Articolo metodologico

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

DOI:

10.3791/61833

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28 agosto 2021

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1Centre for Research in Nanotechnology and Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

Abstract

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L'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell'ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l'immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l'uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell'esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.

Introduzione

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Durante l'ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l'immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile ne....

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Protocollo

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Questo studio coinvolge campioni di tessuto cerebrale di partecipanti umani, esaminati e approvati da TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato e scritto a partecipare a questo studio.

1 Estrazione di proteine dal tessuto cerebrale

  1. Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) utilizzando una micropipetta.
    NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere il sangue sulla superficie esterna del tessuto e deve essere ripetuto se necessario. Si consiglia di rimuovere il più possibile il sangue dai tessuti in ....

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Risultati

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Abbiamo eseguito la quantificazione relativa di 3 proteine da 10 campioni, 5 campioni da ciascun gruppo di pazienti con anomalie nel cervello. Queste proteine includevano Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) che sono noti per svolgere ruoli diversi nelle cellule cerebrali. L'analisi post-run dei dati è stata eseguita utilizzando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Sono stati monitorati un totale di 10 peptidi corrispondenti a 3 proteine. Questi includevano 3 peptidi per.......

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Discussione

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Tecniche come l'immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l'uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine identifi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori hanno ricevuto il sostegno di Thermofisher per la tassa di pubblicazione.

Ringraziamenti

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Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.

Estendiamo i nostri ringraziamenti speciali al signor Rishabh Yadav per la realizzazione e il montaggio dell'intero video e al signor Nishant Nerurkar per il suo lavoro nel montaggio dell'audio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
Acetonitrile (grado MS)Fisher ScientificA/0620/21
Albumina sierica bovinaHiMediaTC194-25G
Cloruro di calcioFischer ScienificBP510-500
Acido formico (grado MS)Fisher Scientific147930250
IodoacetamideSigma1149-25G
Isopropanolo (grado MS)Fisher ScientificQ13827
Cloruro di magnesioFischer ScienificBP214-500
Metanolo (grado MS)Fisher ScientificA456-4
Acqua di grado MSPierce51140
Tampone fosfato Soluzione salinaHiMediaTL1006-500ML
Cocktail di inibitori della proteasiRoche Diagnostics11873580001
Cloruro di sodioMerckDF6D661300
TCEPSigma646547
Tris BaseMerck648310
Tripsina (grado MS)Pierce90058
UreaMerckMB1D691237
Forniture
Colonna Hypersil Gold C18Thermo25002-102130
MicropipetteGilsonF167380
StagePunte MilliPoreZTC18M008
Perle di zirconia/silice ProdottiBioSpec11079110z
Equipment
Battitore di microsfere (omogeneizzatore)Bertin MinilysP000673-MLYS0-A
Lettore di micropiastre (spettrofotometro)ThermoMultiSkan Go Misuratore
pHEutechCyberScan pH 510
Sonda SonicsMaterials, IncVCX 130
Bagno a secco con agitazioneThermo88880028
Spettrometro di massa TSQ AltisThermoTSQ02-10002
uHPLC - VanquishThermoVQF01-20001
Concentratore sottovuotoThermoSavant ISS 110
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
  2. Carr, S. A., et al.

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