Questo protocollo descrive un sistema di coltura di stampa magnetica tridimensionale (3D) che consente la dissezione del rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT) indotto da un mezzo condizionato da cellule tumorali. L'utilizzo di un sistema di coltura 3D di adipociti UCP1+ che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) consente lo studio degli adipociti beige che contribuiscono al rimodellamento del tessuto adiposo.
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Articolo metodologico
Coltura tridimensionale di adipociti come modello per studiare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco indotto dalla cachessia
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cachessia tumorale (CC) si presenta come una sindrome con molteplici manifestazioni, che causa un marcato squilibrio metabolico multiorgano. Recentemente, è stato proposto che il deperimento cachettico sia stimolato da diversi mediatori infiammatori, che possono interrompere la fisiologia integrativa dei tessuti adiposi e di altri tessuti come il cervello e i muscoli. In questo scenario, il tumore può sopravvivere a spese dell'ospite. In recenti ricerche cliniche, l'intensità dell'esaurimento dei diversi depositi di grasso è stata correlata negativamente con l'esito di sopravvivenza del paziente. Gli studi hanno anche dimostrato che vari disturbi metabolici possono alterare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT), specialmente nelle prime fasi di sviluppo della cachessia. La disfunzione WAT derivante dal rimodellamento tissutale contribuisce alla cachessia complessiva, con le principali modificazioni della WAT che consistono in cambiamenti morfo-funzionali, aumento della lipolisi degli adipociti, accumulo di cellule immunitarie, riduzione dell'adipogenesi, cambiamenti nella popolazione di cellule progenitrici e aumento di "nicchie" contenenti cellule beige/brite.
Per studiare i vari aspetti del rimodellamento WAT indotto dalla cachessia, in particolare i cambiamenti delle cellule progenitrici e il rimodellamento del beige, la coltura bidimensionale (2D) è stata la prima opzione per gli studi in vitro. Tuttavia, questo approccio non riassume adeguatamente la complessità del WAT. Saggi migliorati per la ricostruzione di AT funzionale ex vivo aiutano la comprensione delle interazioni fisiologiche tra le distinte popolazioni cellulari. Questo protocollo descrive un efficiente sistema di coltura tissutale con stampa tridimensionale (3D) basato su nanoparticelle magnetiche. Il protocollo è ottimizzato per lo studio del rimodellamento WAT indotto da fattori indotti dalla cachessia (CIF). I risultati mostrano che una coltura 3D è uno strumento appropriato per studiare la modellazione WAT ex vivo e può essere utile per gli screening funzionali per identificare molecole bioattive per applicazioni di singole popolazioni di cellule adipose e aiutare la scoperta della terapia anticachettica cellulare basata su WAT.
Introduzione
Gli organismi viventi sono composti da cellule in microambienti 3D con interazione cellula-cellula e cellula-matrice ed elaborate dinamiche di trasporto di nutrienti e cellule 1,2. Tuttavia, la maggior parte delle conoscenze fondamentali acquisite in biologia cellulare sono state generate utilizzando la coltura cellulare monostrato (2D). Sebbene la coltura 2D possa rispondere ad alcune delle domande meccanicistiche, questo approccio non riassume adeguatamente l'ambiente naturale in cui risiedono le cellule e può essere incompatibile con la previsione di una risposta farmacologica complessa1. Inoltre, le cellule percepiscono l'ambiente fisico circostante attraverso la meccanotrasduzione. Infatti, le forze meccaniche vengono tradotte in segnali biochimici che alla fine influenzano i modelli di espressione genica e il destino della cellula. Negli ultimi decenni, la coltura tissutale 3D è emersa come un nuovo strumento in vitro in grado di imitare il microambiente in vivo con maggiore fedeltà. Ciò può evitare alcune insidie meccanicistiche generate dagli approcci 2D in vitro3.
La cachessia tumorale (CC) è definita come una sindrome con molteplici manifestazioni, che causa un marcato squilibrio metabolico multiorgano. Durante lo sviluppo della cachessia, la WAT subisce numerosi cambiamenti morfologici con conseguente aumento della lipolisi degli adipociti, accumulo di cellule immunitarie, riduzione dell'adipogenesi, cambiamenti della popolazione di cellule progenitrici e aumento delle "nicchie" contenenti cellule beige/brite (rimodellamento beige)4. Tuttavia, ricapitolare il meccanismo con cui la cachessia influisce sul rimodellamento WAT utilizzando modelli in vitro presenta una sfida tecnica significativa. Infatti, alcuni studi che hanno tentato di indagare la comunicazione tumore/tessuto hanno utilizzato colture cellulari in vitro monostrato (2D), eludendo la complessità del microambiente 3D del WAT.
Sebbene diversi approcci sperimentali generino la coltura 3D, per produrre adiposferoidi si preferiscono tre diversi metodi di assemblaggio: levitazione magnetica o stampa5, goccia sospesa6 e sistemi di scaffold Matrigel7. Nonostante siano appropriati per gli adiposferoidi, questi sistemi presentano vantaggi e svantaggi e dovrebbero essere scelti in base alle caratteristiche di ciascun disegno sperimentale. Sulla base delle limitazioni sopra menzionate, il metodo di stampa magnetica è stato utilizzato per generare colture cellulari 3D5. Questo metodo utilizza un assemblaggio di nanoparticelle magnetiche costituito da nanoparticelle d'oro e ossido di ferro, rendendo il metodo di stampa adatto alla maggior parte dei tipi di cellule. Qui, le colture cellulari 3D sono state utilizzate per indurre l'adipogenesi e i CIF sono stati utilizzati per riprodurre le condizioni ambientali del CC.
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Protocollo
1. Incubazione di cellule 2D con nanoparticelle magnetiche
- Coltiva colture 2D aderenti a ~ 70% di confluenza utilizzando le procedure standard di coltura cellulare.
- Preparare l'assemblaggio di nanoparticelle magnetiche. Toglietelo dal frigorifero e lasciatelo scaldare a temperatura ambiente (20-25 °C) per circa 15 min1.
- Terreno misto: aggiungere le nanoparticelle magnetiche direttamente a 12 mL di terreno in piastre di coltura cellulare da 100 mm. Sospendere e risospendere il mezzo alcune volte per ottenere una distribuzione omogenea delle nanoparticelle.
NOTA: Il mezzo apparirà scuro a causa del colore marrone dell'ossido di ferro. Si raccomanda una concentrazione di 2,5 μL/cm2 dell'area di coltura. - Lavare tre volte la piastra di coltura 2D da 100 mm con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 12 mL del terreno miscelato dal passaggio 1.3 alle piastre per colture cellulari da 100 mm. Incubare le piastre per una notte in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per consentire l'adesione delle nanoparticelle magnetiche alle cellule
2. Creazione di colture 3D con assemblaggio di sferoidi in piastre a 96 pozzetti
- Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule per rimuovere eventuali residui di terreno e nanoparticelle magnetiche non attaccate agitando delicatamente le piastre con 3 x 10 mL di PBS.
- Aspirare il PBS dalla capsula di Petri e staccare le cellule mediante incubazione con una soluzione di acido tripsin-etilendiammina tetraacetico (EDTA) allo 0,25% per 2-5 minuti a 37 °C.
- In attesa che le celle si stacchino, disinfettare le unità magnetiche con etanolo al 70%1.
- Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere un terreno contenente siero a 4 volte il volume della soluzione di tripsina-EDTA per neutralizzare l'effetto della tripsina, quindi trasferire la sospensione in un tubo conico.
- Centrifugare la sospensione, a 500 × g per 10 min. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare il pellet.
NOTA: Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero apparire marroni e le sospensioni cellulari nel terreno dovrebbero apparire più scure del solito. Le cellule dovrebbero apparire cosparse di nanoparticelle1. - Contare le cellule in sospensione e calcolare il volume dei volumi medi necessari per creare colture 3D. Per gli adiposferoidi, utilizzare da 5.000 a 10.000 cellule in 150 μl in piastre a 96 pozzetti.
- Utilizzando un kit di bioprinting a 96 pozzetti, posizionare una piastra a 96 pozzetti repellente per le cellule nella parte superiore dell'unità Spheroid.
- Pipettare 150 μl di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e chiudere la piastra per consentire alle cellule di aggregarsi sul fondo a forma di magnete.
- Lasciare la piastra sull'unità sferoidale nell'incubatrice per 1-2 ore per ottenere uno sferoide competente.
NOTA: Queste colture dovrebbero apparire dense e marroni e dovrebbero essere stampate sulla lastra (Figura S1). La Figura S2 presenta un flusso di lavoro riassuntivo delle fasi principali della stampa magnetica 3D dell'assemblaggio di sferoidi in piastre a 96 pozzetti.
3. Induzione dell'adipogenesi bianca
- Preparare i mezzi di manutenzione e di induzione8; Preparare il mezzo di induzione prima di ogni utilizzo.
- Preparare un terreno di mantenimento contenente 5 μg/mL di insulina (10 mg/mL di riserva conservata a 4 °C per una settimana) e 0,5 μM di rosiglitazone (10 mM di riserva in dimetilsolfossido (DMSO)).
- Preparare un terreno di induzione contenente 125 μM di indometacina da uno stock 0,125 M di etanolo, 2 μg/mL di desametasone da uno stock di 2 mg/mL di etanolo, 0,5 mM di isobutile-1-metilxantina (IBMX) da uno stock 0,25 M di DMSO e 0,5 μM di rosiglitazone da 10 mM di DMSO.
NOTA: Riscaldare l'indometacina a 60 °C per scioglierla.
- Dopo 24-48 ore di stampa degli sferoidi, sostituire il normale supporto completo con il mezzo di induzione (giorno 0).
- Dopo 48 ore (giorno 2), sostituire il mezzo di induzione con il mezzo di mantenimento.
- Cambiare il terreno ogni 3-5 giorni fino a quando le cellule non sono completamente differenziate.
NOTA: Generalmente, dopo 7-8 giorni di stimolazione con il mezzo di induzione, le cellule si differenziano in cellule adipose mature e sono piene di goccioline d'olio che possono essere viste ai bordi degli adiposferoidi.
4. Produzione di terreno condizionato per carcinoma polmonare di Lewis (LLC-CM)
- Cellule di carcinoma polmonare di Lewis (LL/2) in piastre di coltura cellulare da 100 mm in terreno di crescita a una densità di 6000 cellule/cm2.
NOTA: Il terreno di crescita contiene il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U/mL di penicillina-streptomicina. - Dopo 2 giorni, sostituire il terreno in ogni piastra con un terreno di coltura fresco.
NOTA: Le celle LL/2 contengono un mix eterogeneo di cellule aderenti (numero maggiore) e cellule galleggianti. - Dopo 2 giorni (giorno 4), raccogliere il terreno condizionato e ripulirlo da cellule e detriti mediante centrifugazione (500 × g, 10 min).
- Congelare le aliquote del mezzo condizionato in azoto liquido per un uso successivo.
NOTA: Per trattare gli sferoidi con il terreno condizionato, utilizzare una combinazione di terreno di coltura fresco al 75% e terreno condizionato LLC al 25%.
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Risultati
Adiposferoidi da coltura 3D di cellule della frazione vascolare stromale (SVF)
Sia le colture 3D che quelle 2D confluenti sono state impostate con lo stesso numero di cellule SVF provenienti dalla stessa preparazione WAT inguinale di topo (Figura 1A, Figura 1B) e sottoposte allo stesso protocollo sperimentale per confrontare il marcatore di espressione genica. Sferoidi stimolati con mezzo di induzione espanso ...
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Discussione
Questo protocollo mette a punto un sistema di coltura cellulare 3D per studiare la differenziazione degli adipociti in adiposferoidi derivati da cellule SVF primarie da WAT. Rispetto alla tradizionale coltura aderente 2D, questo sistema 3D facilita il rimodellamento AT, che assomiglia molto alle condizioni in vivo. Negli ultimi anni, gli studi hanno dimostrato che la coltura di cellule in 3D produce una morfologia cellulare e una segnalazione distinte rispetto a un sistema di coltura 2D<...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH DK117161, DK117163 a SRF e P30-DK-046200 a Adipose Biology and Nutrient Metabolism Core del Boston Nutrition and Obesity Research Center, e da São Paulo Research Foundation (FAPESP) Grants: 2018/20905-1 e CNPq 311319/2018-1 a MLBJr.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-5879 | Kit |
| bioprinting a 96 pozzetti per colture cellulari, Greiner nero | (Monroe, NC, USA) | 655841 | Coltura cellulare |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Frammento di asino IgG anti-coniglio (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | Colorazione in immunofluorescenza, secondaria, 1:400 in TBS con 0,1% DI MICROPIASTRE PER COLTURE CELLULARI Tween-20 |
| , 96 POZZETTI, PS, FONDO F E MICRO; TRASPARENTE, NERO, CELLSTAR, SUPERFICIE REPELLENTE PER CELLULE, COPERCHIO, STERILE, 8 PZ./BAG | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655976 | Coltura cellulare |
| Desametasone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D-1756 | Coltura cellulare |
| DMEM | Corning (Manassas, VA, USA) | 10-017-CV | Coltura cellulare |
| Siero fetale bovino (Tova) | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 100-500 | Coltura cellulare |
| Indometacina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-7378 | Coltura cellulare |
| Insulina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I0516 | Coltura cellulare |
| LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) | Collezione di colture di tipo americano (Manassas, VA, USA) | CRL-1642 | Linea cellulare di carcinoma polmonare di Lewis |
| NanoShuttle-PL | Greiner (Monroe, NC, USA) | 657843 | Coltura cellulare |
| Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI) | ThermoFisher (Waltham, MA, USA) | R37606 | Colorazione in immunofluorescenza, seguendo le istruzioni del produttore |
| Pen strep | Corning (Manassas, VA, USA) | 30-002-CI | Coltura cellulare |
| Perilipina-1 (D1D8) XP Tecnologia di segnalazione cellulare mAb di coniglio | (Danvers, MA, USA) | 9349 | Colorazione in immunofluorescenza, primaria, 1:1000 in TBS con 0,1% Tween-20 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | R-2408 | Coltura cellulare |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | Corning (Manassas, VA, USA) | 25-052-CI | Coltura cellulare |
| Primer per PCR a trascrizione inversa | |||
| Primer | Forward | Reverse | |
| Adipoq | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| Col4a1 | TCCAAGGGGGAAGTGGGTTT | ACCCTTGCTCGCTTTGACT | |
| em>Ciclofilina a | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4 | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG | TCCAGGCCTTTTCTTTGGCTCA | |
| em>Fn1 | GCTTCCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT< | |
| em>Pgc1a | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG | |
| em>Ucp1 | TCCTAGGGACCATCACCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC | |
| strong>Genotyping del topo | |||
| Primer name | Description | Sequenza | |
| Cre F | Generico Cre forward | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | Cre generico | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT/mG forward | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT/mG wild type reverse | CGA GGA GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT/mG mutante | reverse TCA ATG GGC GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 mutante avanti | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC | |
| WH337 | UCP1 mutante inverso | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | |
| WH338 | UCP1 wild type forward | GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT | |
| WH339 | UCP1 wild type | reverse GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C C |
Riferimenti
- Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Eisenstein, M. Organoids: the body builders. Nature Methods. 15 (1), 19-22 (2018).
- Henriques, F., Júnior, M. L. B. Adipose tissue remodeling during cancer-associated cachexia: Translational features from adipose tissue dysfunction. Immunometabolism. 2 (4), 200032(2020).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Scientific Reports. 5 (1), 13987(2015).
- Akama, T., Leung, B. M., Labuz, J., Takayama, S., Chun, T. H. Designing 3-D adipospheres for quantitative metabolic study. Methods Molecular Biology. 1566, 177-183 (2017).
- Muller, S., et al. Human adipose stromal-vascular fraction self-organizes to form vascularized adipose tissue in 3D cultures. Scientific Reports. 9 (1), 7250(2019).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
- Henriques, F., et al. Toll-like receptor-4 disruption suppresses adipose tissue remodeling and increases survival in cancer cachexia syndrome. Scientific Reports. 8 (1), 18024(2018).
- Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513 (7516), 100-104 (2014).
- Petruzzelli, M., et al. A switch from white to brown fat increases energy expenditure in cancer-associated cachexia. Cell Metabolism. 20 (3), 433-447 (2014).
- Lopes, M. A., Oliveira Franco, F., Henriques, F., Peres, S. B., Batista, M. L. LLC tumor cells-derivated factors reduces adipogenesis in co-culture system. Heliyon. 4 (7), 00708(2018).
- Wang, H., Liu, L., Lin, J. Z., Aprahamian, T. R., Farmer, S. R. Browning of white adipose tissue with roscovitine induces a distinct population of UCP1(+) adipocytes. Cell Metabolism. 24 (6), 835-847 (2016).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biology. 13 (5), 264-269 (2003).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Fisher, M. F., Rao, S. S. Three-dimensional culture models to study drug resistance in breast cancer. Biotechnology Bioengineering. 117 (7), 2262-2278 (2020).
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