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Articolo metodologico
Questo protocollo descrive un sistema di coltura di stampa magnetica tridimensionale (3D) che consente la dissezione del rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT) indotto da un mezzo condizionato da cellule tumorali. L'utilizzo di un sistema di coltura 3D di adipociti UCP1+ che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) consente lo studio degli adipociti beige che contribuiscono al rimodellamento del tessuto adiposo.
La cachessia tumorale (CC) si presenta come una sindrome con molteplici manifestazioni, che causa un marcato squilibrio metabolico multiorgano. Recentemente, è stato proposto che il deperimento cachettico sia stimolato da diversi mediatori infiammatori, che possono interrompere la fisiologia integrativa dei tessuti adiposi e di altri tessuti come il cervello e i muscoli. In questo scenario, il tumore può sopravvivere a spese dell'ospite. In recenti ricerche cliniche, l'intensità dell'esaurimento dei diversi depositi di grasso è stata correlata negativamente con l'esito di sopravvivenza del paziente. Gli studi hanno anche dimostrato che vari disturbi metabolici possono alterare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT), specialmente nelle prime fasi di sviluppo della cachessia. La disfunzione WAT derivante dal rimodellamento tissutale contribuisce alla cachessia complessiva, con le principali modificazioni della WAT che consistono in cambiamenti morfo-funzionali, aumento della lipolisi degli adipociti, accumulo di cellule immunitarie, riduzione dell'adipogenesi, cambiamenti nella popolazione di cellule progenitrici e aumento di "nicchie" contenenti cellule beige/brite.
Per studiare i vari aspetti del rimodellamento WAT indotto dalla cachessia, in particolare i cambiamenti delle cellule progenitrici e il rimodellamento del beige, la coltura bidimensionale (2D) è stata la prima opzione per gli studi in vitro. Tuttavia, questo approccio non riassume adeguatamente la complessità del WAT. Saggi migliorati per la ricostruzione di AT funzionale ex vivo aiutano la comprensione delle interazioni fisiologiche tra le distinte popolazioni cellulari. Questo protocollo descrive un efficiente sistema di coltura tissutale con stampa tridimensionale (3D) basato su nanoparticelle magnetiche. Il protocollo è ottimizzato per lo studio del rimodellamento WAT indotto da fattori indotti dalla cachessia (CIF). I risultati mostrano che una coltura 3D è uno strumento appropriato per studiare la modellazione WAT ex vivo e può essere utile per gli screening funzionali per identificare molecole bioattive per applicazioni di singole popolazioni di cellule adipose e aiutare la scoperta della terapia anticachettica cellulare basata su WAT.
Gli organismi viventi sono composti da cellule in microambienti 3D con interazione cellula-cellula e cellula-matrice ed elaborate dinamiche di trasporto di nutrienti e cellule 1,2. Tuttavia, la maggior parte delle conoscenze fondamentali acquisite in biologia cellulare sono state generate utilizzando la coltura cellulare monostrato (2D). Sebbene la coltura 2D possa rispondere ad alcune delle domande meccanicistiche, questo approccio non riassume adeguatamente l'ambiente naturale in cui risiedono le cellule e può essere incompatibile con la previsione di una risposta farmacolog....
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1. Incubazione di cellule 2D con nanoparticelle magnetiche
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Adiposferoidi da coltura 3D di cellule della frazione vascolare stromale (SVF)
Sia le colture 3D che quelle 2D confluenti sono state impostate con lo stesso numero di cellule SVF provenienti dalla stessa preparazione WAT inguinale di topo (Figura 1A, Figura 1B) e sottoposte allo stesso protocollo sperimentale per confrontare il marcatore di espressione genica. Sferoidi stimolati con mezzo di induzione espanso .......
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Questo protocollo mette a punto un sistema di coltura cellulare 3D per studiare la differenziazione degli adipociti in adiposferoidi derivati da cellule SVF primarie da WAT. Rispetto alla tradizionale coltura aderente 2D, questo sistema 3D facilita il rimodellamento AT, che assomiglia molto alle condizioni in vivo. Negli ultimi anni, gli studi hanno dimostrato che la coltura di cellule in 3D produce una morfologia cellulare e una segnalazione distinte rispetto a un sistema di coltura 2D<.......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH DK117161, DK117163 a SRF e P30-DK-046200 a Adipose Biology and Nutrient Metabolism Core del Boston Nutrition and Obesity Research Center, e da São Paulo Research Foundation (FAPESP) Grants: 2018/20905-1 e CNPq 311319/2018-1 a MLBJr.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-5879 | Kit |
| bioprinting a 96 pozzetti per colture cellulari, Greiner nero | (Monroe, NC, USA) | 655841 | Coltura cellulare |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Frammento di asino IgG anti-coniglio (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | Colorazione in immunofluorescenza, secondaria, 1:400 in TBS con 0,1% DI MICROPIASTRE PER COLTURE CELLULARI Tween-20 |
| , 96 POZZETTI, PS, FONDO F E MICRO; TRASPARENTE, NERO, CELLSTAR, SUPERFICIE REPELLENTE PER CELLULE, COPERCHIO, STERILE, 8 PZ./BAG | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655976 | Coltura cellulare |
| Desametasone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D-1756 | Coltura cellulare |
| DMEM | Corning (Manassas, VA, USA) | 10-017-CV | Coltura cellulare |
| Siero fetale bovino (Tova) | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 100-500 | Coltura cellulare |
| Indometacina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-7378 | Coltura cellulare |
| Insulina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I0516 | Coltura cellulare |
| LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) | Collezione di colture di tipo americano (Manassas, VA, USA) | CRL-1642 | Linea cellulare di carcinoma polmonare di Lewis |
| NanoShuttle-PL | Greiner (Monroe, NC, USA) | 657843 | Coltura cellulare |
| Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI) | ThermoFisher (Waltham, MA, USA) | R37606 | Colorazione in immunofluorescenza, seguendo le istruzioni del produttore |
| Pen strep | Corning (Manassas, VA, USA) | 30-002-CI | Coltura cellulare |
| Perilipina-1 (D1D8) XP Tecnologia di segnalazione cellulare mAb di coniglio | (Danvers, MA, USA) | 9349 | Colorazione in immunofluorescenza, primaria, 1:1000 in TBS con 0,1% Tween-20 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | R-2408 | Coltura cellulare |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | Corning (Manassas, VA, USA) | 25-052-CI | Coltura cellulare |
| Primer per PCR a trascrizione inversa | |||
| Primer | Forward | Reverse | |
| Adipoq | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| Col4a1 | TCCAAGGGGGAAGTGGGTTT | ACCCTTGCTCGCTTTGACT | |
| em>Ciclofilina a | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4 | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG | TCCAGGCCTTTTCTTTGGCTCA | |
| em>Fn1 | GCTTCCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT< | |
| em>Pgc1a | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG | |
| em>Ucp1 | TCCTAGGGACCATCACCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC | |
| strong>Genotyping del topo | |||
| Primer name | Description | Sequenza | |
| Cre F | Generico Cre forward | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | Cre generico | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT/mG forward | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT/mG wild type reverse | CGA GGA GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT/mG mutante | reverse TCA ATG GGC GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 mutante avanti | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC | |
| WH337 | UCP1 mutante inverso | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | |
| WH338 | UCP1 wild type forward | GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT | |
| WH339 | UCP1 wild type | reverse GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C C |
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