Valutazione della riprogrammazione cardiaca mediante l'analisi di imaging ad alto contenuto

Summary

Presentiamo un protocollo per quantificare le cellule simili ai cardiomiociti indotte (iCM) direttamente riprogrammate in vitro utilizzando l'analisi di imaging ad alto contenuto. Questo metodo ci permette di quantificare l'efficienza della riprogrammazione cardiaca in modo automatizzato e di visualizzare direttamente le iCM.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per quantificare le cellule indotte simili ai cardiomiociti (iCM), che vengono direttamente riprogrammate in vitro mediante una tecnica di riprogrammazione. La riprogrammazione cardiaca fornisce una strategia per generare nuovi cardiomiociti. Introducendo fattori di trascrizione cardiogeni core nei fibroblasti; i fibroblasti possono essere convertiti in iCM senza transizione attraverso lo stato di cellula staminale pluripotente. Tuttavia, il tasso di conversione dei fibroblasti in iCM rimane ancora basso. Di conseguenza, sono stati adottati numerosi approcci aggiuntivi per migliorare l'efficienza della riprogrammazione cardiaca. La maggior parte di questi studi ha valutato l'efficienza della riprogrammazione cardiaca utilizzando la citometria a flusso, mentre allo stesso tempo ha eseguito l'immunocitochimica per visualizzare le iCM. Pertanto, sono necessari almeno due set separati di esperimenti di riprogrammazione per dimostrare il successo della riprogrammazione iCM. Al contrario, l'analisi automatizzata dell'imaging ad alto contenuto fornirà sia la quantificazione che la qualificazione della riprogrammazione iCM con un numero relativamente piccolo di cellule. Con questo metodo, è possibile valutare direttamente la quantità e la qualità degli iCM con un unico esperimento di riprogrammazione. Questo approccio sarà in grado di facilitare futuri studi di riprogrammazione cardiaca che richiedono esperimenti di riprogrammazione su larga scala come lo screening di fattori genetici o farmacologici per migliorare l'efficienza della riprogrammazione. Inoltre, l'applicazione del protocollo di analisi dell'imaging ad alto contenuto non si limita alla riprogrammazione cardiaca. Può essere applicato alla riprogrammazione di altre linee cellulari e a qualsiasi esperimento di immunocolorazione che richieda sia la quantificazione che la visualizzazione di cellule immunocolorate.

Introduction

La riprogrammazione cardiaca è stata sviluppata come approccio alternativo agli approcci mediati dalle cellule staminali per generare nuovi cardiomiociti. Dato che non passa attraverso lo stato di cellula staminale, ha un alto potenziale per aggirare alcune limitazioni ereditarie negli approcci mediati dalle cellule staminali. È stato dimostrato che l'infezione virale di almeno tre o quattro fattori di trascrizione cardiogeni nei fibroblasti può convertire i fibroblasti verso un destino cardiaco eliminando i programmi genici dei fibroblasti e ricostruendo le reti trascrizionali cardiogene nei fibroblasti ^<....

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Vanderbilt University Medical Center.

1. Generazione di retrovirus e riprogrammazione cardiaca in vitro

1. Colture di cellule E di platino in DMEM integrate con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, 1 μg/mL di puromicina e 10 μg/mL di blasticidina fino a quando la confluenza delle cellule E di platino raggiunge il 70%-80%.
2. Il giorno 1, seminare ~0,55 x 10⁶ cellule (primo pozzetto) e ~0,18 x 10⁶ cellule (secondo pozzetto)....

Results

Dopo esperimenti di riprogrammazione, abbiamo quantificato gli iCM utilizzando l'analisi dell'imaging ad alto contenuto come descritto sopra. Nella Figura 1 sono state mostrate le immagini composite di 36 siti di imaging utilizzati per l'analisi di imaging ad alto contenuto. Le iCM sono definite come cellule doppie positive (α-actinina⁺Titina-eGFP⁺) in questi esperimenti. L'analisi dell'imaging ad alto contenuto mostra che ~26% delle cellule presentava entrambi i marcat.......

Discussion

I precedenti studi di riprogrammazione hanno valutato l'efficienza della riprogrammazione utilizzando la citometria a flusso e hanno dimostrato la qualità strutturale delle iCM utilizzando l'immunocitochimica in due esperimenti separati. L'analisi della citometria a flusso richiede un numero molto maggiore di cellule iniziali, aumentando così la scala degli esperimenti. Al contrario, l'analisi dell'imaging ad alto contenuto può valutare sia la qualità che la quantità della riprogrammazio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-pollo Alexa 488	Thermofisher	A11039
anticorpo anti-GFP	Invitrogen	A10262
anti-topo Alexa 555	Thermofisher	A21422
anticorpo anti-alfa-alfa;-actinina	Sigma	A7811
DAPI soluzione	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulina-Transferrina-SelenioG integratore	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM soluzione vitaminica	Invitrogen	11120-052
Software MetaXpress	Dispositivo
Micro XL sistema automatizzato di imaging cellulare	Dispositivo
Soluzione minima di aminoacidi essenziali	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
Filtro PES (0,45 µ m)	Thomas scientific	1159T84
Cellule E platnino	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Tampone bloccante universale	BiogeneX	HK083-50K