Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.
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Articolo metodologico
Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l'aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L'intera procedura può essere completata in 4 giorni.
Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L'assenza di cellule consente l'esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell'ECM associato alla malattia cardiopolmonare.
Introduzione
L'ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l'ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l'ECM del topo, poiché i topi sono l'organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.
Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolar....
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Protocollo
Tutte le procedure qui incluse sono state riviste e approvate dal comitato etico che regola la medicina sperimentale dell'Università di Copenaghen e concordano con la legislazione danese ed europea. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato topi BALB/cJ femmina di 8-12 settimane di età e un topo femmina MMTV-PyMT di 11 settimane di età.
NOTA: evitare la contaminazione batterica dell'impalcatura ECM decellularizzata offre il miglior risultato di imaging e consente la conservazione a lungo termine del campione. È quindi importante mantenere sterili tutti i passaggi. Pertanto, tutti gli strumenti e il materiale chirurgico, tra cui s....
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Risultati
Decellularizzazione cardiopolmonare
Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni, così come il tessuto annesso come l'arco aortico, saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione ematossilina-eosina (Figura 1) degli scaffold ECM che mostrano la rimozione dei nuclei rispetto al tessuto nativo. Queste impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua stru.......
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Discussione
Le tecniche di decellularizzazione basate sull'agitazione tissutale alterano la struttura dell'ECM, rendendole inadatte all'analisi della struttura ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l'aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l'organo. L'uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è segnalat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Prof.ssa Ivana Novak e la Dott.ssa Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Università di Copenaghen) per aver fornito l'accesso al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); una borsa di dottorato della Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); il Consiglio svedese della ricerca (2017-03389; CDM); la Swedish Cancer Society, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; CDM); Aiuto tedesco contro il cancro (Deutsche Krebshilfe; RR); e la Danish Cancer Society (R204-A12454; RR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 sutura, ago a sezione triangolare (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-sutura (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Pinza Adson | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Pinza Adson con denti | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Porta microaghi Castroviejo | Fine Science Tools | n. 12061-01 | |
| CO2 camera di ventilazione per l'eutanasia del topo | |||
| Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Vassoio monouso in polistirene (~30 &volte; 50 cm) | |||
| Microscopio di dissezione (Greenough, con collo d'oca a due bracci) | Leica | S6 D | |
| Microspatola a doppia estremità | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont micropinze (due) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Micropinze Dumont con 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Tagliacapelli | Oster | 76998-320-051 | |
| Porta aghi Halsey (con ganasce in carburo di tungsteno) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Catetere endovenoso calibro 24 (Insyte) | BD | 381512 | |
| Catetere endovenoso calibro 26 (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Forbici Mayo (taglio duro, dritto) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Micropinze con punte ad anello (due) | Aesculap | FM571R | |
| Forbici a micromolla (Vannas, curve) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Aghi (calibro 27; Microlance) | BD | 21018 | |
| Tovagliolo di carta (sterile) o tovagliolo chirurgico | |||
| Forbici seghettate (CeramaCut, dritte) | Spatola Fine Science Tools | 14958-09 | |
| (Freer-Yasargil) | Siringhe Aesculap | OL166R | |
| (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Siringhe (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Forbici tendinee (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 asino anti-cavia IgG Thermo | Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 asino anti-coniglio IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA (albumina frazione bovina V, grado standard, liofilizzato) | Serva | 11930.03 | |
| Anticorpo policlonale al collagene IV (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Ospite: coniglio |
| PBS (pH 7,4, 10&volte;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: |
| anticorpo policlonale periostina di capra (un gentile regalo di Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Ospite: cavia Bisturi | ||
| monouso con lama n.11 (pz. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Siero (siero d'asino normale) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Rivelatori (rivelatori ibridi (Leica, modello HyD S) e tubi fotomoltiplicatori (PMT; ) | Leica | ||
| Sorgente luminosa a fluorescenza | Leica | EL6000 | |
| Microscopio (microscopio multifotone invertito) | Leica | SP5-X MP | |
| Obiettivo (lambda blu, 20×, 0,70 apertura numerica (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Ti– a due fotoni laser allo zaffiro (Spectra-physics, modello Mai Tai DeepSee) | |||
| Laser a luce bianca (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZZAZIONE | |||
| 70% Etanolo (alcol assoluto 99,9%); l'alcol assoluto deve essere regolato al 70% (vol/vol) utilizzando acqua deionizzata. | Prugna | 1680766 | |
| Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Raccordi maschio Luer-to-tubing (1/8 di pollice) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10&, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Pompa peristaltica (con 12 canali) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| (con diametro interno di 2 mm e diametro esterno di 4 mm) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodio Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodio desossicolato (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodio Dodecil Solfato | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E COLORAZIONE | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific 15434389 | ||
| 96% etanolo | prugna | 201446-5L | |
| etanolo assoluto | prugna | 201152-1L | |
| vetrini coprioggetti (24x50mm; 1000 pezzi) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds intermedio (15 x 15 x 5 mm; 100 pezzi) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Criostato | Leica | CM3050S | |
| DPX mezzo di montaggio | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y soluzione alcolica 0,5% | Sigma | 1024390500 | |
| Lama per microtomo Feather acciaio inossidabile,C35 (50 pezzi) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Vetrini Superfrost Plus (25 x 75 mm; 144 pezzi) | Thermofisher | ||
| Mayers ematossilina | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT composto | VWR | 361603E | |
| Scanner per vetrini (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Riferimenti
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extrace....
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Ristampe e permessi
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