Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

Sommario

Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.

Abstract

La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l'equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell'udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L'indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all'orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell'imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l'approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.

Introduzione

La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva¹. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell'orecchio interno, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'idrope dell'orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9.

Protocollo

NOTA: Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oregon Health & Science University (numero di approvazione IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza

1. Anestetizzare i topi donatori (topi maschi C57BL/6J di età ~6 settimane) con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di soluzione anestetica ketamina/xilazina (5 ml/kg, vedere la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Questo protocollo di anestesia è molto affidabile e mantien....

Risultati

Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale (Figura 1), l'osservazione microscopica a fluorescenza intravitale ad alta risoluzione delle cellule del sangue marcate con Dil in vasi marcati con FITC era fattibile attraverso una finestra aperta del vaso. La Figura 2A è un'immagine rappresentativa scattata sotto FIVM che mostra i capillari della parete laterale dell'apice cocleare del topo. La lumina di.......

Discussione

Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l'etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l'imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria va.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,9% cloruro di sodio	Hospira	NDC 0409-1966-02	0,6 mL (per 1 mL)
1,1′-diottadil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato	Sigma Aldrich	468495	20 &; M
3,3′-Dioctadecyloxacarbocianina percloratoDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocianina perclorato	Sigma Aldrich	D4292	20 µ M
CODA Sistema di monitoraggio	Kent scientific		CODA Monitor, per il monitoraggio della pressione sanguigna e del battito cardiaco
Vetrino coprioggetti	Fisher Scientific	12-542A
DC Regolatore di temperatura	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Misura del diametro del vaso
FITC-destrano (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Iniezione di eparina sodica, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 unità USP/mL
Catetesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0,2 mL (per 1 mL)
Obiettivo per microscopio	Mitutoyo	378-823-5	Modello: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Fotocamera	Hamamatsu		Modello: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluito per l'uso)	Lloyd	LPFL04821	0,2 mL (per 1 mL)
Zoom Stereomicroscopio	Olympus		Modello: SZ61, microscopio a fluorescenza