rotondo. Se c'è sangue in eccesso sul cervello, lavare rapidamente con tampone di lysis. Raccogli il cervello non appena il topo viene sacrificato poiché un ritardo post mortem può influenzare il successo della purificazione della tubulina. Utilizzare tubi a fondo tondo per adattarsi alla larghezza della sonda utilizzata per l'omogeneizzazione.
        NOTA: I cervelli di topo raccolti possono essere congelati a scatto in azoto liquido e conservati a -80 °C per un massimo di 3 anni.
      2. Aggiungere 500 μL di tampone di lysis a un singolo cervello estratto da un topo adulto. Per il resto del protocollo, si presume che il volume del buffer di lysis aggiunto sia di 10 mL. Regola per il tuo esperimento in base al numero di cervelli da utilizzare.

3.Lisi delle cellule o del tessuto cerebrale

  1. Cellule coltivate come colture di sospensione
    1. Per HEK-293, liscire le cellule sul ghiaccio tubazionando ripetutamente su e giù utilizzando punte di pipette di diverse larghezze. In primo luogo, attaccare una punta p1000 a una pipetta da 10 mL e pipettare la sospensione della cella su e giù ogni 5 minuti, per 10 minuti (tre cicli di pipettazione). In secondo luogo, fissare una punta p200 a una punta p1000 e un'ulteriore pipetta ogni 5 minuti, per 20 minuti (cinque cicli di pipettazione).
    2. Per HeLa S3, liscivia le celle utilizzando una pressa francese (vedi Tabella dei materiali per le impostazioni).
    3. Prendere 1/100° volume della miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  2. Cellule coltivate come colture aderenti
    1. Trasferire le celle in un tubo di fondo rotondo da 14 ml la cui altezza è stata ridotta per ospitare la sonda sonicatore (per le impostazioni, vedere Tabella dei materiali). Sonicare le cellule per ~45 impulsi e confermare la llisi cellulare campionando una goccia della miscela di lisi al microscopio.
      NOTA: Il numero di impulsi potrebbe variare a seconda del tipo di cella utilizzato per la purificazione della tubulina. Le cellule sonicanti troppo potrebbero far precipitare la tubulina e influenzeranno negativamente la resa di purificazione.
    2. Pipettare le celle su e giù sul ghiaccio ogni 5 minuti per 20 min (cinque cicli di pipettazione), utilizzando una punta p200.
    3. Prendere 1/100° volume di miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  3. Tessuto cerebrale
    1. Liscivia il tessuto cerebrale usando un frullatore di tessuto (vedi Tabella dei materiali per le impostazioni). In alternativa, lisciviare il tessuto utilizzando un pestello a microtubo o un'attrezzatura equivalente e pipettare su e giù sul ghiaccio con una siringa da 1 ml con un ago da 18 G.
    2. Prendere 1/100° volume di miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.

4. Purificazione della tubulina

  1. Chiarimento di Lysate
    1. Sgombrato il lisato (separando il pellet e la frazione solubile della miscela di lisi) mediante centrifugazione a 150.000 × g,4 °C, 30 min. Per informazioni dettagliate sui rotori e sui tubi ultracentrifugo, vedere Table of Materials. Per gli estratti cellulari, uno strato galleggiante bianco si forma spesso dopo la centrifugazione. Non trasferire questo strato galleggiante insieme al supernatante, in quanto interferisce con la polimerizzazione della tubulina. Utilizzare una siringa di volume appropriato attaccata a un lungo ago da 20 G o 21 G per rimuovere delicatamente il supernatante senza disturbare lo strato galleggiante. Se il supernatante è ancora torbido, centrifuga a 5.000 × g, 4 °C per 10 min.
    2. Trasferire il supernatante (SN1) su un tubo ultracentrifugo e annotarne il volume. Per un pellet di celle da 10 mL, aspettatevi un volume di ~ 12 mL per SN1.
    3. Prendere 1/100° volume di SN1 (120 μL per 12 mL di SN1), e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
    4. Resuspend il pellet (P1) in BRB80 (Table of Materials) utilizzando lo stesso volume di SN1. Prendere 1/100° volume di P1 (200 μL per 20 mL di P1), e aggiungere lo stesso volume di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  2. Prima polimerizzazione in tampone a bassa molarità
    1. Preparare la miscela di polimerizzazione combinando 1 volume di SN1 (12 mL), 1/200th volume di 0,2 M GTP (60 μL; concentrazione finale 1 mM) e 0,5 volume di glicerolo preriscaldato (6 ml) in un tubo a vite del volume appropriato.
      NOTA: Il glicerolo è usato come agente di affollamento nelle fasi di polimerizzazione in tutto il protocollo e quindi non è considerato nei calcoli delle concentrazioni di altri componenti.
    2. Pipettare il mix su e giù, evitando delicatamente la formazione di bolle d'aria e trasferirlo agli appropriati tubi ultracentrifugo.
      NOTA: Durante il trasferimento della miscela ai tubi, regolare il peso dei tubi (in coppia). Ciò consente allo sperimentatore di procedere direttamente alla sedimentazione dei microtubuli dopo la fase di polimerizzazione. Eseguire questa procedura per tutte le fasi di polimerizzazione in tutto il protocollo.
    3. Coprire i tubi con parafilm, trasferire in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
    4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g, 30 °C per 30 min. Rimuovere il supernatante (SN2) e mantenere il pellet di microtubuli polimerizzati (P2).
      NOTA: Il pellet di microtubulo può essere congelato a scatto e conservato a -80 °C per un massimo di 1 anno.
    5. Prendere 1/200° volume di SN2 (90 μL per 18 mL SN2) e aggiungere lo stesso volume di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  3. Prima depolimerizzazione
    1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P2, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/60th (200 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/20th (600 μL) del volume dell'SN1.
      NOTA: Il volume di BRB80 ghiacciato aggiunto al pellet durante le fasi di depolimerizzazione è sempre relativo al volume di SN1.
    2. Resuspend il pellet di microtubulo delicatamente, evitando bolle d'aria, fino a quando la soluzione è completamente omogenea. Utilizzare una punta p1000 per un paio di cicli di pipettazione seguiti da una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 minuti (cinque cicli di pipettazione). Si tratta di un passo cruciale per il successo della purificazione della tubulina.
    3. Trasferire la soluzione su tubi ultracentrifugi appropriati e scendere a 150.000 × g, 4 °C per 20 min. Trasferire l'SN3 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet formato dopo questa fase di centrifugazione (P3) contiene proteine precipitate (proteine associate a microtubuli o POP) e microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN3) contiene componenti solubili: dimeri di tubulina depolimerizzata e POP, che si sono staccati dai microtubuli depolimerizzati.
    4. Assumere 1-4 μL di SN3 e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
    5. Risospendare il pellet P3 in BRB80 (nello stesso volume di SN3), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C.
  4. Seconda polimerizzazione (in tampone ad alta molarità)
    1. Preparare la miscela di polimerizzazione combinando 1 volume di SN3 (200 μL), 1 volume di tubi preriscaldati da 1 M (200 μL, concentrazione finale 0,5 M), 1/100° volume di 0,2 M GTP (2 μL, concentrazione finale 1 mM) e 1 volume di glicerolo preriscaldato (200 μL) in un tubo del volume appropriato.
    2. Pipettare il mix su e giù, evitando la formazione di bolle d'aria, e trasferirlo su tubi ultracentrifugo.
    3. Coprire i tubi con parafilm, trasferirli in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
    4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g,30 °C per 30 min. Rimuovere il supernatante (SN4) e mantenere il pellet di microtubuli polimerizzati (P4). Il pellet P4 contiene i microtubuli polimerizzati, e il supernatante SN4 contiene tubulina non polimerizzata, POP e altre proteine solubili.
      NOTA: Il pellet di microtubuli dopo la seconda fase di polimerizzazione può essere congelato a scatto e conservato a -80 °C per un massimo di 1 anno.
    5. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  5. Seconda depolimerizzazione
    1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P4, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/100th (120 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/40th (300 μL) del volume dell'SN1.
    2. Pipetta su e giù con una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 min (cinque cicli di pipettazione).
    3. Trasferire la soluzione su un tubo ultracentrifugo da 1,5 ml e scendere a 150.000 × g, 4 °C per 20 min. Trasferire l'SN5 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet formato dopo questa fase di centrifugazione (P5) contiene microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN5) contiene la tubulina solubile.
    4. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
    5. Risospendare il pellet P5 in BRB80 (stesso volume di SN5), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  6. Terza polimerizzazione (in tampone a bassa molarità)
    1. Preparare la miscela di polimerizzazione: 1 volume di SN5 (120 μL), 1/200° volume di 0,2 M GTP (0,6 μL, la concentrazione finale è di 1 mM) e 0,5 volume di glicerolo preriscaldato (60 μL) in un tubo del volume appropriato.
    2. Pipettare il mix su e giù, evitando delicatamente la formazione di bolle d'aria, e trasferirlo agli appropriati tubi ultracentrifugo.
    3. Coprire i tubi con parafilm, trasferirli in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
    4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g,30 °C per 30 min. Il pellet (P6) contiene microtubuli polimerizzati e il supernatante SN6 contiene piccole quantità di tubulina non polimerizzata.
      NOTA: I pellet di microtubuli possono essere congelati a scatto e conservati a -80 °C per un massimo di 1 anno.
    5. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
  7. Terza depolimerizzazione
    1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P6, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/100th (120 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/40th (300 μL) del volume dell'SN1.
    2. Pipetta su e giù con una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 min (cinque cicli di pipettazione).
    3. Trasferire la soluzione nei tubi ultracentrifugo appropriati e scendere a 150.000 × g,4 °C per 20 min. Trasferire SN7 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet (P7) contiene piccole quantità di microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN7) contiene microtubuli esclusivamente depolimerizzati (tubulina solubile).
    4. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
    5. Risospendare il pellet P7 in BRB80 (stesso volume di SN7), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
    6. Quantificare la quantità di tubulina (vedere Risultati rappresentativi) e aliquota SN7 in piccoli volumi, congelare e conservare a -80 °C.

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Risultati

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L'obiettivo principale di questo metodo è quello di produrre tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità sufficienti per eseguire ripetuti esperimenti in vitro con i componenti purificati. I microtubuli assemblati da questa tubulina possono essere utilizzati in test di ricostituzione basati sulla tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) con microtubuli dinamici o stabili, in esperimenti che testano la dinamica dei microtubuli, le interazioni con MAP o motori molec...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma per generare rapidamente tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità medio-grandi dalle linee cellulari e dal cervello di un singolo topo. Si basa sul protocollo gold-standard di purificazione della tubulina dal cervello bovino utilizzato sul campo permolti anni 16,17. Un vantaggio particolare dell'approccio è l'uso di colture di sospensione delle cellule HeLa S3, che, una volta stabilite, ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dall'ANR-10-IDEX-0001-02, dal LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 e dall'Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ è sostenuta dall'Institut Curie, l'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) assegna l'ANR-12-BSV2-0007 e l'ANR-17-CE13-0021, la sovvenzione Institut National du Cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1 e la Sovvenzione Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) DEQ20170336756. MMM è supportato dalla sovvenzione Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p e dalla sovvenzione francese Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. JAS è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 675737 e della sovvenzione FRM FDT201904008210. SB è stato supportato dalla sovvenzione FRM FDT201805005465.

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Janke, in particolare J. Souphron, nonché G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) e A. Gautreau (Ecole Polytechnique) per l'aiuto durante l'istituzione del protocollo. Vorremmo ringraziare la struttura animale dell'Institut Curie per l'aiuto nell'allevamento e nella cura dei topi.

L'anticorpo 12G10, sviluppato da J. Frankel e M. Nelson, è stato ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppata sotto gli auspici del NICHD e mantenuta dall'Università dell'Iowa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1  M MgCl2 Recipienti per colture cellulari Sigma#M1028
1-LTechne F7610 Utilizzato per colture spinner. Non mescolare mai le bottiglie vuote dello spinner. Quando i flaconi rotanti sono nell'incubatore per colture cellulari, tenere sempre leggermente aperte le valvole laterali dei flaconi rotanti per facilitare l'equilibrio dei terreni con l'incubatore' . Dopo l'uso, riempire immediatamente le bottiglie di centrifuga con acqua di rubinetto per evitare che le cellule residue si secchino sulle pareti della bottiglia. Lavare le bottiglie con acqua deionizzata, aggiungere circa 200 ml di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. Sotto una cappa di coltura cellulare sterile, rimuovere l'acqua e lasciare asciugare completamente le bottiglie, ancora sotto la cappa, per diverse ore. Non utilizzare mai detersivi per pulire le bottiglie della centrifuga perché eventuali tracce di detersivo possono essere deleterie per le cellule.
da 1,5 e 2 ml
14 ml a fondo tondo
per colture sterili da 15 cm di diametro
tappo a vite da 15 ml
2-mercaptoetanoloSigma #M31482-mercaptoetanolo è tossico e deve essere usato sotto il cofano.
fluoruro di 4-(2-amminoetil)-benzensulfonilfluoruro Sigma 
40% acrilammide Bio-Rad #161-0140
Siringhe da 5, 10 e 20 ml Pipette
sterili da 5 ml, 10 ml, 25 ml Provette
tappo a vite da 50 ml
Persolfato di ammonio (APS)Sigma#A3678
Anticorpo anti-alfa-tubulina, 12G10 Sviluppato da J. Frankel e M. Nelson, ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, sviluppato sotto l'egida del NICHD, e mantenuto dall'Università dell'Iowadiluizione: 1/500
Anticorpo anti-tubulina glutamilata, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020diluizione: 1/20.000
Aprotinina Sigma 
Balance (0,1 - 10 g)
Beckman Bottiglie in polipropilene da 1 l Per la raccolta di colture spinner
Beckman Avanti J-26 XP centrifugaPer la raccolta di colture spinner
Agitatore biologico Techne MCS-104L Installato nell'incubatore per colture cellulari (per colture spinner), 25 giri/min per cellule Hela S3 e HEK 293
Bis N,N'-Metilene-Bis-acrilammide Bio-Rad #161-0201
Frullatore IKA Ultra-Turrax®  Per la lisi del tessuto cerebrale, utilizzare una sonda da 5 mm, con la macchina impostata alla potenza 6 o 7. Frullare il tessuto cerebrale 2-3 volte per 15 secondi con ghiaccio.
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma 
Blu di bromofenoloSigma #1.08122
Carbossipeptidasi A (CPA)Sigma#C9268Concentrazione: 1.7  U/µ l
Cappa
Incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi; C, 5% CO2
dimetil solfossido (DMSO)  Sigma #D8418DMSO può migliorare la permeabilità cellulare e cutanea di altri composti. Evitare il contatto e utilizzare protezioni per la pelle e gli occhi.
DMEM medio Tecnologie per la vita #41965062
DTT, DL-Ditiotreitolo Sigma 
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma
Etanolo assolutoFisher Chemical #E/0650DF/15
Siero fetale bovino (FBS)Sigma 
Pressa a celle a pressione francese Thermo electron corporation #FA-078Acon una cella #FA-032; per la lisi di grandi quantità di cellule. Impostato su un rapporto medio e una pressione relativa di 1.000 psi (corrispondente a 3.000 psi all'interno della camera di disgregazione).
Glicerolo VWR Chemicals #24388.295
GlicinaSigma#G8898
GTP Sigma 
Blocco riscaldante Stuart 
cellule Hela ATCC® CCL-2&commercio;
Cellule Hela S3ATCCATCC® CCL-2.2 e commercio;
Acido cloridrico (HCl )VWR#20252.290
Microscopio invertito Con fluorescenza se la trasfezione cellulare deve essere verificata
Isopropanolo VWR#20842.298
jetPEIPolyplus #101
rotore JLA-8.1000Per la raccolta di colture di filatura
KOH Sigma #P1767KOH è corrosivo e provoca ustioni; utilizzare protezioni per gli occhi e la pelle.
L-glutammina Tecnologie per la vita #25030123
Centrifuga da laboratorio per provette da 50 mlSigma4-16 K 
Leupeptina Sigma#L2884
Azoto liquido 
Micropipette p2.5, p10, p20, p100, p200 e p1000 e puntali
MicropestelliEppendorf#0030 120.973
Tessuto cerebrale di topo La cura e l'uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità Europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 rilasciata dall'Autorità Nazionale) in conformità con le linee guida internazionali.
Aghi 18G X 1 ½ ” (1,2 X 38 millimetriTerumo#18G
Aghi 20G x 1 ½ ” (0,9 X 38 mmTerumo#20G
aghi 21G x 4 ¾ ” (0,8 X 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Tecnologie per la vita #14190169
Penicillina-Streptomicina Tecnologie per la vita #15140130
pHmetro
Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)Sigma #P7626polvere PMSF è pericolosa. Utilizzare una protezione per la pelle e gli occhi durante la preparazione delle soluzioni PMSF.
TUBAZIONI Sigma 
Pipette-boy
RotoriBeckman 70.1 Ti; TLA-100.3; e apparecchiature per elettroforesi TLA 55
SDS-PAGE Bio-Rad 
SDS, sodio dodecil solfato VWR#442444HPer preparare il tampone Laemmeli 
SDS, sodio dodecil solfato Sigma #L5750Per la preparazione dei gel 'TUB' SDS-PAGE Sonicator
 Branson#101-148-070Utilizzato per la lisi di cellule coltivate come colture aderenti. Utilizzare una sonda di 6,5 mm di diametro, impostare il sonicatore su " Controllo dell'uscita" 1, " Ciclo di lavoro" 10% e tempo a seconda del tipo di cella utilizzata.
Centrifuga da tavolo per provette da 1,5 mlEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiammina Sigma#9281
Trichostatin A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma 
Base Trizma (Tris)Sigma 
Tripsina Life Technologies#15090046
Rotori per ultracentrifughe Rotori TLA-55, TLA-100.3 e 70.1 TiImpostati a 4 gradi C o 30° C in base alla necessità dell'esperimento 
Provette per ultracentrifuga Beckman#357448 per l'utilizzo con rotore TLA-55
Provette per ultracentrifuga Beckman#349622con rotore TLA-100.3
 Beckman#355631 per l'utilizzo con rotore 70.1 Ti
UltracentrifugheBeckmanOptima L80-XP (o equivalente) e Optima MAX-XP (o equivalente)Impostato a 4 gradi; C o 30° C in base alla necessità dell'esperimento 
a vortice
Bagnomaria dotato di galleggianti o portatubiImpostato a 30 gradi C 
Provette Provette daPiastre Provette con#A8456con#A1153#A7906per colture cellulari#D9779#E3889#F7524#G8877#SBH130Dcorrispondenti#P6757#1658001FC#T9284#T1503 per l'utilizzo con provette per ultracentrifuga Miscelatore

Riferimenti

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